白介素-17A在小鼠慢性胰腺炎中的作用研究

目的:研究白细胞介素-17A在小鼠慢性胰腺炎模型中的表达及其对小鼠星状细胞的影响。方法:建立雨蛙肽诱导的小鼠实验性慢性胰腺炎动物模型,利用实时荧光定量PCR、ELISA、免疫组化和Western-blot等手段检测白介素-17A在雨蛙肽诱导的小鼠慢性胰腺炎模型中的表达变化及免疫活性。用重组白介素-17A作用于小鼠胰腺星状细胞,检测其对星状细胞活化的作用,并进一步探究其对促胰腺纤维化炎症因子白介素-6、白介素-1β、TGF-β在mRNA水平的表达变化。结果:慢性胰腺炎胰腺组织中白介素-17A受体IL-17RA及IL-17RC mRNA水平的表达较正常胰腺明显升高,慢性胰腺炎小鼠胰腺组织中IL-17A蛋白水平较正常小鼠明显升高,CP小鼠血清中IL-17A蛋白水平(56.40±10.50 pg/L)较NC组(27.88±5.74pg/L)亦明显升高,IL-17A在正常胰腺组织中鲜有表达(8.9±2.72%),而在CP组织中呈强阳性表达(55.84±5.71%),其免疫活性主要定位于间质炎性细胞及导管样复合体中;重组白介素-17A可促进小鼠星状细胞活化,并直接诱导星状细胞表达白介素-6、白介素-1β以及TGF-β等促纤维化细胞因子。结论:白介素-17A在雨蛙肽诱导的小鼠慢性胰腺炎模型中表达上调,并可能通过诱导小鼠星状细胞表达促炎细胞因子白介素-6、白介素-1β和TGF-β,促进胰腺星状细胞活化以及胰腺纤维化。     

阿胶对COPD模型小鼠的保护作用以及对MMP-2、MMP-9、TGF-β1水平的影响

利用香烟烟雾暴露法建立慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠模型,观察阿胶对模型小鼠气道重塑及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、转化生长因子-β1(TGF-β1)因子表达的影响,初步探讨其治疗慢性阻塞性肺疾病的作用机制。将24只雄性C57BL/6小鼠随机分为3组,分别是对照组、模型组和阿胶组,模型组利用香烟烟雾暴露法建立COPD小鼠模型,阿胶组在模型组基础上每日按照3 g/kg体重给予0.2 m L阿胶烊化液灌胃。12周后采用ELISA法检测肺泡灌洗液中MMP-2、MMP-9、TGF-β1蛋白水平,利用RT-PCR法检测肺组织中MMP-2、MMP-9、TGF-β1 m RNA水平。结果表明,模型组小鼠气道壁和平滑肌明显增厚,气道管腔狭窄,黏膜下层稍变宽,有部分上皮细胞脱落,气道周围有炎性细胞浸润,肺间质明显增厚,阿胶组上述改变较模型组明显改善;模型组肺脏MMP-2、MMP-9、TGF-β1 m RNA水平和蛋白水平均显著升高(p0.01),阿胶能显著降低肺泡灌洗液和肺脏组织中MMP-2、MMP-9、TGF-β1的表达水平(p0.01)。本研究表明香烟烟雾暴露会导致模型小鼠呼吸道和肺脏组织细胞外基质的降解和沉积失衡,造成气道重塑和肺实质破坏及间质增生,MMP-2、MMP-9、TGF-β1的异常表达在这一过程中发挥了重要作用,阿胶能通过调节MMP-2、MMP-9、TGF-β1的异常表达,有效抑制气道炎症和气道重塑的发生。     

Taqman多重实时荧光定量PCR检测裸鼠肿瘤转移模型中肿瘤转移率方法的建立

目的:建立基于多重荧光定量PCR技术的动物体内恶性肿瘤转移模型中肿瘤转移率高效检测的方法。方法:以人和小鼠的β2m基因为目标,设计相应的引物和Taqman探针;分别抽提人涎腺腺样囊性癌ACC细胞和小鼠Sp2/0细胞的基因组DNA作为模板,建立两物种双重荧光定量PCR检测方法,且分别以人和鼠定量基因检测为参照考察双重荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和精确性,并与传统转移灶称重计算肿瘤转移率的方法进行比较。结果:双重Taqman实时荧光定量PCR检测方法具有很好的特异性和较高的灵敏度(0.006ng/μl DNA),重复性较好(批间平均CV=0.036),有较强稳定性,比传统称重法更高效,更准确。结论:双重荧光定量PCR能够在同一反应体系下同时对动物组织中人肿瘤转移灶和周围组织进行快速准确的定量检测,计算出肿瘤转移率,具有经济、快速、特异性强等优点,在肿瘤动物模型肿瘤转移率检测方面具有很高的应用价值。     

