青海大骨节病区小麦内生镰刀菌和硒对兔膝软骨细胞的影响

小麦内生镰刀菌5-5-1菌株是从青海大骨节病区穗期小麦籽粒中分离的一株优势内生镰刀菌,本试验通过采用干重法测定菌丝体生长量;MTT(methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide)法检测软骨细胞存活率;甲苯胺蓝染色法和免疫组化染色法分别检测兔膝软骨细胞内蛋白聚糖(aggrecan)和Ⅱ型胶原蛋白(collagenⅡ)的表达;逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测软骨细胞内蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白m RNA的表达水平,探讨了硒对5-5-1菌株生长的影响及不同硒水平下培养该菌株获得的发酵产物对兔膝软骨细胞有关指标的影响。结果表明,硒浓度在0.05~0.5 mg/L的范围内,对5-5-1菌株生长有促进作用,且呈浓度效应;低浓度硒条件下培养的该菌株发酵产物对软骨细胞蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成及其m RNA表达的抑制作用相对较小。由此推断适宜浓度硒具有促进镰刀菌生长的作用,但同时能够减轻其发酵产物对软骨细胞的损伤。     

一株镰孢霉发酵产物不同极性提取物对兔膝软骨细胞的影响

通过研究一株内生梨孢镰孢霉(Fusarium poae)发酵产物中不同极性提取物对兔膝软骨细胞的影响,初步了解其中毒性物质的基本性质,为进一步探讨真菌毒素在大骨节病发病中的可能作用以及分离新的潜在致病物质打下良好基础。本研究以预实验中筛选出的对软骨细胞有较强毒损作用的F.poae菌株进行摇瓶培养;发酵产物先用75%乙醇进行提取,再将乙醇总提取物用不同极性的溶剂进行萃取;将所得各种次级提取物分别作用于体外培养的兔膝软骨细胞,检测与软骨细胞损伤相关的指标,其中细胞存活率采用噻唑蓝(MTT)显色法,Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖的含量分别采用免疫组化法和甲苯胺蓝染色法,二者相应的mRNA表达量用半定量RT-PCR进行检测。结果发现,不同极性溶剂提取所得的石油醚、乙醚、乙酸乙酯和水提取物,都能在不同程度上造成培养兔软骨细胞的存活率、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的含量以及相应mRNA的表达量降低;毒性强弱有随溶剂极性增强而减弱的趋势,以石油醚分部的综合毒损作用最强,其后依次为乙醚、乙酸乙酯和水提取物。镰孢霉发酵产物的各种不同极性提取物中,都存在对软骨细胞相关指标造成程度不等毒损作用的物质。这些结果支持我们关于大骨节病的发病可能和多种真菌毒素的综合作用相关的观点。     

一株小麦内生真菌的鉴定及其发酵产物对兔软骨细胞的影响

本研究对分离自青海大骨节病区小麦籽粒中优势内生真菌6-5-1菌株进行菌种鉴定并探讨其发酵产物对兔膝软骨细胞的影响。通过形态学观察及ITS序列分析进行菌种鉴定;其发酵产物经75%乙醇提取,并将乙醇总提物用3种不同有机溶剂(石油醚,乙酸乙酯和乙醚)进行萃取,分别作用于兔软骨细胞;四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT)显色法检测细胞存活率,甲苯胺蓝(toluidine blue,TB)染色法和免疫组化法分别检测蛋白聚糖和胶原蛋白的表达;RT-PCR检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原m RNA的表达。经鉴定6-5-1菌株为三线镰孢霉(Fusarium tricinctum)。其发酵产物乙醇总提物对细胞存活率有较强的抑制作用,对蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成与m RNA的表达均有抑制作用;其他萃取分部对软骨细胞损伤程度各不相同,石油醚分部作用最强,且各分部的影响作用均弱于乙醇总提物。可见6-5-1菌株代谢产物中应该有多种对软骨细胞产生损伤的物质,且这些物质可能存在协同作用。石油醚分部中可能存在已知损伤软骨细胞毒素以外的其他物质。     

兔关节软骨细胞体外三维培养条件的优化

实验使用海藻酸钠水凝胶作为细胞支架.模拟软骨细胞体内生长的三维环境,研究了体外三维培养条件下,不同浓度的胎牛血清(FBS)和硒酸复合液(ITS)体系对兔透明软骨细胞(hyaline cartilage)的牛长、增殖和细胞外基质分泌活动的影响.结果 表明,三维模式培养21天,透明软骨细胞仍然具有较好的增殖活性.在硒酸复合液及低浓度血清时,细胞未去分化,保持分泌Ⅱ型胶原(Collagen Ⅱ)和软骨聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的能力,与之比较,高浓度胎牛血清(10%)培养条件下,在21天开始细胞去分化,即硒酸复合液在一定的血清浓度下有助于维持软骨细胞生长、增殖,避免了软骨细胞受高浓度血清影响而去分化.     

