基于天然低共熔溶剂的甜叶菊中甜菊糖绿色提取方法及优化

尝试利用天然低共熔溶剂(NADES)提取甜叶菊(Stevia rebaudiana)中的甜菊糖, 探索一种高效、绿色和环保的甜菊糖提取新方法。以甜叶菊干叶为原料, 对照传统提取溶剂水, 以甜菊糖中甜菊苷和莱鲍迪苷A的提取浓度作为指标, 筛选出最优的NADES提取配方, 然后通过Box-Behnken响应面法对NADES提取甜叶菊中甜菊糖的工艺条件进行筛选优化。结果表明, 提取效率最高的NADES配方为1,2-丙二醇:甘油:水=8:1:1 (v/v/v), 提取的甜菊苷浓度为2.59 mg∙mL^-1, 比水提取高16.40%, 提取的莱鲍迪苷A浓度为1.06 mg∙mL^-1, 比水提取高12.62%; 通过响应面法得到最优提取条件: 提取时间90分钟, 提取温度60°C, 超声功率为80 J∙s^-1, 预测甜菊苷提取浓度为3.49 mg∙mL^-1, 莱鲍迪苷A提取浓度为1.43 mg∙mL^-1, 与实验验证值(甜菊苷浓度为3.48 mg∙mL^-1, 莱鲍迪苷A浓度为1.42 mg∙mL^-1)接近。在最优条件下, 甜菊苷提取浓度比初始条件提高了34.36%, 莱鲍迪甘A提取浓度比初始条件提高了33.96%。NADES绿色环保, 且提取效率高于传统溶剂, 可用于甜叶菊中甜菊糖的绿色提取; 同时, 该提取方法可为后续推广至其它大宗经济植物类天然产物的绿色工业生产提供参考。     

禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的研究进展

禽流感病毒在世界范围内广泛流行,给养禽业造成了巨大的经济损失,有效的疫苗接种策略可以帮助预防和控制该疾病.抗原转换和漂移是流感病毒发生变异的两种主要机制.NA蛋白是流感病毒的表面纤突之一属于Ⅱ型糖蛋白,在病毒成熟时发挥神经氨酸酶的作用进而有利于病毒的成熟和释放,并在调控受体结合、病毒出芽等方面发挥着重要的作用.抑制NA蛋白活性具有预防和治疗疾病作用的事实证实NA蛋白是一个抗病毒的有效靶点.此外基于NA蛋白设计流感疫苗,具有免疫保护期更持久和保护范围更广的优势.     

基于13C、15N和C/N识别南岳小流域沉积有机质的来源

农业流域有机质流失造成水体富营养化和土地退化,不仅威胁水质和粮食安全,而且会导致温室气体排放等潜在环境问题。本研究用¹³C、¹⁵N和C/N作为指纹标志物,分析了南岳小流域出口沉积有机质的来源及其在林地、稻田和菜地等典型土地利用类型土壤的空间分布特征,并结合贝叶斯稳定同位素混合模型定量估算了各土地利用类型的贡献率。结果表明: δ¹³C具有显著的空间差异,沉积物有机质(-22.6‰±0.53‰)和林地土壤(-23.13‰±1.71‰)的δ¹³C显著高于稻田土壤(-25.24‰±1.4‰)。各土地利用类型土壤的δ¹⁵N差异不显著,沉积物的均值最大,为(4.37±0.83)‰,林地最小,为(2.38±1.97)‰;林地土壤的C/N均值最大,为16.66±7.18,稻田土壤的C/N均值最小,为11.95±0.92。贝叶斯稳定同位素混合模型结果显示,林地、稻田和菜地对流域出口沉积有机质的贡献率分别为19.6%、15.7%和64.7%;稻田和菜地作为农业用地的总贡献率为80.4%。说明农业用地土壤是南岳小流域沉积有机质的主要来源,可以通过优化农田管理措施有效控制流域养分流失。     

栀子豉汤所含优势益生菌群的研究

目的考察不同煎煮方法及人工胃液、肠液对栀子豉汤所含优势菌群的影响,基于芽胞杆菌的整肠作用探讨栀子豉汤的作用机制。方法采用先煎栀子再煎淡豆豉(方法一)及两药同时煎煮(方法二)得到不同的栀子豉汤溶液,在营养琼脂培养基上培养及菌落计数,通过Biolog自动微生物鉴定系统对分离菌株进行鉴定,并考察人工胃液、肠液对栀子豉汤所含优势菌群数量的影响。结果方法一制备的栀子豉汤所含优势菌数量更多,为(2.55±0.02)×10~5 CFU/mL,以枯草芽胞杆菌为主;栀子豉汤经人工胃液、人工肠液作用后,优势菌又大量繁殖。结论栀子豉汤可能通过其所含益生芽胞杆菌的整肠作用而发挥药效。     