玉米黑粉菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立利用实时荧光定量PCR对玉米黑粉菌[Ustilago maydis(DC.)Corda]快速定量检测的方法。方法:以玉米黑粉菌βactin基因为内参基因,以含有βactin基因的具浓度梯度pMD19 T-Simple质粒为标准品,接种黑粉菌后不同时间点的玉米叶片作为样本用以检验该方法的实用性。结果:建立了利用实时荧光定量PCR对玉米黑粉菌进行定量分析的方法。该方法重复性好、特异性强、灵敏性高,对玉米黑粉菌的最低检出率为19拷贝/反应,可以准确检测经注射接种后1 d的玉米叶片中的黑粉菌量。结论:建立的实时荧光定量PCR方法可用于玉米黑粉菌菌量的检测。     

多重定量PCR检测PDX模型小鼠细胞浸润比例的构建

摘要 目的：建立一种快速、灵敏的方法检测人源异种移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX)中小鼠细胞的浸润比例,以确保PDX模型的保真性。方法：选择人和小鼠的特异性基因PSMB2、Ren 2的部分区段设计引物和探针,利用多重荧光定量PCR（TaqMan探针法）在单管中检测PDX模型中小鼠-人细胞的相对量。另外,构建了不同浸润比例的标准品作为阳性对照,根据标准曲线进行样本比例计算。结果：建立了一种多重荧光定量PCR检测PDX模型小鼠细胞浸润比例的检测方案,该方案显示,PDX模型中不同比例的人鼠混合样本与△Ct值（Ct（小鼠）-Ct（人））之间线性关系良好,相关系数r²为0.9998。利用该方法对14个样本进行检测,结果表明在绝大部分样本中小鼠细胞的比例低于30.00%,平均小鼠细胞比例为13.38%。结论：本研究建立的多重定量PCR检测PDX模型中小鼠细胞浸润比例的方法能够根据△Ct值快速、准确推断PDX模型中人、小鼠细胞的比例。该方法操作简单、耗时短、结果可靠,是一种快速、灵敏的PDX模型的质控方案。     

重组截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对肝纤维化大鼠的治疗作用研究

目的:研究截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对肝纤维化大鼠的治疗作用。方法:取含有重组截短型TGF-βⅡ型受体载体的大肠杆菌BL21,通过培养繁殖,诱导,纯化得到重组截短型TGF-βⅡ型受体蛋白。使用CCl4诱导的方法来制备肝纤维化大鼠模型,观察截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对大鼠肝纤维化的影响。SDS-PAGE检测纯化的截短型TGF-βⅡ型受体蛋白。生化检测血清谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,ALT)及谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase,AST)含量。用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法和免疫荧光方法来检测各组大鼠肝组织中的α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA),1型胶原(collagen1,Col1)和4型胶原(collagen4,Col4)的表达情况。用HE,MASSON,PAS这三种病理学染色的方法来观察各组大鼠肝纤维化的变化。结果:SDS-PAGE检测结果显示,纯化后获得高纯度截断型TGF-βⅡ型受体蛋白。截短型TGF-βⅡ型受体蛋白治疗组可以减少血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量。截短型TGF-βⅡ型受体蛋白治疗组可以降低肝组织中α-SMA、FN、Col1和Col4的mRNA和蛋白质的表达。三种病理学染色的方法显示,与肝纤维化大鼠模型组相比,治疗组的纤维化程度明显减轻。结论:重组截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对大鼠肝纤维化的程度有抑制作用,为治疗肝纤维化及其他纤维化疾病提供了一个潜在的治疗手段。     

