外力作为信号诱导基因的选择性剪接与力生长因子表达

许多种类的细胞都响应力信号,人们将这些细胞称为力效应细胞(mechanocyte).应力可引起细胞在基因水平或表达水平的调控,其中胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGFⅠ)是力学敏感因子.对骨骼肌的长期拉伸实验发现,IGF-Ⅰ不仅表达量受到拉伸刺激的调控,而且存在多种变异体形式,其中一种对力刺激敏感,只在拉伸作用下产生,命名为力生长因子(mechano growth factor,MGF).进一步研究发现,MGF能激活卫星细胞、促进成肌细胞增殖,在治疗肌损失、预防心肌损伤和修复神经损伤等方面有重要的作用.机械拉伸也可以使成骨细胞表达MGF,研究表明,对成骨细胞施加应变为15%的周期性拉伸刺激,细胞的IGFⅠ表达量增加,同时表达MGF剪接变异体.对MGF的深入研究可望在疾病治疗和组织工程修复领域取得广泛的应用.     

力生长因子及其E肽对成骨细胞分化的影响

力生长因子(mechano growth factor,MGF)是新近发现的一种生长因子,由Igf-1基因剪接变异产生,拉伸刺激会促使成骨细胞表达力生长因子.比较分析了MGF及其羧基端E肽(MGF-Ct24E)对成骨细胞前体细胞MC3T3-E1分化的影响.结果显示:MGF和MGF-Ct24E具有显著激活胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)的作用,并降低了成骨细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的表达,促进了骨桥蛋白(OPN)的表达,减少了核心绑定因子(corebinding factor1,Cbfα-1)的核转运量,对成骨细胞的分化具有延迟效应,这种效应通过抑制剂PD98059抑制Erk1/2的活化得到逆转;MGF还能显著激活磷脂酰肌醇3-激酶信号通路中的蛋白激酶B(Akt),该活化作用对成骨细胞分化是必需的,钙沉积分析显示长期培养下的细胞MGF促进了矿化节结的形成.这些结果说明,MGF-Ct24E对成骨细胞的分化具有抑制作用,这种作用与Erk1/2的活化有关,MGF因为包含E肽和IGF-1部分,能分别激活Erk1/2和Akt,因此对成骨细胞分化表现出双重效用,在成骨细胞分化早期,具有一定的延迟效应,而在分化晚期对成骨...     

力生长因子表达调节及其功能机制

力生长因子(mechano growth factor,MGF)是胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1,IGF-1)的选择性剪接变异体,具有力敏感性.本文综述了MGF在组织细胞中的表达、调节及其功能机制的最新研究.首先阐述了MGF在多种细胞和组织中的表达和功能,其次说明MGF表达受应力、损伤、激素、温度等多种因素的调节.综述各项研究显示,MGF不依靠IGF-1R发挥作用,而是直接激活骨骼肌卫星细胞,促肌细胞增殖,进而促骨骼肌肥大,修复受损肌肉. 通过激活Erk磷酸化促成肌细胞增殖、保护心肌细胞,上调血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）,激活蛋白激酶Cε(protein kinase Cε,PKCε）和NF-E2-相关因子2（NF-E2-related factor2,Nrf2 )发挥保护神经的作用.另外,MGF发挥作用还可能与Wnt/β-catenin信号有关.对MGF作用及其作用机制深入研究有助于未来MGF在临床的运用.     

雌激素对成骨细胞增殖及IGF-2表达的调控作用

目的 探讨雌激素对大鼠成骨细胞功能的影响及胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2,IGF-2）表达的调控机理。方法应用1×10^-10mol／L、1×10^-8mol／L、1×10^-6mol／L浓度的雌二醇（estradiol,172）分别作用原代培养的新生大鼠颅盖骨成骨细胞24h;采用MTT法和对硝基酚磷酸盐法检测成骨细胞增殖能力和细胞中碱性磷酸酶（ALP）活性;应用实时定量PCR和Western印迹杂交分析成骨细胞中IGF-2的mRNA和蛋白质的表达规律。结果1×10^-6mol／L浓度的磁使大鼠成骨细胞增殖能力和ALP活性分别增加了67％和55％,使IGF-2的mRNA与蛋白质的表达水平分别增加了90％和140％,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论雌激素对成骨细胞中IGF-2基因的表达具有正性调控作用。成骨细胞中IGF-2的高表达可能与雌激素调节成骨细胞增殖和分泌功能相关。     

