虾夷扇贝脂多糖诱导的肿瘤坏死因子LITAF基因的克隆及表达分析

脂多糖诱导的肿瘤坏死因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor,LITAF)是一类重要的炎症细胞因子,在先天性免疫系统中发挥重要的介质作用。文章根据虾夷扇贝LITAF基因EST序列,应用RACE技术克隆了虾夷扇贝LITAF全长cDNA,对序列及编码的氨基酸进行生物信息学分析。结果显示,该基因cDNA全长1 551 bp,其5′非编码区包含76 bp,3′非编码区包含1 001 bp;开放阅读框(ORF)为474 bp,编码157个氨基酸,氨基酸序列中存在一个保守的LITAF结构域;理论分子量16.99 kDa,等电点为6.24。LITAF基因序列为3 698 bp,由3个外显子和两个内含子组成。利用实时荧光定量PCR技术分析LITAF在虾夷扇贝不同组织、不同胚胎发育阶段以及鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后各时间段的表达情况。结果表明:LITAF基因在所检测的6个成体组织中均有表达,其中肾脏的表达量最高;胚胎发育的7个时期中,担轮幼体时期表达量最高;菌刺激36 h实验组与对照组的表达量差异大。LITAF基因是LITAF家族的一员,推测LITAF基因参与虾夷扇贝的先天性免疫反应。     

大口黑鲈脂代谢相关基因NPY、UCP2、LPL、HL克隆与分子进化分析

采用RT-PCR和RACE方法克隆了大口黑鲈NPY基因cDNA全序列及UCP2、LPL、HL基因cDNA核心片段。序列分析结果表明,大口黑鲈NPY基因cDNA全序列长664 bp,其中5′端非翻译区(5′-UTR)长53 bp,3′端非翻译区(3′-UTR)长311 bp,开放阅读框(ORF)长300 bp,编码99个氨基酸,即前体NPY。大口黑鲈前体NPY包括三个部分,28个氨基酸组成的信号肽、36氨基酸组成的成熟NPY以及32个氨基酸组成的由Gly-Lys-Arg指示的NPY C端肽（CPON）。大口黑鲈UCP2、LPL、HL基因cDNA核心片段长度分别为737 bp、509 bp和666 bp,各自编码245个氨基酸、169个氨基酸和222个氨基酸。将4个基因的氨基酸序列分别与其他物种的氨基酸序列进行同源性比较,并通过MEGA3构建系统树,对这4个脂代谢相关基因的分子进化特征进行了探讨。     

虾夷扇贝铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与转录表达特性分析

利用RACE和克隆等方法得到了虾夷扇贝铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因全长cDNA序列,该序列全长1 064 bp,5′和3′非编码区(UTR)分别为61 bp和541 bp,开放阅读框(ORF)462 bp,编码153个氨基酸和一个终止密码子.分析发现,此氨基酸序列含有形成二硫键的两个半胱氨酸残基以及4个铜结合位点、4个锌结合位点,与已知的Cu/Zn-SOD结构相似,与其它物种同源性较高.进行虾夷扇贝组织分布及发育过程中不同时期的实时荧光定量监测,发现鳃中Cu/Zn-SOD基因mRNA相对表达量最高,肾次之,血淋巴中最低;不同发育阶段Cu/Zn-SOD表达量变化明显,其中受精卵和早期D形幼体两个时期表达量相对较高.     

白桦肌动蛋白(Actin)基因全长cDNA克隆与序列分析

以白桦(Betula platyphylla Suk.)次生木质部为材料,用改良CTAB方法提取总RNA。根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物后进行RT-PCR,并采用RACE技术扩增出Actin基因全长序列。该基因cDNA全长1 785 bp,序列分析表明,该基因编码区1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区157 bp,3′非编码区495 bp。所得序列与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性高达96%以上。此基因已在GenBank注册（EU588981）。根据高等植物肌动蛋白相似性构建了进化树,表明白桦肌动蛋白与蓖麻肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。     

血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶基因的克隆与序列分析

为克隆血红密孔菌 (Pycnoporussanguineus)漆酶基因 ,根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计了 1对简并引物 .以血红密孔菌基因组DNA为模板 ,PCR扩增出长 12 2 7bp的漆酶基因片段 .以此序列为基础 ,通过 5′及 3′RACE技术克隆出漆酶全长cDNA序列 ,序列长为 190 2bp ,其 5′端和 3′端非编码区长分别为 5 1bp和 2 97bp ,开放阅读框长 15 5 4bp ,编码 5 18个氨基酸的蛋白 .该蛋白具有 4个铜离子结合区域 ,预测其相对分子量为 5 6 313 2 ,等电点为 5 5 9,其氨基酸序列与Pycnoporuscinnabarinus漆酶 (lcc3 2 )的同源性最高 ,为 96 % .以该cDNA编码区的两端序列为引物 ,PCR扩增得到漆酶的长度为 2 15 4bp的全长DNA序列 ,序列中包括 10个内含子序列 ,长为 5 2～ 70bp     

