TFⅢA型锌指蛋白及在提高植物耐逆性中的作用

TFⅢA型锌指蛋白属于典型的C2H2型锌指蛋白,锌指区具有CX2-4CX3FX5LX2HX3-5H的保守结构。已有研究表明不同植物的TFⅢA型锌指蛋白在非生物胁迫应答反应中发挥了关键的作用。利用TFⅢA家族锌指蛋白基因进行植物耐逆性的遗传改良,可能是今后植物耐逆基因工程改良的又一个重要方向。     

水稻多逆境诱导基因OsMsr4的克隆与表达分析

为深入了解水稻逆境反应的分子机理和发现新的耐逆相关功能基因,采用Affymetrix水稻表达芯片分析超级稻两优培九母本培矮64S(Oryza sativa L.)不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在低温、干旱、高温逆境胁迫下的表达水平,筛选出多个多因子诱导高表达特异基因(待另文发表).OsMsr4是其中一个在多种逆境条件,各生长发育时期与组织器官,其表达量均显著上调的基因,用实时定量PCR方法对其表达水平进行了进一步的分析,所得结果与基因芯片结果基本吻合.用 PCR方法扩增获得长为550 bp全长基因序列,其编码的144个氨基酸残基形成Cys2His2型双锌指结构蛋白,并且锌指结构的α-螺旋区含有植物锌指蛋白特定的保守序列QALGGH.因此,OsMsr4有可能是TFⅢA型锌指蛋白,作为转录因子参与各种环境胁迫应答反应,调控多个逆境相关基因表达.     

一种转录受病原物接种和机械创伤诱导的水稻WRKY基因的鉴定

WRKY基因编码一类植物特异性转录因子,该类基因目前在双子叶植物中得到了较好的研究。为了研究WRKY基因在单子叶植物中的生物学功能,从水稻(Oryza sativa L.)中分离了OsiWRKY基因的cDNA。该cDNA可编码一个含482个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白质预测的一级结构中含有一个WRKY结构域,在该结构域中发现了一个典型的C2-H2锌指结构模块。OsiWRKY预测的一级结构中还可能含有一个细胞核定位因子;利用瞬时表达体系,发现OsiWRKY与GFP绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白的确定位在水稻细胞核中。在凝胶阻滞实验中,体外表达的OsiWRKY蛋白可特异地结合W-box顺式因子。在水稻白叶枯病原细菌接种实验中,OsiWRKY基因的转录本在抗病品种(IR-26)中的诱导增加强度明显高于感病品种(Jingang 30)。在模拟接种的水稻中,OsiWRKY基因的转录本也表现诱导增加,但其诱导增加的起始时间和幅度要显著低于水稻白叶枯病原细菌接种的水稻植株。这些结果表明,OsiWRKY基因可能编码了一个含有WRKY结构域的转录因子,该转录因子可能参与了水稻对病原物接种和机械创伤的反应,但OsiWRKY蛋白调节两种反应的机制可能有所不同。     

一种转录受病原物接种和机械创伤诱导的水稻WRKY基因的鉴定

WRKY基因编码一类植物特异性转录因子,该类基因目前在双子叶植物中得到了较好的研究.为了研究WRKY基因在单子叶植物中的生物学功能,从水稻(Oryza sativa L.)中分离了OsiWRKY基因的cDNA.该cDNA可编码一个含482个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白质预测的一级结构中含有一个WRKY结构域,在该结构域中发现了一个典型的C2-H2锌指结构模块.OsiWRKY预测的一级结构中还可能含有一个细胞核定位因子;利用瞬时表达体系,发现OsiWRKY与GFP绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白的确定位在水稻细胞核中.在凝胶阻滞实验中,体外表达的OsiWRKY蛋白可特异地结合W-box顺式因子.在水稻白叶枯病原细菌接种实验中,OsiWRKy基因的转录本在抗病品种(IR-26)中的诱导增加强度明显高于感病品种(Jingang 30).在模拟接种的水稻中,OsiWRKy基因的转录本也表现诱导增加,但其诱导增加的起始时间和幅度要显著低于水稻白叶枯病原细菌接种的水稻植株.这些结果表明,OsiWRKY基因可能编码了一个含有WRKY结构域的转录因子,该转录因子可能参与了水稻对病原物接种和机械创伤的反应,但OsiWRKY蛋白调节两种反应的机制可能有所不同.     