力生长因子在大肠杆菌中的表达及活性分析

MGF(Mechano-growth factor)是一种IGF-1变体形式, 研究发现该因子具有应力敏感性, 并且具有促进肌肉肥大、再生以及神经损伤修复的功能。通过RT-PCR从拉伸刺激的人成骨细胞中克隆MGF cDNA序列, 并去除5'端9 bp的序列, 使N端缺少对肠激酶(Enterokinase, EK)具有抑制作用的脯氨酸, 将截短型MGF (des(1-3) MGF) cDNA序列克隆入pET32a(+)质粒, 构建重组表达质粒。重组质粒转化E. coli BL21(DE3), 在30oC培养下以可溶形式表达融合蛋白Trx/ des(1-3)MGF, 采用离子交换层析和Ni2+金属亲和层析, 获得纯度95%以上的融合蛋白。再对融合蛋白EK酶切, rpHPLC分离获得纯度达98%的des(1-3)MGF, SDS-PAGE电泳及质谱分析蛋白分子量与理论值相符。生物活性实验显示, 所制备的des(1-3)MGF比des(1-3)IGF-1更显著的促进MC3T3-E1细胞的增值和迁移。     

对数生长与G0期人包皮成纤维细胞Stat1对INF—α刺激反应的差异

Stat1（信号转导与转录活化子1）的激活与刺激因子和细胞组织类型有关,它的活化受体有组织分布特异性,本研究比较G0期和对数生长周期两个不同状态体外培养的人包皮成纤维细胞受到干扰素（INF－α）刺激后Stat1基因mRNA、蛋白质表达以及蛋白质合成效率的差异。结果表明：成对数生长的细胞Stat1的mRNA表达量较对照组增加达10倍左右,蛋白质表达增加3－4倍左右;G0期细胞Stat1的mRNA表达量较对照组增加约3－4倍,蛋白质表达增加约3－4倍;对数生长细胞Stat1蛋白质合成效率明显降低,在翻译水平可能有调控,以上结果提示对数生长和G0细胞对INF－α刺激反应有差异。     

IGF-1剪接变构体:力生长因子

力刺激与基因表达之间的联系是生理学研究中一个新的重要领域。从基因表达水平研究力学信号的影响有着特殊的重要意义,生物有机体的存在是基因表达的结果,而力在生命活动的整个过程发挥着作用。在骨骼肌中,力刺激诱导胰岛素样生长因子-1(IGF-1)发生选择性剪接,产生能够激活卫星细胞而使细胞增殖的力生长因子(mechano growth factor,MGF),以及能促使细胞分化而形成肌管的肌肉型IGF-1(IGF-1Ea),这两种自分泌的局部生长因子在肌肉修复与再生中起着重要作用。     