基因修饰人多能干细胞的高效单克隆建系方法

目标:提供一种能够显著提高慢病毒稳定转染人多能干细胞的方法,并建立一种简便无损的转染细胞筛选方法。方法:在慢病毒转染人多能干细胞过程,分别比较添加与不添加Y-27632情况下细胞形态的动态变化规律,以及细胞不同形态下对慢病毒颗粒的摄入能力差异,优化建立高效的慢病毒转染方法。随后,设计并研制可视化的简便显微操作装置,探索在荧光显微镜辅助下挑取转染的阳性单克隆细胞建系的技术,建立较为简便的转染细胞纯化新方法。结果:正常培养的人多能干细胞(hESC、hiPSC),添加Y-27632后6 h集落形态发生明显变化,细胞呈现出明显长梭形,集落松弛,细胞表面积显著增加;去除后6 h集落恢复正常;常规培养的多能干细胞克隆,慢病毒主要倾向于进入集落外围或局部细胞;经Y-27632提前处理6 h,细胞集落松驰、表面积显著增加的多能干细胞,慢病毒能够较为均匀地感染集落外围与内部细胞,显著提高慢病毒转染效率。利用毛细玻璃管,自主设计制作了一款显微镜下可视化的细胞单集落挑选器件,在显微镜辅助下能够简便地进行阳性克隆细胞的挑选建系,从而在常规实验室即可完成,取代具有一定细胞损伤效应的嘌呤霉素筛选及需要专业设备的流式分选方法。结论:在慢病毒转染过程中,常规培养的hESC/iPSC集落较为致密,对慢病毒感染具有一定抵抗性;小分子化合物Y-27632使得hESC/iPSC克隆集落结构相对松散,表面积增加,显著提高了对慢病毒的易感性,提高了感染效率;成功设计了一种简便且对细胞无毒性的显微操作器件,在常规实验室条件下,可有效取代流式分选及药物筛选,实现细胞单克隆的挑选建系。     

土壤干旱对观赏植物活性氧产生和抗氧化酶活性的影响

采用盆栽试验方法,考察自然干旱-复水处理下观赏植物红叶石楠、金叶女贞、小叶黄杨和大叶黄杨叶片超氧阴离子自由基(O-·2)产生速率、丙二醛(MDA)含量以及保护酶(SOD、POD、CAT)活性的变化,研究各种植物在干旱条件下的活性氧产生与酶促清除过程以及复水后的恢复情况差异,以揭示植物在逆境条件下的适应策略。结果表明:(1)自然干旱过程中,红叶石楠叶片O-·2生成速率呈先降低,之后明显升高,而小叶黄杨、金叶女贞、大叶黄杨均先升后降。(2)干旱提高了4种植物的MDA含量,但金叶女贞和大叶黄杨的MDA含量变化较小。(3)干旱下4种植物叶片的SOD活性增强,它们的POD活性变化不同,而CAT活性均先升高后下降。(4)复水后,4种植物O-·2产生速率和MDA含量均降低;小叶黄杨、金叶女贞、大叶黄杨SOD活性上升,而红叶石楠SOD活性下降;红叶石楠、金叶女贞、大叶黄杨CAT活性下降,而小叶黄杨则上升;红叶石楠、小叶黄杨、大叶黄杨POD活性下降,而金叶女贞却上升。研究表明,不同植物对活性氧的清除途径不同;隶属函数法分析表明4种观赏植物在干旱胁迫初期的综合抗旱性表现依次为:小叶黄杨金叶女贞大叶黄杨红叶石楠。     

根际温度对黄瓜幼苗生长及生理生化指标的影响

采用营养液栽培法,以‘春秋王2号’黄瓜为实验材料,研究了4个根际温度梯度处理(20℃、25℃、30℃、35℃)对其幼苗生长,地上部、地下部生理生化指标的影响,探讨根际温度对黄瓜幼苗生长的影响机理。结果显示:(1)黄瓜幼苗的株高、茎粗、叶面积和地上地下生物量在25℃处理下都明显大于其他3个处理,而在35℃处理下均显著降低。(2)20℃、25℃处理下,黄瓜幼苗叶片的净光合速率(Pn)均较大,此时其叶片与根系中的淀粉、蔗糖、总糖含量较高且明显高于30℃处理,35℃根际温度处理下叶片Pn严重下降。(3)根际30℃、35℃高温使得黄瓜幼苗叶片和根系中的POD活性升高,CAT活性降低;而叶片中SOD、APX活性均随根际温度的升高而增大,根系中则表现出了逐渐下降趋势。(4)叶片和根系的电解质渗漏率、丙二醛(MDA)含量在25℃下最低,而在35℃处理下最高;叶片中脯氨酸及可溶性蛋白含量在35℃处理下最高,但此时根系中含量显示最低。研究表明,4个根际温度中,25℃最适合黄瓜幼苗的生长,35℃高温直接作用部位(根系)的2种主要渗透调节物质脯氨酸及可溶性蛋白含量下降,此时叶片和根系中抗氧化酶活性的变化使得细胞膜受到了明显的过氧化伤害,根系受伤害程度加重,从而抑制了植株整体的生长。     