链格孢霉醇和链格孢霉醇单甲醚产生菌株的筛选

本文对分离自小麦、马铃薯、番茄和茄子上链格孢霉属(Alternaria)2个种(链格孢和茄链格孢)的96个菌株,用枯草杆菌生长抑制试验筛选链格孢霉醇(AOH)和链格孢霉醇单甲醚(AME)的产生菌株,有48株产生毒性作用(占所测菌株的50％)。18株产强、中毒性菌用高效液相色谱分析,有13株产AOH和AME(占所测菌株的72.2％)。链格孢的产毒素菌株率比茄链格孢低。但产毒素含量却是前者明显高于后者。其中产AOH和AME的最高含量,链格孢菌株XA-8分别为280和5140mg/kg,而茄链格孢菌株SA-10分别为95.9和94.3mg/kg。     

链格孢霉醇和链格孢霉醇单甲醚产生菌株的筛选

本文对分离自小麦、马铃薯、番茄和茄子上链格孢霉属２个种的９６个菌珠,用枯草杆菌生长抑制试验筛选链格孢霉醇（ＡＯＨ）和链格孢霉醇单甲醚（ＡＭＥ）的产生菌株,有４８株产生毒性作用。１８株产强、中毒性菌用高效液相色谱分析,有１３株产ＡＯＨ和ＡＭＥ。链格孢的产毒素菌株率比茄链格孢低,但产毒素含量却是前者明显高于后者。其中产ＡＯＨ和ＡＭＥ的最高含量,链格孢菌株ＸＡ－８分别为２８０和５１４０ｍｇ／ｋｇ,而茄链     

毛霉菌油对被孢霉产花生四烯酸的影响

研究了不同浓度毛霉菌油对被孢霉产花生四烯酸（AA）的影响,发现0.3%毛霉菌油可以显著提高花生四烯酸产量,并研究了0.3%毛霉菌油在整个发酵过程中对被孢霉产花生四烯酸的影响。结果表明,毛霉菌油对被孢霉生长和油脂产量基本上没有影响,毛霉菌油可以提高被孢霉的AA产量,主要是因为其能提高AA在油脂中的含量。     

枝孢霉丝孢真菌生长特性的研究

为明确枝孢霉丝孢真菌生物学特性,根据枝孢霉属当前分类系统,选取6株代表菌株,通过单因素分析法,研究了不同培养温度、生长pH和培养基中葡萄糖、蛋白胨浓度对该类菌种生长的影响,并通过微量肉汤稀释法检测了 5种常用表面活性剂对该类菌种的最低抑菌浓度.结果表明,6株枝孢霉真菌适宜生长温度为20～25℃,pH为5.0～6.5,葡...     

不同程度骨关节炎中Wnt/β-catenin信号通路、OPN和MMP-13的相关性的研究

目的:研究不同严重程度骨关节炎模型兔的软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)和基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinase 13,MMP-13)的相关性。方法:将40只新西兰大耳白兔随机分成4组,通过注射不同浓度木瓜蛋白酶处理,而构建患有不同程度骨关节炎的兔模型。利用Real-Time PCR法和ELISA法分别检测β-catenin、OPN、MMP-13以及Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的m RNA和蛋白的水平。结果:利用不同浓度的木瓜蛋白酶成功建立OA兔模型,通过Mankin评分可分成轻度、中度和重度三级。在不同分级的OA模型兔中,β-catenin、OPN、MMP-13的浓度均高于正常对照组,而Ⅱ型胶原和蛋白聚糖较正常对照组均下降(P0.05);且随着OA严重程度增加,结果具有一致性(P0.05)。结论:Wnt/β-catenin信号通路可调节OPN的表达,进而影响到MMP-13的表达,最终对骨关节炎的发生产生影响。     

深黄被孢霉△5-脱饱和酶基因在花生四烯酸合成中的作用

【目的】研究△5-脱饱和酶基因的mRNA表达量与花生四烯酸产量之间的关系。【方法】实验利用荧光定量PCR方法检测了△5-脱饱和酶在五株深黄被孢霉的同一培养时间及菌株YZ-124在不同发酵阶段的mRNA表达水平,同时利用气相色谱仪测定其花生四烯酸含量。【结果】结果表明:不同菌株的△5-脱饱和酶基因的mRNA表达水平不同,原始菌株As3.3410最低,诱变菌株YZ-124最高;深黄被孢霉YZ-124不同发酵阶段的△5-脱饱和酶基因mRNA表达量随菌龄的增加逐渐增加。【结论】结合ARA的得率显示,△5-脱饱和酶基因mRNA表达量与培养物油脂中ARA含量呈一定的正相关关系。     