不同途径下MIMP对炎症性肠病小鼠的肠屏障及炎症因子的改善作用

目的通过葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)模型并观察不同途经下乳酸杆菌微小膜蛋白(MIMP)对炎症性肠病小鼠的肠炎的影响。方法 C57BL/6小鼠40只根据DSS和MIMP不同的干预组合将其分为4组:诱导肠炎+MIMP腹腔注射组(n=10)、诱导肠炎+MIMP灌胃组(n=10)、单纯诱导肠炎组(n=10)、空白对照组(n=10),DSS干预浓度为2.5%。干预期间,观察小鼠体重变化情况,腹泻、血便、死亡等发生率,各组小鼠活体肠道通透性差异,比较肠道长度及肠上皮组织病理学改变,应用荧光定量PCR反应观察各组小鼠肠道中的炎症因子的表达,应用免疫组织化学染色观察各组小鼠肠道上皮中IL-23的表达。结果 MIMP腹腔注射组以及灌胃组小鼠整体情况较好,体重减轻程度轻,腹泻、便血及死亡发生率低;MIMP干预可显著改善肠道通透性(P0.05),并降低肠道萎缩程度,同时降低小鼠肠道病理评分及组织学评分,可显著降低小鼠肠道中促炎性细胞因子(IL-23p19、IL-17A、IL-12p40)的表达(P0.05),并提高抑炎性细胞因子(IL-10)的表达(P0.05),免疫组化显示MIMP可显著降低小鼠肠上皮细胞中IL-23的表达水平。结论 MIMP腹腔注射及灌胃对IBD小鼠的炎症状态及肠道屏障功能有显著的改善作用,并可显著降低促炎性细胞因子的表达,提高抑炎性细胞因子的表达。     

TGF-β/Smad信号通路在肾小球硬化模型中表达的意义

目的:通过观察在肾小球硬化动物模型中TGF-β、Smad2和Smad7蛋白和mRNA表达的意义,了解TGF-β/Smads信号通路在肾小球硬化中的作用.方法:制备肾小球硬化动物模型,检测24小时尿蛋白定量、血浆白蛋白及血尿素氮水平,观察肾组织形态学改变;免疫组织化学检测TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白水平;荧光定量PCR检测TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA的水平结果:TGFβ1、Smad2和Smad7正常情况下普遍在肾小球系膜细胞、肾小管上皮及间质细胞中有少量表达;模型组4周时TGFβ1和Smad2蛋白表达增加,Smad7蛋白表达下降;6～8周时TGF-β1和Smad2蛋白表达明显增加,Smad7蛋白表达明显下降.模型组4周时TGF-β1和Smad2 mRNA出现表达上调,6～8周TGF-β1和Smad2 mRNA表达明显增加.4周时Smad7 mRNA表达下调,6～8周Smad7 mRNA表达明显下降.模型组与对照组比较有显著性差异(p＜0.01).结论:TGF-β/Smad信号通路参与了肾小球硬化的纤维化进程,Smad7是TGF-β/Smad信号通路抑制性调控因子,可能为治疗肾小球硬化提供治疗手段.     

转化生长因β1基因真核表达质粒的构建及其在小鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的：构建转化生长因β1（TGF-β1）表达载体,在骨髓间充质干细胞（BMSC）中表达。方法：以小鼠肺组织cDNA为模板,PCR扩增TGF-β1基因,并将其插入pCDH1-MCS1-EF1-copGFP载体质粒,转化感受态大肠杆菌DH5α,抽提质粒,经PCR和测序鉴定后转染BMSC,利用激光共聚焦显微镜和Western印迹对其表达进行检测。结果：经PCR及测序鉴定,构建入载体质粒的基因为TGF-β1基因,pCDH1-TGFβ1-EF1-copGFP重组质粒能在BMSC中表达。结论：构建了pCDH1-TGFβ1-EF1-copGFP重组质粒,且能表达于BMSC,为进一步研究TGF-β1影响间充质干细胞的生理功能奠定了基础。     

Lefty1对小鼠胚胎干细胞分化过程的影响

目的:研究Lefty1在小鼠胚胎干细胞分化过程中的作用。方法:根据染色质免疫沉淀测序结果,在临近Lefty1转录起始位点以及与之相距10 kb的上游区域有TGF-β信号通路Smad2/3蛋白的四个结合区域,通过CRISPR/Cas9方法获得四个区域敲除的单克隆细胞,利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测各细胞中Lefty1的转录水平,并用TGF-β信号通路的激活剂AC和抑制剂SB分别处理敲除的细胞,检测其对TGF-β信号的响应,最后通过胚状体形成实验,检测敲除细胞系在中内胚层分化过程中的标志分子Gsc和Mixl1的表达。结果:利用CRISPR/Cas9方法成功获得不同区域敲除的单克隆细胞,与野生型E14细胞相比,四种区域敲除的细胞中Lefty1 RNA含量明显降低,并且在干细胞状态和分化状态下,敲除细胞系对TGF-β信号的响应减弱。在胚状体形成的实验中,与野生型E14细胞相比,敲除细胞系在分化过程中Lefty1表达的基础水平明显降低,中内胚层分化的标志分子Gsc和Mixl1转录水平也明显下降。结论:在胚胎干细胞中,Lefty1转录起始位点附近以及上游10 kb的这四段区域通过TGF-β信号通路对Lefty1的转录发挥调控作用,从而影响中内胚层分化过程中的标志分子Gsc和Mixl1的表达。     