水稻含有B-box锌指结构域的OsBBX25蛋白参与植物对非生物胁迫的响应

锌指蛋白在调控植物生长发育和应对逆境过程中发挥着重要作用.为进一步研究锌指类蛋白参与植物非生物胁迫响应的分子机制,对水稻(Oryza sativa)中一个编码含有B-box锌指结构域蛋白的OsBBX25基因进行了功能分析.OsBBX25受盐、干旱和ABA诱导表达.异源表达OsBBX25的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)与野生型相比对盐和干旱的耐受性增强,且盐胁迫条件下转基因植物中KIN1、RD29A和COR15的表达上调,干旱胁迫下KIN1、RD29A和RD22的表达上调.外源施加ABA时,转基因植物的萌发率与野生型之间没有明显差异.OsBBX25可能作为转录调控的辅助因子调节胁迫应答相关基因的表达,进而参与植物对非生物胁迫的响应.     

中华蜜蜂ZFP37基因的生物信息学分析及高温下表达特性的研究

锌指蛋白（Zinc finger proteins,ZFPs）是一类在真核生物体内广泛分布的蛋白质。锌指蛋白作为一类转录因子,它能够调控基因的表达和细胞的分化,最近的研究显示其在动植物抗逆方面也发挥着重要作用。本研究对中华蜜蜂 Apis cerana cerana ZFP37的蛋白结构进行了预测分析,并通过qRT-PCR分析了中华蜜蜂在遭受高温胁迫时ZFP37的表达情况,进一步了解锌指蛋白在中华蜜蜂应对热胁迫过程中的作用。结果显示,中华蜜蜂ZFP37可编码123个氨基酸,蛋白分子量为13.7 kDa,无跨膜结构。氨基酸同源序列比对结果表明,中华蜜蜂ZFP37序列与蜜蜂科昆虫的相似性最高,与其他膜翅目昆虫的相似性存在差异。基因的表达模式显示,ZFP37在高温下表达升高,此外,胁迫时间的增加也可导致ZFP37表达的升高。这些结果表明ZFP37对于中华蜜蜂应对热应激有重要的生物学意义。     

人造锌指蛋白的应用

C2H2锌指是真核细胞中最常见的DNA结合模体。由于C2H2锌指域靶位点特异性与结构和功能的模块性构成,使得C2H2锌指域成为构建特定的DNA结合蛋白的常用骨架。保持C2H2锌指的基本骨架不变,替换锌指特定位点的氨基酸残基,并融合表达其他功能域就可以得到具有靶向性的人造锌指蛋白(ZFP)。ZFP可以介导靶基因的转录调控,抑制或激活特定基因的表达与配体依赖的靶基因激活或抑制;对DNA进行修饰,如人造限制性内切酶,重组酶,整合酶;抗病毒感染等。因此,人造锌指蛋白应用前景广阔,研究价值显著,是未来人类基因治疗的革命性的工具。     

大豆C2H2型锌指蛋白基因SCTF-1的克隆及功能分析

锌指蛋白是一类具有手指型结构的蛋白质,其中一些锌指蛋白是转录因子,对真核生物的生长发育及非生物逆境胁迫的耐受能力都有着重要作用。文章从大豆(Glycine max(L.)Merr.)中克隆了一个新的C2H2型锌指蛋白基因SCTF-1(GenBank登录号:JQ692081),该基因包含一个699 bp的开放阅读框,编码233个氨基酸,无内含子,有两个典型的C2H2型锌指结构。锌指结构中有植物锌指蛋白特有的保守氨基酸序列QALGGH。经软件预测分析,其等电点pI=8.33,分子量24.9 kDa。农杆菌介导的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验结果表明,SCTF-1蛋白能够定位到细胞核中。通过RT-PCR检测发现该基因在大豆叶和花中的表达量较高,在茎和根的表达量相对较低。在对大豆幼苗的低温胁迫中,SCTF-1基因的表达量明显增加。将SCTF-1基因转入烟草(Nicotiana tabacum L.)中,发现SCTF-1基因的过量表达能够明显提高转基因烟草的耐冷能力。     

过表达秋茄C2H2型锌指蛋白基因KcZFP提高烟草耐盐性

基因转录调节是植物对非生物胁迫适应机制的一个重要方面,转录调节因子在胁迫信号转导途径中调节下游基因的表达,在建立植物对胁迫适应性过程中起到重要作用.锌指蛋白是功能多样的转录调节因子蛋白家族,家族成员在植物响应非生物胁迫方面扮演着重要角色.本研究以秋茄C2H2型锌指蛋白编码基因KcZFP为目的基因,在烟草中过表达KcZFP,分析C2H2型锌指蛋白在植物耐盐性中的作用.研究结果显示:转基因株系中,KcZFP表达量显著提高.过表达KcZFP的烟草植株的耐盐性明显提高,在200 mmol/L NaCl处理的条件下,KcZFP过表达烟草中脯氨酸水平远高于野生型植株.对光合作用参数比较分析显示,在KcZFP过表达植株中净光合速率受盐胁迫的影响小于野生型植株,光合系统在一定程度上得到了保护.研究结果说明KcZFP作为转录调节因子参与了植物的渗透调节,对植物的耐盐性具有贡献.     