利用染色体步移PCR检测辐射松的单核苷酸多态性

用染色体步移技术(chromosome walking)的基本原理以辐射松(Pinus radiata)肌动蛋白基因(actin)为例,利用获得的EST序列设计定向引物,向上游和下游进行了染色体序列的步移.获得了包括启动子、5′端非编码区和编码区及3′端非编码区辐射松肌动蛋白基因基因组序列2154 bp.通过对200株不同辐射松个体进行PCR扩增及测序,共获得了21个SNPs,其中启动子区域3个,编码区15个,3′端非编码区4个.实验结果为今后染色体步移技术在基因非编码区SNP的检测提供了理论与技术参考.     

虾夷扇贝热休克蛋白60基因克隆及表达特性研究

旨在探讨虾夷扇贝高温应激的分子机理并为解决该种夏季死亡问题打下基础。基于HSP60的转录组序列设计特异引物,采用RACE技术成功克隆获得虾夷扇贝热休克蛋白60(My HSP60)c DNA全序列。其c DNA序列全长3 368 bp,包括68 bp的5'UTR,1 569 bp的3'UTR和1 731 bp的开放阅读框,共编码576个氨基酸。利用基因步移技术扩增My HSP60基因启动子区域序列并测序,获得My HSP60基因启动子区域序列1 236 bp,该区域包含2个TATA盒,4个CCAAT盒,3个热激元件。基于氨基酸序列构建的系统进化树与传统物种进化规律基本吻合。通过实时PCR检测发现HSP60在虾夷扇贝各组织中均有表达,升温后肾脏中该基因的转录量升高极显著,而肝胰腺、外套膜、血淋巴和闭壳肌中的转录量升高显著(P0.05),说明该基因在热应激过程中发挥一定作用。     

扩展青霉PF898碱性脂肪酶基因组DNA的克隆及序列分析

扩展青霉 (Penicilliumexpansum)PF898可产生一种具有重要工业生产价值的碱性脂肪酶(PEL) .在通过 3′RACE和 5′RACE获得PEL完整的cDNA序列的基础上 ,通过PCR方法首次克隆了该脂肪酶的完整的基因组DNA序列 (GenBank登录号为AF330 6 35 ) .该脂肪酶DNA全长 14 0 4bp ,包括PEL编码区、3′非翻译区和部分 5′非翻译区基因的序列 .编码区DNA由 1135个碱基组成 ,含有 5个内含子 ,大小分别为 5 8bp、4 7bp、5 0bp、5 6bp和 6 9bp .在已报道的丝状真菌脂肪酶中 ,PEL基因的内含子数量最多 ,而其大小与其它丝状真菌脂肪酶基因的内含子一样 ,均为只有几十个碱基的小内含子 .PCR扩增获得的PLEDNA序列还包括由 195个碱基组成的 3′端非编码区序列 ,74个碱基的部分 5′端非编码区序列 .PELDNA全长序列中的 - 2 4至 - 2 7nt为TATAbox ,终止码TGA下游15 6nt出现AATAAA序列 ,TGA下游 182位出现poly(A)尾 ,为典型的真核基因结构 .同源性序列分析表明 ,PEL与其它真菌来源脂肪酶的基因组DNA序列同源性约为 39%～ 4 9% ,PEL内含子之间或PEL内含子与其它丝状真菌脂肪酶基因的内含子之间的序列同源性约 4 2 %～ 5 7% .     

中华蜜蜂蜂毒镇静肽基因的cDNA克隆和表达

从中华蜜蜂 (Apisceranacerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR扩增得到大小约为2 5 0bp的cDNA片段 ,测序得到的片段长度为 2 34bp ,为蜂毒前镇静肽原 (preprosecapin)基因编码区的cDNA .以 3′RACE方法 ,扩增和测定了 3′端非编码区 2 19bp序列 .中蜂前镇静肽原cDNA序列与已报道的欧洲意蜂该基因cDNA序列具有 92 %同源性 ,氨基酸序列具有 87%同源性 .代表成熟肽镇静肽的最后 2 5个氨基酸序列 ,中蜂与意蜂同源性为 88% .3′端非编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有 73 1%同源性 .将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与 3′非编码区部分克隆 ,构建了镇静肽与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX AcSecapin .将载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)进行融合表达 .表达产物与抗GST抗体在 2 9kD处有很强的交叉反应 .大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白 ,通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白     