一株野大豆内生真菌YD02菌株的鉴定及抗逆性研究

从野大豆组织中分离筛选出1株内生真菌菌株YD02,通过形态学观察和分子生物学方法对该菌株进行鉴定;用单因素实验和正交试验确定菌株的最佳发酵条件;采用菌丝干重法和对峙培养法分别测定菌株的抗重金属镉胁迫的能力以及对植物病原菌的影响。结果表明:YD02菌落黑色或墨绿色,菌丝分支且产孢;为链格孢属(Alternaria Nees)菌株;其最佳发酵条件是以PDB培养基为基础,蔗糖4%,氯化铵0.6%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,p H5或p H9,培养温度28℃,装液量为60%,120 r/min发酵60 h;当镉浓度为140 mg/L时,YD02正常生长几乎停止。YD02菌株对瓜果腐霉病和苹果霉心病的病原菌具明显拮抗作用,抑菌率分别达到64.15%和71.68%。     

绿木霉(Trichoderma virens)T43对四种重要林木病原菌的抑制效果及抑菌机理

通过对峙培养和非挥发性代谢产物对病原菌生长的抑制作用,开展了木霉菌株T43及其抑菌活性物质抑制樟子松枯梢病、杨树烂皮病和苗木立枯病3种病害的4种病原菌效果的研究。从菌株T43发酵液乙酸乙酯提取物对各病原菌的3种保护酶(CAT、POD和SOD)活力影响和对细胞渗透调节物质(可溶性蛋白、可溶性糖和丙二醛)的含量影响,探讨了提取物对病原菌的抑菌机理。结果表明:木霉菌株T43及其代谢产物对供试林木病原菌均有明显的抑制作用,菌株T43发酵液乙酸乙酯提取物对病原菌3种保护酶活性均有不同程度的影响,可导致病原菌3种保护酶活性降低,尤其是SOD活性下降的最为显著。该提取物可以显著降低菌丝体可溶性糖和蛋白含量,提高丙二醛含量,破坏细胞的完整性,这可能是绿木霉T43发酵液乙酸乙酯提取物抑制病原菌生长的机理之一。     

表达vgb的糖多孢红霉菌载体构建与活性鉴定

目的为了在糖多孢红霉菌(Sac.erythraea)中表达透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb),发挥其在贫氧环境下与氧结合形成氧合态,而改变限氧时细胞原有的代谢方式,将vgb克隆于糖多孢红霉菌表达载体中。方法利用PCR技术克隆vgb,利用基因重组技术构建含有vgb的重组糖多孢红霉菌表达质粒,电穿孔法将vgb转化置糖多孢红霉菌中,鉴定采用SDS-PAGE电泳。vgb在重组糖多孢红霉菌表达产物的生物活性检测用Western blotting分析表示。结果克隆了含有vgb的重组糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV),分子量6.033 kb,筛选了重组糖多孢红霉菌株,重组菌株表达的血红蛋白能与1∶300的VHb抗体呈显色反应。结论vgb在糖多孢红霉菌中获得了表达,这对继续研究生产红霉素的工程菌改造,解决工业发酵工程菌高密度培养具有良好的应用前景。     

毒死蜱降解木霉菌对几种重要植物病原真菌的生防活性

木霉菌既是广泛应用的防治植物病害的生防菌,又是一类很有应用潜力的环境污染修复菌。针对分离筛选出的6株高效降解毒死蜱的木霉菌株,进行了土传植物真菌病害的生防活性试验。结果表明,在对峙培养条件下,供试木霉菌株对几种病原真菌均具有较为显著的抑制率,发酵滤液对多数病原真菌具有明显的抑菌作用。所有供试木霉菌株能在立枯丝核菌、灰霉、终极腐霉菌落上着生,并逐渐覆盖全部菌落;但不能在茄腐镰孢菌、尖孢镰孢菌、大丽轮枝菌上生长。真菌重寄生现象观察结果表明,供试木霉菌仅对立枯丝核菌具有明显的重寄生现象。研究结果表明,筛选出的高效降解毒死蜱的木霉菌菌株可对多种土传植物病原真菌具有良好的生防潜力。     