水稻种子发育期间特异锌指蛋白基因的筛选与分析

.锌指蛋白基因是植物基因组中最大最复杂的基因家族之一.大部分的锌指模体存在于转录因子中,它们在转录水平上参与植物生长发育及植物对生物和非生物胁迫的反应.为了解锌指蛋白基因在水稻种子发育中的作用,本研究通过多种数据库搜索获得了878个水稻锌指蛋白基因.从中选取311个利用RT-PCR技术分析它们在水稻成熟期根、茎、叶、花及不同发育阶段种子中的表达特征.结果发现,共有196个基因能在至少1个水稻器官中表达,其中10个为种子特异性表达基因.进一步分析发现,10个特异表达基因在水稻种子不同发育阶段中的表达具有种子阶段表达特异性.同时分析它们的基因及蛋白结构特点,结果显示它们的结构较简单,其中3个蛋白含有线粒体靶肽,5个蛋白含有CCCH锌指结构域.另外,分析种子特异性表达基因上游调控区的顺式作用元件,结果表明它们都含有TATA-box、CAAT-box和种子特异调控元件,除此之外还发现了光、激素和胁迫反应相关调控元件.这些结果为进一步研究它们在种子发育过程中的生物学功能提供了有用的线索.     

梭梭HaDREB2C基因的克隆和转录激活分析

梭梭是生长在我国西北荒漠地区抗逆性极强的一种生态保护型植物。通过RT-PCR技术克隆到梭梭的转录因子HaDREB2C的cDNA全长编码区为1 125 bp(登录号为KU523927),编码374个氨基酸,其中含有一个AP2结构域;半定量RT-PCR表达量显示,该基因受干旱,高盐的诱导;将HaDREB2C克隆到酵母表达载体pGBKT7中转入AH109酵母细胞,转化子可以在SD-Trp、SD-Trp-His-Ade多营养缺陷型固体培养基中正常生长,运用β-半乳糖苷酶的滤纸分析法显色测定,证明pGBKT7下游报告基因被激活,HaDREB2C在酵母中具有转录激活活性。     

小麦锌指蛋白基因TaLOL2的克隆及特征分析

通过电子克隆与RT-PCR相结合的方法,在条锈菌诱导的小麦叶片中克隆获得1个新的LSD1型锌指蛋白基因TaLOL2,并用qRT-PCR技术分析了其转录表达特征。结果显示:(1)小麦锌指蛋白基因TaLOL2的cDNA全长1 095bp,编码179个氨基酸。(2)TaLOL2含有3个典型的zf-LSD1型(CxxCxRxxLMYxxGASxVxCxxC)保守结构域,与水稻、拟南芥、大麦等植物LSD1型锌指蛋白序列具有高度相似性,其中与水稻OsLOL2相似度达86.0%。(3)进化树分析表明,TaLOL2与水稻、拟南芥和大麦中部分含有3个保守zf-LSD1锌指结构的基因亲缘关系较近,而与其它包含不同数目的zf-LSD1锌指结构的基因亲缘关系较远。(4)qRT-PCR定量分析表明,TaLOL2在条锈菌侵染前期呈上调表达,在亲和及非亲和反应中差异表达。研究表明,TaLOL2参与了条锈菌诱导的小麦抗病防卫反应,很可能作为正调控因子参与了小麦-条锈菌非亲和互作中对条锈菌的抗性信号途径。     

小拟南芥ApZFP基因异源超表达促进拟南芥开花并提高耐逆性

锌指蛋白(ZFP)是一类重要的转录因子, 广泛参与植物的生长发育和非生物胁迫应答。新疆小拟南芥(Arabidopsispumila)又名无苞芥, 是十字花科短命植物, 具有高光效、繁殖力强和适应干旱等生物学特征, 而且比模式植物拟南芥(A.thaliana)更耐高盐胁迫。将前期克隆的小拟南芥锌指蛋白基因ApZFP通过花滴法转化到哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)中,获得了独立表达的转基因株系。表型观察发现, 过量表达ApZFP基因可促使拟南芥在长短日照下均提前开花。实时荧光定量PCR结果显示, 转基因拟南芥株系中, 光周期途径中的CO基因和年龄途径中的SPL基因表达上调; 春化、环境温度和自主途径中的FLC基因表达下调; 编码成花素的基因FT及下游开花相关基因AP1和LFY的表达量均升高。进一步通过盐、干旱和ABA胁迫处理ApZFP转基因株系的种子和幼苗, 发现在胁迫处理下, 与对照相比, 转基因拟南芥种子萌发率较高, 幼苗主根较长。因此推测, ApZFP在植物发育过程中具有多种功能, 可能既参与植物的开花转变过程, 又同其它植物的锌指蛋白基因一样, 参与植物的耐逆过程。     