GST-His-Heparinase I双标签融合蛋白的原核表达与纯化

以pETl5b-Hep I为模板,通过PCR技术扩增出上游合有6×His标签的HepI基因序列,克隆至表达载体pGEX-4T-1。测序鉴定后,将重组表达质粒pGEX．His．HepI转入E．coliBL21（DE3）感受态细菌,经IPTG诱导表达。表达产物可溶部分用GSTrapFF和HisTrapHP柱两步亲和纯化,所得产物经SDS—PAGE检测,在66kDa和43kDa处显示特异条带,分别与GST．His．HepI和His-HepI融合蛋白预期分子量相符;最终His—HepI融合蛋白的比酶活为86．45IU／mg,纯度高达99％,与仅一步亲和纯化得到的GST．His—Hep I融合蛋白相比,进一步提高了纯化后重组肝素酶的纯度。本研究为制备高纯度的HepI提供了一种方法,对制备高安全性的LMWH和解析HepI晶体结构具有重要意义。     

根际高温胁迫对5种瓜类作物生长及叶片光合和叶绿素荧光参数的影响

采用营养液栽培法,比较分析了根际高温(35℃)处理0、3和5 d以及恢复5 d后黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia Bouché)、‘春秋王2号’黄瓜(Cucumis sativus‘Chunqiuwang No.2’)、‘兴蔬’丝瓜(Luffa cylindrica‘Xingshu’)、‘五叶香’丝瓜(Luffa cylindrica‘Wuyexiang’)和‘傲美’苦瓜(Momordica charantia‘Aomei’)幼苗的生长及叶片光合和叶绿素荧光参数的变化。结果表明:与对照(25℃)相比,在高温处理期间及恢复期间,黑籽南瓜、‘春秋王2号’黄瓜和‘傲美’苦瓜的株高、茎粗、叶面积、叶绿素相对含量(SPAD)以及叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)、PSⅡ的光能捕获效率(Fv’/Fm’)、PSⅡ的实际光化学效率(ΦPSⅡ)、实际光化学量子产量(Yield)、表观光合电子传递速率(ETR)、光化学猝灭系数(qP)及PSⅡ用于光化学反应的能量比例(P)总体上均显著低于对照;而‘五叶香’丝瓜的上述指标大多无明显变化,但其非光化学猝灭系数(qN)及PSⅡ用于天线色素热耗散的能量比例(D)均低于对照;‘兴蔬’丝瓜的各项指标在高温处理期间均有不同程度的降低或升高,但在恢复5 d后各项指标均接近或高于对照。研究结果表明:5种瓜类作物对根际高温的耐受性有明显差异。其中,黑籽南瓜和‘春秋王2号’黄瓜对根际高温的耐性最差;2个丝瓜品种特别是‘五叶香’丝瓜的耐性较强,可作为耐高温瓜类作物的砧木。     

辛伐他汀对雷帕霉素作用下心肌微血管内皮细胞的影响

目的:研究辛伐他汀(SIM)对雷帕霉素(RAPA)引起的体外心肌微血管内皮细胞(CMECs)损害的保护机制。方法:分离、培养大鼠心肌微血管内皮细胞。经形态学及Dil-ac-LDL吞噬试验进行鉴定后,采用RAPA(100 nM)处理24小时建立CMECs损伤模型,然后加入不同浓度的SIM(0,10-2,10-1,100,101μM)培养24小时后,采用MTT,WST-8及Transwell检测受损后CMECs的增殖和迁移;采用Hoechst 33258及Caspase-3检查各组CMECs的凋亡;采用蛋白免疫印迹(Western blotting)检测Akt/p70 S6K磷酸化的程度;格里斯反应及实时逆转录PCR分别检测一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表达。结果:①经形态学及Dil-ac-LDL吞噬试验均表明,成功培养CMECs;②低浓度SIM 100μM可显著改善100 nM RAPA对CMECs增殖、迁移和凋亡的影响;③SIM可通过上调PI3K/Akt进而上调p70s6K磷酸化(P0.05或P0.01);④SIM通过PI3K/Akt促进CMECs分泌NO及eNOS mRNA的表达(P0.05或P0.01)。结论:一定浓度下的SIM可改善RAPA作用下CMECs的增殖,迁移和凋亡,这些保护作用可能是通过其激活PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路实现的。