碱性成纤维细胞生长因子对脑微血管内皮细胞血管新生基因谱和环加氧酶-2表达的影响

本文研究了碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）对小鼠脑微血管内皮细胞（microvascular endothelial cell, MVEC）株bEnd．3中血管新生相关基因表达谱的改变,并重点从mRNA、蛋白质和细胞水平检测bFGF对血管新生旁观分子环加氧酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）表达的影响。用特异性小鼠血管新生基因芯片高通量检测bEnd．3细胞基因谱表达的改变,分析促血管新生基因及抑制血管新生的基因表达谱的变化;用RT—PCR、Western blot、免疫细胞化学等方法分别从mRNA、蛋白质和细胞水平检测COX-2表达变化及细胞内的定位。结果发现用10ng／ml的bFGF刺激bEnd．3细胞2h后多种促血管新生基因表达明显上调,如Adamtsl、MMP-9、Ang-1、PDGFB、G—CSF、FGFl6、IGF-1等分别上调3、8、120、5．2、4．5、1．7、2．7倍。与此同时,多种抑制血管新生的基因表达相应下调,如TSP-3、TIMP-2、TGFβ1等表达分别下调3．4、1．5和3．5倍。RT-PCR和Western blot的结果证实,bFGF可以上调COX-2mRNA的表达和蛋白质的合成。免疫组化的结果表明,COX-2主要分布在胞浆。以上结果提示：bFGF具有上调促血管新生基因表达,下调抑制血管新生基因表达的作用,两者协同作用,促进血管新生。同时bFGF还可以明显促进血管新生旁观分子COX-2mRNA的表达和蛋白质的合成。本文讨论了bFGF引起MVEC内COX-2表达上调的意义。     

外源性VEGF对结肠癌细胞SW480蛋白质变化的影响

利用RT-PCR发现结肠癌细胞存在血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)的表达,随后采用外源性VEGF对结肠癌细胞SW480进行体外刺激,流式细胞仪检测到结肠癌细胞刺激后快速进入分裂期,同时提取VEGF作用前后的结肠癌细胞总蛋白,蛋白质组学研究,发现存在明显的蛋白质变化,其中鉴定出10个差异蛋白质.提示外源性VEGF可以促进结肠癌细胞增殖并对肿瘤细胞蛋白质组产生明显的影响.     

卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞相互作用对VEGF和bFGF表达的影响

目的探讨卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞(HPMC)相互作用对血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响。方法用Millicell将卵巢癌细胞SKOV3与HPMC进行非接触性共培养,用RT-PCR检测细胞VEGF及bFGF mRNA表达,ELISA检测细胞条件培养液中VEGF及bFGF蛋白水平。结果共培养后,SK-OV3 VEGF及bFGF mRNA表达分别为3.62±0.23及3.41±0.25,条件培养液中VEGF及bFGF蛋白水平分别为(523.5±24.9)pg/ml及(156.4±17.3)pg/ml,与SKOV3单独培养时相比,差别均有显著性(P<0.01)。HPMC共培养后VEGF及bFGF mRNA表达分别为3.96±0.09及3.54±0.21,条件培养液中VEGF及bFGF蛋白水平分别为(1567.62±45.42)pg/ml及(682.9±33.7)pg/ml,均明显高于HPMC单独培养时的水平(P<0.01)。结论卵巢癌细胞与HPMC均可合成VEGF及bFGF;二者共培养时,相互刺激表达更高的VEGF及bFGF。     

利用重组杆状病毒在家蚕中表达人血管内皮细胞生长因子

家蚕作为“生物工厂”生产重组蛋白质具有很多优势 .构建携带编码人血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 16 5个氨基酸的cDNA的重组杆状病毒 .将此重组病毒接种 5龄家蚕幼虫进行重组蛋白的表达生产 .时相表达分析表明 ,感染后大约 80h时表达水平达到最高 ,而且重组蛋白主要存在于血淋巴中 .从感染的幼虫收集血淋巴并用Nickle亲和层析纯化重组蛋白产物 .定量分析表明 ,每条家蚕幼虫的表达水平高达 4 2 6 μg左右 .通过细胞培养体外分析 ,发现与对照相比 ,加入纯化的重组VEGF(10ng ml和 10 0ng/ml)能够使人HUVEC细胞体外培养细胞数增加 1 8～ 3 3倍 ,说明家蚕幼虫表达的重组VEGF具有完全的生物活性 ,能够诱导内皮细胞在体外分裂增殖 .     