SYBR green实时荧光定量PCR检测微小RNA21的方法建立及在食管鳞癌中的应用

目的:建立SYBR green实时荧光定量PCR检测微小RNA miR-21的技术平台及应用。方法:设计微小RNA21和U6的的颈环结构反转录引物和PCR扩增引物,以U6为内参利用SYBR green实时荧光定量PCR法检测小鼠各器官中的微小RNA21的含量。提取16例食管鳞癌患者的肿瘤组织及其近旁组织中的总RNA,检测其微小RNA21表达水平。结果:SYBR green实时荧光定量PCR检测U6和微小RNA21含量的熔解曲线单一,PCR产物特异。在Balb/c小鼠的4种器官中,肝脏、脾脏、肾脏分别为脑组织的8.71、5.38、3.47倍。16对食管鳞癌患者的样本中,14例微小RNA21的拷贝数高于其近旁组织约10.58倍(p0.01)。结论:此研究成功建立了SYBR green荧光定量PCR法检测小鼠和人微小RNA-21含量的技术平台,为进一步阐述miR-21在食管鳞癌的发生中的作用提供了新方向。     

实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠拷贝数

目的利用实时荧光定量PCR法鉴定转基因小鼠外源基因插入拷贝数。方法以TG-CARK转基因首见鼠为研究对象,选取小鼠的高度保守基因Fabpi为内参,利用绝对定量的实时荧光PCR法鉴定转基因小鼠拷贝数,并与传统的Southern blot方法的定量结果进行比较。结果实时定量PCR鉴定的转基因拷贝数与Southernblot法完全一致,三只TG-CARK首见小鼠的拷贝数分别为1,7,45。结论实时定量PCR技术具有高准确性、高稳定性、高通量和低成本的优点,是比传统杂交技术更好的鉴定小鼠转基因拷贝数的方法。     

上调miR-200c通过抑制TGF-β1/Smad3通路减轻单侧输尿管梗阻小鼠肾纤维化

目的观察mi R-200c在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)小鼠肾组织中的表达变化及其对UUO小鼠肾间质纤维化和TGF-β1/Smad3通路的影响。方法 45只C57BL/6J小鼠,随机数字表法分为假UUO组、UUO组、UUO+agomi R-200c组,每组15只。假UUO组仅游离左侧输尿管但不结扎;UUO组和UUO+agomi R-200c组通过结扎左侧输尿管建立的肾纤维化模型,手术后第1、7、14d两组小鼠分别给予生理盐水和agomir-200c尾静脉注射。第21d后处死全部小鼠,取血测定血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)。取小鼠梗阻侧肾脏组织,HE染色和Masson染色评价肾小管间质损伤和肾间质纤维化损伤程度,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测肾组织mi R-200c的表达,Western blotting检测肾组织TGF-β1、Smad3及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白的表达。结果与假UUO组比较,UUO组小鼠肾组织mi R-200c的表达水平明显降低,血清Scr、BUN水平明显升高,肾小管间质损伤病理评分升高,肾胶原容积分数(c VF)增加,肾组织中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平明显升高。与UUO组比较,UUO+agomi R-200c组小鼠肾组织mi R-200c的表达明显增高,血清Scr、BUN水平明显降低,肾小管间质损伤病理评分下降,肾胶原容积分数减少,肾组织中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平明显降低。结论上调mi R-200c能够通过抑制TGF-β1/Smad3通路减轻UUO小鼠肾间质纤维化。     