培养条件对茄链格孢产孢的影响

茄链格孢Alternaria solani在体外培养条件下不产生或产生极少量的分生孢子。研究了培养基、菌丝损伤、紫外线照射和温度变化对7个茄链格孢菌株产孢的影响,发现这些处理方法对供试大多数菌株的产孢都有显著影响,确立了茄链格孢大量产孢的最优条件。利用优化后的条件对160株采自不同地区的茄链格孢进行体外诱导产孢,发现120株可大量产孢,占总数的75%,产孢量为1.26×104–5.03×104个/cm2。     

少根根霉产孢能力、变种与发酵产物的相关性

【目的】探究少根根霉不同生态环境、不同地理位置、不同产孢能力和不同分类学变种的发酵产物多样性及相关性,为工业生产提供指导。【方法】代表性的68株少根根霉菌株于糯米培养基中进行液态发酵,利用高效液相色谱法测定各种发酵产物浓度,计算发酵产物间的Pearson相关系数,通过多因素方差分析和主成分分析解析各类菌株与发酵特性的相关性。【结果】总计检测到7种发酵产物,按照产量均值百分比从高到低分别是葡萄糖(70.96%)、乙醇(17.87%)、乳酸(6.63%)、麦芽糖(1.80%)、苹果酸(1.46%)、富马酸(0.92%)和甘油(0.36%)。麦芽糖独立代谢,其余6种产物分为2组,组间负相关：第一组为葡萄糖、乳酸和甘油,组内正相关;第二组为乙醇、苹果酸和富马酸,组内正相关。发酵特性与生态环境、地理位置的相关性较低,但与产孢能力、分类学变种高度相关。SM无孢菌株的发酵能力显著强于SM产孢菌株,尤其是菌株XY01957的葡萄糖产量高达138.30g/L,具有出色的生产潜力。原变种和东京变种的富马酸、苹果酸产量较低,而乳酸和甘油产量较高;德氏变种与前两个变种区分明显,富马酸、苹果酸产量较高,而乳酸和...     

Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架的制备及组织工程软骨的构建

研究经乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)处理的Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架材料的性能特点,并在体外构建组织工程软骨。从鸡软骨中提取Ⅱ型胶原,以不同浓度的EDC为交联剂通过冷冻干燥的方法制备Ⅱ型胶原与硫酸软骨素复合支架并测定其理化性质。将体外培养的新生兔关节软骨细胞接种在Ⅱ型胶原与硫酸软骨素复合支架上,观察软骨细胞在支架上的生长形态并检测支架上软骨细胞分泌的糖胺聚糖含量及Ⅱ型胶原含量。结果表明:采用EDC与硫酸软骨素交联增加了支架的稳定性,最适的交联剂质量浓度为7 mg/mL。软骨细胞在复合支架上增殖分化良好,并保持软骨细胞特异分化的表型,分泌Ⅱ型胶原与蛋白多糖(GAG)。培养14 d后已有软骨样组织形成。     

蜜环菌发酵液提取物对人参链格孢霉菌的抑制作用

为探究蜜环菌Armillaria mellea发酵液提取物的抗植物病原真菌作用,在预实验的基础上选取人参链格孢霉菌Alternaria panax作为供试靶标菌,确定蜜环菌发酵液乙酸乙酯提取物的抑菌效果及其作用机制。结果表明:蜜环菌发酵液乙酸乙酯提取物的MIC值为5 mg/mL,MFC值为20 mg/mL;人参链格孢霉菌孢子萌发抑制率与提取物浓度呈正相关,其孢子萌发EC50值为2.69 mg/mL;显微观察发现,蜜环菌乙酸乙酯提取物处理可明显破坏人参链格孢霉菌菌丝体微观结构。细胞膜通透性和相关生化指标研究结果表明:蜜环菌乙酸乙酯提取物处理后极大提升了人参链格孢霉菌细胞膜通透性,其孢外电导率、孢外核酸含量以及丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)含量显著提高,超氧化物歧化酶(SOD)与过氧化物酶(POD)活性在前期略升高后显著降低。据此推测蜜环菌发酵液提取物的抑菌机制为破坏链格孢霉菌菌丝细胞的膜系统,造成菌丝细胞成分的外流并导致胞内生化反应被破坏。     

香山黄栌枯萎病叶片真菌的分离与鉴定

利用微生物培养方法及多相分类鉴定技术,对分离自香山黄栌枯萎病叶片样品的真菌菌株进行分离与鉴定,共分离到丝状真菌22株,分属细极链格孢(Alternaria tenuissima)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、腊梅拟茎点霉(Phomopsis chimonanthi)和葡萄茎枯病菌(Phoma glomerata)4个菌种,并保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。其中细极链格孢(11株)和腊梅拟茎点霉(7株)为优势菌种。细极链格孢、腊梅拟茎点霉、葡萄茎枯病菌均为已报道的植物病原菌,可能为香山黄栌枯萎病潜在病原菌。