白桦锌指蛋白基因的分离及表达分析

植物锌指蛋白是成员众多的转录因子家族,在植物的生长发育和对非生物胁迫响应等过程中具有重要作用。根据Cys和His残基的数目和位置将锌指转录因子分为C_2H_2、C_8、C6、C_3HC_4、C_2HC、C_2HC5、C_4、CCCH和C_4HC_3九种类型。本实验利用其他物种中已报导的植物逆境胁迫相关的锌指蛋白转录因子基因序列作为信息探针,在白桦基因组数据库中筛选出10个基因,分别是4个C_2H_2型、5个C_3HC_4-RING型和一个CCCH型。通过q RT-PCR技术对筛选的基因在根中的表达模式进行了分析,结果显示Bp ZFP_2、Bp ZFP_3、Bp ZFP_4、Bp ZFP5和Bp ZFP_8的表达受盐和干旱胁迫的显著诱导,表明这些基因参与了逆境胁迫的应答。     

水稻C2H2型锌指蛋白基因RZF71的克隆与表达分析

利用生物信息学和RT-PCR方法从水稻幼苗组织中分离了1个新的C2H2型锌指蛋白基因RZF71, 该基因编码一条250个氨基酸残基的多肽, 含有两个典型的C2H2型锌指结构。半定量RT-PCR分析表明: RZF71在根、茎、叶和幼穗中呈组成性表达, 在根中的表达丰度略高; 在高盐和PEG6000胁迫的水稻幼苗组织中, RZF71的表达显著增强, 但低温和ABA处理对该基因的表达量影响不大。农杆菌介导的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验表明: RZF71定位于细胞核内。讨论了RZF71可能作为一个转录调控因子在水稻耐高盐和渗透胁迫中的作用。     

无苞芥锌指蛋白基因OpZFP提高烟草耐盐性的研究

旨在研究C2H2型锌指蛋白在植物生长发育、非生物胁迫信号转导过程中的作用。前期从新疆无苞芥中克隆的一个单锌指基因Op ZFP,利用叶盘法将Op ZFP基因转入普通烟草中。半定量RT-PCR表明,在转基因植株中Op ZFP基因能够高效表达。烟草耐盐性分析显示,在高盐胁迫下,转基因植株的根长要长于野生型植株,且转基因烟草丙二醛(MDA)的含量要明显低于野生型植株;并且高盐胁迫处理,野生型烟草离体叶片叶绿素降解率高于转基因植株。这些结果表明,过量表达Op ZFP的转基因植株可以提高植物对盐胁迫的抗性。     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控。构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)植物和水稻(OryzasativaL.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因。转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高。这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达。在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节。     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控.构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)植物和水稻(Oryza sativa L.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因.转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高.这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达.在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节.     

巴西橡胶树HbNAC24基因克隆和表达分析

该研究以巴西橡胶树为实验材料,从橡胶树胶乳cDNA中克隆了NAC转录因子基因(HbNAC24)完整开放阅读框(ORF),并通过酵母实验和实时荧光定量PCR技术,进行转录激活活性分析和表达分析。结果显示:(1)HbNAC24基因ORF为1 167bp,编码388个氨基酸,在N端第7~174氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域。(2)酵母实验表明,HbNAC24具有转录激活活性,转录激活区在高度变异C端,具备了NAC转录因子的基本特征。(3)序列比对和系统进化分析表明,HbNAC24蛋白属于NAC转录因子家族中的TIP亚族。(4)实时荧光定量PCR分析结果发现,HbNAC24基因在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶和茉莉酸(JA)处理均能够诱导HbNAC24表达上调。研究认为,HbNAC24基因可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

沙冬青RING型锌指蛋白基因AmRFP1的克隆与功能初步分析

利用RT-PCR方法,从强抗逆植物蒙古沙冬青克隆到1个受寒旱诱导的锌指蛋白基因AmRFP1。预测其编码蛋白由366个氨基酸残基组成,其中含有1个C3H2C3型锌指结构域,故属于RING-H2(C3H2C3)型锌指蛋白。该蛋白还含有2个跨膜区,很可能定位于细胞质膜。半定量RT-PCR分析表明,在不同季节野外生长沙冬青植株嫩叶中,AmRFP1在夏季只有低水平表达,进入秋季后表达量明显增加,尤其在秋末冬初其表达量迅速增加并达到全年最高峰,但在进入最寒冷的隆冬后又回落至秋季水平并维持到翌年春季基本未变。将该基因在拟南芥中超表达,则明显降低了转基因拟南芥的抗冻性。