柞蚕雄蛾液对酒精肝纤维化小鼠的预防作用及其机制研究

目的:观察柞蚕雄蛾液对酒精诱导的小鼠肝纤维化的预防作用并探讨其可能的机制。方法:选择40只SPF级C57BL/6J小鼠,随机分为对照组、模型组、柞蚕雄蛾液低剂量组、柞蚕雄蛾液高剂量组,每组各10只。除对照组外,其他各组均通过酒精灌胃建立酒精性肝纤维化模型。柞蚕雄蛾液低剂量组、柞蚕雄蛾液高剂量组每天先予柞蚕雄蛾液灌胃,两小时后予以酒精灌胃。16周后,所有小鼠禁食12 h后通过眼球取血后处死,取出肝脏。采用HE和Masson染色观察肝组织病理改变并进行肝纤维化分级;检测血清中ALT及AST的含量,免疫组化法检测肝组织转化生长因子β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、结缔组织生长因子(CTGF)的表达,Western blot法测定肝组织中Smad2/3的蛋白表达。结果:柞蚕雄蛾液低剂量组镜下只见少量点状坏死和炎细胞浸润,肝组织损伤比模型组明显减轻。与对照组比较,模型组TGF-β1、TIMP-1、CTGF、Smad2/3的表达均明显增高(P0.001),血清ALT及AST水平显著升高(P0.001);与模型组比较,柞蚕雄蛾低剂量组TGF-β1、TIMP-1、CTGF、Smad2/3表达明显降低(P0.001),血清ALT及AST水平显著下降(P0.001)。结论:柞蚕雄蛾液对酒精诱导的小鼠肝纤维化具有显著的预防作用,低剂量柞蚕雄蛾液较高剂量柞蚕雄蛾液可能更有效,其机制可能与调控TGF-β1/Smad2/3信号转导通路,下调TIMP及CTGF抑制HSC的活化与增殖有关。     

子宫内膜异位症纤维化小鼠模型构建方法及其应用

目的探索一种高效的子宫内膜异位症纤维化小鼠模型建立方法及其评价方法。方法改良的腹腔注射法构建BALB/c小鼠子宫内膜异位症纤维化模型;收集小鼠腹腔灌洗液,ELISA试剂盒检测灌洗液TGF-β1水平;对小鼠腹腔粘连程度进行评分; HE染色验证子宫内膜异位症模型是否成功; Masson染色检测异位灶胶原纤维沉积情况,评估其胶原沉积程度;免疫组化法检测纤维化相关蛋白E-cadherin、Collagen I、α-SMA、smooth muscle myosin heavy chain II (SMMHC-II)的表达情况,评估异位灶纤维化程度。结果改良腹腔注射法构建小鼠子宫内膜异位症纤维化小鼠模型成功率可达到100%。小鼠腹腔灌洗液TGF-β1水平随造模时间延长有明显升高。Masson染色和纤维化相关蛋白免疫组化染色观察到子宫内膜异位症小鼠腹腔存在纤维化表型。结论改良的腹腔注射法构建小鼠子宫内膜异位症纤维化模型成功率高,腹腔灌洗液TGF-β1水平、Masson染色和纤维化相关蛋白E-cadherin、Collagen I、α-SMA、SMMHC-II免疫组化染色能够评价小鼠子宫内膜异位症盆腔纤维化程度。     

麦门冬汤加减方对特发性肺纤维化小鼠PI3K/AKT/mTOR通路的调控

摘要 目的：探讨麦门冬汤加减方对特发性肺纤维化小鼠转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、胶原I(Collagen type I, COL1A)表达的影响以及对PI3K/AKT/mTOR通路的调控作用。方法：将120只SPF级ICR小鼠随机分入空白组、模型组、吡菲尼酮组和麦门冬汤加减方组,用博来霉素(5 mg/kg)建立特发性肺纤维化模型,24 h后分别给予相应的药物治疗。吡菲尼酮组和麦门冬汤加减方组小鼠分别灌胃吡菲尼酮和中药麦门冬汤加减方,空白组和模型组小鼠灌胃生理盐水,各组均连续给药3周(21d)后取材。观察指标：各组小鼠的肺系数;肺组织病理变化;肺组织TGF-β1、α-SMA、COL1A的表达量(免疫组化);肺组织中α-SMA、COL1A、p-PI3K、p-AKT、mTOR的蛋白表达量(Western blot);肺组织中TGF-β1、α-SMA、COL1A的mRNA表达量(qPCR)。结果：模型组小鼠的肺系数显著增加,麦门冬汤加减方组肺系数显著降低;模型组小鼠肺组织中有较多炎性细胞浸润,胶原沉积明显,肺泡结构破坏严重,麦门冬汤加减方组小鼠肺组织病理改变较模型组明显减轻,胶原沉积大量减少,肺泡结构逐渐修复;麦门冬汤加减方组较模型组α-SMA、COL1A、TGF-β1的蛋白表达量显著降低(P＜0.01);麦门冬汤加减方组较模型组α-SMA、COL1A、p-PI3K、p-AKT、mTOR的蛋白表达量显著下调(P＜0.01);麦门冬汤加减方组较模型组α-SMA、COL1A、TGF-β1的mRNA表达量显著降低(P＜0.01)。结论：麦门冬汤加减方能有效改善博来霉素诱导的特发性肺纤维化,降低α-SMA、COL1A、TGF-β1的表达,可能是通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制上皮间充质转化,减少细胞外基质沉积而发挥作用。     

