果胶酶CP-85211菌株的选育及其液体发酵条件的研究

黑曲霉(Aspergillus niger) CP-831经0.03％亚硝基呱在40℃处理30分钟,获得一株高产果胶酶突变株CP-85211。该突变株发酵滤液,当以果胶为底物时,酶活力为308u／m’;当以多聚半乳糖醛酸为底物时,酶活力为842u／ml。产酶活力水平约为出发菌种的5倍。产酶最适培养基组成为：8％麦麸,2％桔皮粉和2％硫酸铵。最适培养条件为：起始pH 3．5,如℃,72小时。     

构菌栽培过程中对木质纤维素的降解和几种多糖分解酶活性的变化

本文分析了构菌在木屑-麦麸基物上生长发育期间,基物主要组分的降解和几种多糖分解酶活性的变化。结果表明,菌丝体迅速生长期间呼吸强度最大,在菌丝长满基物到子实体发生期间的呼吸强度很小,子实体发育期呼吸强度再次升高。在以新鲜木屑为主要基物时,构菌对基物中的纤维素和半纤维紊的分解作用较弱,并且构菌仅有很徽弱的木紊分解能力。胞外羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶,木聚糖酶、果胶酶和淀粉酶的活性存在于构菌整个栽培过程,在菌丝体迅速生长期淀粉酶活力较高,在菌丝长满基物后活力明显下降,其它四种酶的活性变化规律与淀粉酶活性变化规     

黑醋栗汁的酶法提取和澄清

用含纤维素酶和半纤维素酶的果胶酶制剂提取和澄清黑醋栗汁。在果汁自然pH(2.6)条件下,酶可在广泛的温度范围内起作用。100g水果破碎物,加103u酶制剂,50℃处理120分钟,出汁75g。出汁率提高33%。过滤速度提高14倍。经酶澄清处理的果汁不含果胶,澄清度68%。稳定性试验中未出现雾样混浊。     

产果胶酶的菌种选育及发酵条件

炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)AS 3.396经亚硝基胍和Co60r-射线诱变,获得一株高产果胶酶突变株G5512。该菌株的发酵滤液,以高酯果胶为底物的酶活力为860u／ml;以低酯果胶为底物的酶活力为1227u／ml。产酶活力水平约为原出发菌株的2—6倍。产酶最适培养条件为：起始pH4.0—4.5,30℃,72—90小时。酶作用最适条件为：高酯果胶为底物时,pH3.5,50℃;低酯果胶为底物时,pH4.5,50℃。pH稳定范围为2．0-6．5(高酯果胶)和4.5—5.0(低酯果胶)。酶在60℃保温15分钟,高酯果胶为底物的酶剩余活力71％,低酯果胶为底物的酶活力仅剩余1％。     

苎麻酶法脱胶研究

Bacillas sp.No.5黄产生果胶酶的最适条件是氮源1％(NH_4)SO_4,碳源5％麸皮,诱导物2％甜菜渣:34℃、培养34h。酶作用最适温度50℃,最适pH9.6;50℃以下、pH8.4以下,酶的稳定性较好。用粗酶液脱胶时,先将苎麻纤维放入稀酸中煮30分钟,再放入80～100ngu/ml(粗酶液pH9.6,保温50℃、4小时,可脱去麻纤维93％的胶质。在脱胶过程中,可用测定还原基团来指示脱胶程度。     

沙棘果渣总黄酮提取工艺优化及抗氧化活性研究

利用果胶酶协同超声波法,对沙棘果渣有效成分总黄酮的提取工艺及其抗氧化活性进行了研究。以提取率为指标,通过酶用量、液料比、乙醇浓度、提取时间、提取温度、超声功率等单因素分析,选定酶用量、液料比、超声提取时间3个因素进行响应面试验,确定提取优化工艺条件为:果胶酶用量5.1%,液料比41∶1,超声提取时间81 min,此条件下,沙棘果渣总黄酮提取率达到8.91 mg/g;以BHT为阳性对照,进行了抗氧化活性研究,得出沙棘果渣总黄酮提取液浓度为0.14 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率达到了94.42%;提取液浓度为1.2 mg/mL时,对羟自由基和超氧阴离子的清除率分别为83.10%和43.41%。整体来看,沙棘果渣总黄酮具有较强的抗氧化能力。     

