猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒三型、猪流感病毒三重RT-PCR检测方法建立及初步应用

【背景】猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪圆环病毒三型(porcine circovirus type III，PCV3)和猪流感病毒(swine influenza virus，SIV)是3种影响猪只健康的重要呼吸道病原，对养猪业造成严重的经济损失，因此需要建立高效快速的检测方法，以了解3种病原在国内的流行情况。【目的】建立能同时检测PRRSV、PCV3和SIV的三重RT-PCR方法，为3种病毒的流行病学调查和疾病监控提供技术支持。【方法】针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，猪圆环病毒三型(PCV3)，猪流感病毒(SIV)基因序列，分别设计3对特异性引物，扩增PRRSV M和N基因(436bp)、PCV3 Cap基因(619bp)和SIV M基因(199bp)。通过对退火温度和引物浓度优化建立三重RT-PCR检测方法，并对建立的多重检测方法进行特异性、敏感性、重复性试验验证。【结果】建立了能够同时快速检测PRRSV、PCV3、SIV的三重RT-PCR方法，而对猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type II，PCV2)、猪细小病毒2型(porcine parvovirus II，PPV2)、猪细小病毒3型(porcine parvovirus III，PPV3)和猪细环病毒1型(torque teno sus virus I，TTSuV1)等6种病原的扩增均为阴性，特异性较好。敏感性结果显示，同时检测PRRSV、PCV3、SIV这3种病原的检测下限为100copies/μL，批间与批内试验结果均一致。用该方法对黑龙江省部分地区猪场的67份临床病料进行检测，结果显示PRRSV阳性率为16.5%，PCV3阳性率为10.5%，SIV阳性率为10.5%，而且存在混合感染。【结论】该方法灵敏度高、特异性强，能够应用于临床样品检测，有效预测病原的流行情况。

Development and preliminary application of a triplex RT-PCR assay for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine circovirus type III, and swine influenza virus