黄连解毒汤对2型糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其机制探讨

目的:探讨黄连解毒汤(HLJDT)对链脲佐菌素(STZ)诱导的2型糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其可能的机制。方法:将雄性Wistar大鼠随机分为对照组(n=10)和用STZ诱导的模型组。将成功造模的大鼠随机分为模型组(n=12)、低、中和高剂量组(每组n=12),分别给予对照组和模型组灌胃饮用水,而给其他三组分别灌胃HLJDT(60、120和240 g·kg-1·d-1)。12周后处死大鼠并测量生化指标,实时荧光定量PCR和western blot检测TGF-β1,p38MAPK和Caspase-3的基因和蛋白表达。结果:与模型组比较,HLJDT中高剂量组体重、肾脏重、肾重体重比和FBG显著提高。与对照组比较,模型组的TG、BUN、Scr和UP 24 h均显著提高;而与模型组比较,HLJDT高剂量组均显著降低TG、BUN、Scr、UP 24 h和MDA的水平,升高NO,SOD的水平。另外,TGF-β1,P38MAPK和Caspase-3的表达,模型组显著高于对照组,但经过HLJDT的治疗后,与模型组比较有显著降低。(所有取值为P0.05,P0.01)。结论:我们的研究提供了HLJDT是通过调控血糖、降低氧化应激的水平和下调TGF-β1,p38MAPK和Caspase-3的表达来保护DN大鼠的实验依据。     

miRNA的重要调节者Dicer和Drosha与子宫内膜异位症的相关性研究

利用荧光定量PCR和Western blot检测证实,在异位的子宫内膜组织中Dicer和Drosha的表达低于在位子宫内膜组织,随后体外培养在位子宫内膜组织,采用siRNA干扰Dicer和Drosha,发现与干扰对照组相比,子宫内膜细胞的增殖加快而凋亡减少;同时ELISA检测显示转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)的表达上调;Western blot检测显示凋亡抑制蛋白Bcl2表达增加而促凋亡蛋白Bax的表达减少．结果表明,miRNA的重要调节者Dicer和Drosha可以影响TGF-β1及Bcl2/Bax的表达进而影响细胞的增殖和凋亡,从而参与了子宫内膜异位症的形成．     

高表达Snail蛋白诱导黑色素瘤EMT细胞模型的构建及鉴定

目的:构建稳定表达Snail蛋白的可用于肿瘤上皮-间质化研究的肿瘤细胞模型.方法:采用亚克隆方法从质粒pCMV6-mSnail中PCR扩增小鼠Snail基因,连接至表达质粒pL-tdTomato-Neo,筛选重组质粒并经双酶切及测序鉴定.构建成功的重组质粒pL-tdTomato-mSnail转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选稳定细胞株.采用荧光定量PCR和Western blot技术检测胞内Snail及上皮/间质标志物的变化.建立裸小鼠皮下移植瘤模型,活体成像系统观测移植瘤.结果:重组质粒pL-tdTomato-mSnail成功构建,其稳定转染株B16/dT-mSN胞体发出强烈红色荧光.胞内Snaill水平显著上调,E-钙粘蛋白下调,波形蛋白表达上调,呈现典型的上皮-间质化表型.结论:成功获得稳定高表达小鼠Snail蛋白的EMT细胞模型,且可用于体内外荧光成像观测,为研究Snail蛋白在介导肿瘤EMT过程中的生物作用提供了重要的实验工具.     

基于荧光定量PCR扩增反应的SNP测定法

建立一种利用荧光定量PCR扩增反应进行单核苷酸多态性(SNP)快速测定的方法.以人β肾上腺素受体2基因中的Arg16Gly为研究对象,利用荧光染料SYBRGreenⅠ标记定量PCR产物,通过PCR生长曲线和融解曲线分析结果进行SNP分型.为提高SNP测定的特异性,分别在野生型和突变型等位基因的特异性引物3′端倒数第3个碱基位置,引入了一个人为错配碱基,使引物的错误延伸率显著降低,大大提高了SNP分析的准确性.通过DNA测序验证荧光定量PCR对β肾上腺素受体2基因中Arg16Gly分型结果的准确率.实验结果表明,所建立的方法操作简便,结果准确,适合进行大规模样品的SNP检测工作.