利用CRISPR-Cas9技术失活黑曲霉中果胶酶基因及突变株性能评价*

我国果胶酶制剂使用广泛但专一性不高,高效、专一的果胶酶制剂在市场上仍然匮乏。利用基因工程技术改造果胶酶生产菌株——黑曲霉来生产单一成分的果胶酶成为解决果胶酶应用需求的一种有效方案。构建一种高效的CRISPR-Cas9基因编辑技术,可为构建高产单一性果胶酶的黑曲霉底盘菌株提供有效的基因编辑工具。首先敲除产果胶酶黑曲霉基因组上的pyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株AnΔpyrG,并在AnΔpyrG菌株的pyrG基因位点定点整合Cas9基因表达盒和pyrG基因表达盒,构建组成型表达Cas9基因的黑曲霉菌株AnCas9,再构建含有gpdA启动子、锤头结构核酶、HDV核酶的稳定性表达sgRNA的pLM2-sgRNA质粒,建立CRISPR-Cas9基因编辑体系。利用该技术失活AnCas9菌株中的2个聚半乳糖醛酸酶基因4978020和4983861来检测构建的CRISPR-Cas9基因编辑效率并检测4978020基因功能缺失菌株的表型变化和产酶变化,结果表明果胶酶基因编辑效率大于50%,AnΔ4978020的表型和果胶酶酶活性与出发菌株均无明显变化。在黑曲霉中成功构建了高效的Cas9基因编辑技术,4978020基因功能缺失也不影响菌株表型,为构建高产单一性果胶酶黑曲霉底盘菌株奠定基础。     

类芽胞杆菌碱性果胶裂解酶的纯化与酶学性质表征

从类芽胞杆菌Paenibacillus sp.WZ008的发酵上清液中纯化得到一个高活力碱性果胶裂解酶,经SDS-PAGE电泳估算其亚基相对分子质量为4.5×104。通过对该酶进行酶学性质研究发现：该酶能催化裂解果胶酸、低酯果胶和高酯果胶;酶催化反应最适温度范围为55～60℃,最适pH为9.6,在最适条件下以低酯果胶为底物酶的比酶活达3 021.6 U/mg;Ca2＋能增强该酶的活力,而Mn2＋,Ba2＋和EDTA强烈抑制该酶活力;当没有Ca2＋存在时,高度酯化的果胶是该酶的最适底物,在4 mmol/L Ca2＋存在时,该酶以果胶酸为底物比酶活最高（25 467 U/mg）。该酶N端序列比对分析发现与类芽胞杆菌Paenibacillus amylolyticus strain 27c64果胶裂解酶高度同源。     

黑曲霉原生质体诱变选育果胶酶高产菌株

通过UV和NTG诱变筛选获得了2株高产果胶酶突变株。以果胶酶产生菌黑曲霉EIM6为诱变材料,采用1．5％的溶壁酶和1．5％的纤维素酶处理其对教生长期菌丝体2h获得高质量的原生质体。采用UV25S或50μg／mL NTG诱变30min,构建原生质体突变库,经刚果红果胶平板筛选获得果胶酶突变株,通过液体深层培养复筛获得高产突变株EIM6-U11、EIM6-N5,酶活力分别从46598．08、46598．08U／mL提高至68596．57、68879．56U／mL,分别提高了47．21％、47．82％。连续8次传代经发酵测酶活力表明高产突变株EIM6-U11、EIM6-N5具有较高的遗传稳定性。     

果胶酶高产菌株的紫外线及硫酸二乙酯的诱变育种

以HDYM-02为出发菌株,用紫外线及硫酸二乙酯进行诱变,从大量突变株中进行筛选,选育出2株产果胶酶性质稳定且酶活明显提高的突变株UV-21和DES-1,株相比其产酶期提前,前者在24h时的酶活力为出发菌株的1．6倍,后者在12h的酶活力为出发菌株的1．44倍。