粘虫β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

β-actin基因作为actin家族的一员,在基因定量实验中常用作内参基因。本实验运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫Mythimna separata(Walker)cDNA为模板,对β-actin基因进行克隆获得全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对β-actin基因全长cDNA序列及推测得到的β-actin蛋白序列进行分析。结果表明,获得的粘虫核β-actin基因cDNA序列长度为1 472 bp,其中包括68 bp的5′非编码区、273 bp的3′非编码区和1 131 bp的开放阅读框,编码一个376个氨基酸蛋白,具有actin蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫β-actin蛋白理论分子量为41.7497 ku,等电点为5.29,富含6种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物β-actin蛋白序列具有97.9%～99.7%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示β-actin在6种不同组织间表达无显著差异(P>0.05),表明β-actin可作为研究粘虫不同基因表达水平高低的可靠内参基因。该基因的cDNA序列已经递交GenBank并获得登录号为GQ856238。     

黄鳝β-actin基因的克隆及其在鱼类中的系统发生分析

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构,细胞内运动,细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。克隆的黄鳝β-actin基因的cDNA全长1860bp,编码375个氨基酸,在脊椎动物中不同物种的β-actin基因之间的序列同源性超过了98％。RT-PCR表明克隆的黄鳝β-actin基因在睾丸、卵巢、心、肝、脾、脑等组织中广谱表达。基于目前已知的全部鱼类β-actin cds,构建了进化树。星形辐射的树型结构一致支持将鱼类β-actin基因划分为4类。到目前为止,所有的鱼都没有发现拥有全部4个β-actin基因。这暗示伴随着鱼类的辐射式进化历程,可能发生了种系特异性的β-actin的丢失。     

Molecular characterization and tissue-specific expression of the acetyl-CoA carboxylase α gene from Grass carp, Ctenopharyngodon idella

Acetyl-CoA carboxylase α (ACC1), the major regulatory enzyme of fatty acid biosynthesis, catalyzes the conversion of acetyl-CoA to malonyl-CoA. The full-length cDNA coding ACC1 isoform was cloned from liver of grass carp. The cDNA obtained was 7515 bp with a 7173 bp open reading frame encoding 2389 amino acids. The ACC1 protein has a calculated molecular weight of 269.2 kDa and isoelectric point of 6.23. Tissue distribution of ACC1 mRNA in brain, mesenteric adipose, spleen, white muscle and liver of grass carp was analyzed by real-time PCR method using β-actin as an internal control for cDNA normalization. The results showed that the expressions of ACC1 mRNA were detected in all examined tissues. Relative expression profile of ACC1 mRNA in liver normalized with β-actin level was 15, 92, 135 and 165-fold compared with the level in brain, white muscle, mesenteric adipose and spleen, respectively. In addition, we present evidence for the presence of two isoforms of ACC1 (265.7 kDa and 267.2 kDa) in grass carp liver that differ from the 269.2 kDa ACC1 by the absence of 34 and 15 amino acids. In conclusion, the liver is one of the main ACC1 producing tissues in grass carp and ACC1 gene was highly homologous to that of mammals.     

棉铃虫β-微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

β-微管蛋白是构成细胞骨架的重要组成性蛋白,对昆虫的蜕皮、器官形成等生长发育阶段均能产生重要影响。本文以棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)3日龄成虫为材料,利用RACE末端扩增技术克隆得到棉铃虫的β-微管蛋白基因的cDNA序列。序列分析表明:棉铃虫β-微管蛋白基因的cDNA序列包含1775个碱基,包括一个1347个碱基的开放阅读框,编码448个氨基酸组成的多肽。GenBank登录号:JF767013。同源性分析表明,棉铃虫的微管蛋白基因与本研究所比对其它昆虫的β-微管蛋白基因具有高度的同源性,达到90%左右。本研究克隆得到棉铃虫的β-微管蛋白基因的cDNA序列,对进一步深入研究该基因功能有重要意义。     

青鱼β-actin基因克隆及其启动子功能的初步检测

高保真PCR克隆青鱼β-actin基因开放阅读框和5’端侧翼序列,DNA测序结果表明：青鱼β-actin基因开放阅读框编码一段含375个氨基酸的蛋白,与其他物种actin家族相比较具有高度保守性。青鱼β-actin与鲤鱼、草鱼及斑马鱼的同源性均为100％,而与人和Norway鼠β-actin的同源性均为99.2％,与鸡和Kenyan爪蟾β-actin的同源性分别为98．9％和98．1％。将青鱼β-actin基因5’端启动调控区插入不含启动子的pEGFP1载体构建青鱼β-actin启动子／EGFP表达载体,与第一次卵裂之前显微注射该重组质粒入泥鳅受精卵,同时也用该重组质粒转染HeLa细胞系。观察结果表明：GFP在50％的泥鳅胚胎和2／3的HeLa细胞有所表达。GFP在泥鳅胚胎的各个部分均有表达,且在某些胚胎中GFP的表达遍布全身。因此,以EGFP为报告基因证实了青鱼β-actin基因启动子为一种非特异性表达的启动子。     

Cloning of Black Carp β-actin Gene and Primarily Detecting the Function of Its Promoter Region

A 3 338 bp DNA fragment including the open reading frame and 5′-flanking region of β-actin gene for black carp genome was obtained through PCR amplification. Analysis of the sequencing results indicated the ORF of black carp β-actin gene encoding a 375 amino acid protein that shares a high degree of conservation to other known actins. The black carp β-actin sequence showed 100% identity to common carp, grass carp, and zebrafish, 99.2% identity to human and Norway rat β-actin gene, 98.9% and 98.1% identity to chicken and Kenyan clawed frog β-actin gene, respectively. The promoter region of black carp β-actin gene was inserted into the promoterless pEGFP₁ vector. The recombinant plasmid was microinjected into the fertilized eggs of mud loach before two-cell stage as well as transfected into HeLa cell line. GFP expression was found in 50% of mud loach embryos and 2/3 HeLa cells. The GFP expression could be observed in every part of the mud loach embryos, and in some embryos, the GFP was expressed in the whole body. Thus, the usefulness of black carp β-actin promoter as a ubiquitous expression promoter was confirmed using the EGFP as a reporter gene.     

The manganese superoxide dismutase gene in bay scallop Argopecten irradians: cloning, 3D modelling and mRNA expression

A novel manganese superoxide dismutase (MnSOD) was cloned from bay scallop Argopecten irradians by 3' and 5' rapid amplification of cDNA ends (RACE) PCR. The full-length cDNA of MnSOD was of 1207bp with a 678bp open reading frame encoding 226 amino acids. The deduced amino acid sequence contained a putative signal peptide of 26 amino acids. Sequence comparison showed that the MnSOD of A. irradians shared high identity with MnSOD in invertebrates and vertebrates, such as MnSOD from abalone Haliotis discus discus (ABG88843) and frog Xenopus laevis (AAQ63483). Furthermore, the 3D structure of bay scallop MnSOD was predicted by SWISS-MODEL Protein Modelling Server and compared with those of other MnSODs. The overall structure of bay scallop MnSOD was similar to those of zebrafish Danio rerio, fruit fly Drosophila melanogaster, Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis, human Homo sapiens, and had the highest similarity to scallop Mizuhopecten yessoensis and abalone H. discus discus. A quantitative real-time PCR (qRT-PCR) assay was developed to detect the mRNA expression of MnSOD in different tissues and the temporal expression in haemocytes following challenge with the bacterium Vibrio anguillarum. A higher-level of mRNA expression of MnSOD was detected in gill and mantle. The expression of MnSOD reached the highest level at 3h post-injection with V. anguillarum and then slightly recovered from 6 to 48h. The results indicated that bay scallop MnSOD was a constitutive and inducible protein and thus could play an important role in the immune responses against V. anguillarum infection.     

一种HBV研究的新动物模型-喜马拉雅旱獭β-actin基因的克隆及序列分析

目的 喜马拉雅旱獭对土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus,WHV）高度易感,可作为HBV感染的新动物模型.本研究对喜马拉雅旱獭β肌动蛋白（β-actin）的部分cDNA序列进行了克隆和序列分析,为喜马拉雅旱獭在HBV感染研究中的应用奠定基础.方法 根据Genbank的土拨鼠β-actin cDNA的序列设计特异性引物,提取旱獭脾组织总RNA作为模板,RT-PCR扩增旱獭β-actin cDNA序列;PCR产物纯化后连接至T载体（pMD18-T）,构建重组质粒pMD18-T-mhActin.对重组质粒进行PCR初筛及酶切鉴定,选择阳性克隆测序;对所获得的序列进行同源性和种系进化分析.结果 获得的旱獭β-actin序列为349 bp（nt887～1 235）,其中编码序列为323 bp（nt-887～1209）,编码106个氨基酸,包含形成二硫键的2个丝氨酸位点（氨基酸16和氨基酸105）及与β-actin功能相关的2个ATP结合位点、6个凝溶胶蛋白结合位点和6个profilin结合位点.同源性分析发现上述序列与其它哺乳动物β-actin的同源性均高达88 %以上,与土拨鼠β-actin的同源性最高（99.69 %）,其氨基酸序列的同源性为100 %.种系进化树分析提示喜马拉雅旱獭β-actin与土拨鼠β-actin的亲缘关系最近,其次为其它啮齿类动物.结论 成功克隆了喜马拉雅旱獭β-actin的部分序列.序列分析发现喜马拉雅旱獭β-actin与土拨鼠β-actin的同源性最高.