成骨细胞对梯度拉伸应变的响应

采用四点弯曲加载装置对原代的大鼠颅盖骨细胞施加周期性的拉伸刺激,并设计了应变呈梯度增加的加载方式,使成骨细胞受到的拉伸应变为500－1500με,每隔2h增加500με,以考察成骨细胞对变化的力学环境的响应。结果表明,在500με下拉伸2－6h促进了成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活力增强和胞外钙基质沉积。对细胞施加应变呈梯度增加的拉伸刺激,则发现当应变从有利于细胞的生长分化水平（500με）变化为不利于细胞生长分化的水平（1000με,1500με）后,细胞的增殖指数、碱性磷酸酶活力和胞外钙基质分泌量都迅速降低,以适应新的力学环境。说明成骨细胞能够分辨不同的应变水平,并相应地调节自身的生理功能,从而表现出对变化的力学环境的适应。     

周期性张应力对面颌肌细胞Na+/K+-ATPase的影响

目的:研究周期性张应力对Na+/K+-ATPase功能活性及其表达的影响,明确Na+/K+-ATPase在功能矫形中面颌肌肉适应性改建的生物和分子机制.方法:构建面颌肌细胞体外培养-力学刺激模型;应用多通道细胞牵张应力加载系统,对面颌肌细胞施加不同时段的张应力刺激,测定Na+/K+-ATPase的功能活性;运用实时荧光定量PCR研究周期性张应力刺激对Na+/K+-ATPase功能亚基α亚单位mRNA的影响.结果:Na+/K+-ATPaseα1,α2亚单位随着加力时间延长,表达增强,同对照组比较,呈一致性上调(P＜0.001);细胞加力1小时,α1的mRNA表达不受影响;加力2小时后,α1和α2的mRNA表达呈现逐渐增强趋势,48 h时达到最大值.张应力刺激对α2亚单位的mRNA表达似乎更为敏感,加力lh时α2亚单位的mRNA表达水平即增加,增加量约为对照组的37.74％,具有显著的统计学意义.结论:周期性的机械牵张作用于培养的骨骼肌细胞,可诱导α1和α2亚单位mRNA的表达量增加;α1和α2亚单位对周期性张应力刺激的作用时间反应不同,α2亚单位的反应可能更为敏感.周期性张力刺激的增加所产生的压力可能是转录调节的主要因素;周期性张应力对骨骼肌细胞Na+/K+-ATPase水解亚的调节作用不同,可能在面颌肌肉对功能矫形力的适应性改建中具有重要作用.     

周期性张应力刺激下成肌细胞钙网蛋白的表达及变化

目的：检测成肌细胞钙网蛋白（CRT）在循环拉伸应力刺激下的表达变化。方法：体外构建面颌部成肌细胞力学刺激模型。加力组以0．5赫兹的加载频率和10％细胞拉伸变形幅度对细胞进行加力培养1h,6h,12h,24h,运用实时荧光定量PCR技术跟Westem Blot技术分别检测在周期性张应力作用下成肌细胞CRT在基因水平及蛋白水平的表达变化。结果：当对细胞加力6h后,CRTmRNA及蛋白表达量开始增多,加力12h后CRTmRNA及蛋白表达量到达最多（P〈0．01）,加力0h组与加力12h组之间差异有显著的统计学意义（P〈0．01）。结论：持续的周期性张应力刺激下CRTmRNA及蛋白表达增加。     

周期性张应力对面颌肌细胞Na~＋/K~＋-ATPase的影响

目的：研究周期性张应力对Na＋/K＋-ATPase功能活性及其表达的影响,明确Na＋/K＋-ATPase在功能矫形中面颌肌肉适应性改建的生物和分子机制。方法：构建面颌肌细胞体外培养-力学刺激模型;应用多通道细胞牵张应力加载系统,对面颌肌细胞施加不同时段的张应力刺激,测定Na＋/K＋-ATPase的功能活性;运用实时荧光定量PCR研究周期性张应力刺激对Na＋/K＋-ATPase功能亚基α亚单位mRNA的影响。结果：Na＋/K＋-ATPaseα1,α2亚单位随着加力时间延长,表达增强,同对照组比较,呈一致性上调（P〈0.001）;细胞加力1小时,α1的mRNA表达不受影响;加力2小时后,α1和α2的mRNA表达呈现逐渐增强趋势,48 h时达到最大值。张应力刺激对α2亚单位的mRNA表达似乎更为敏感,加力1 h时α2亚单位的mRNA表达水平即增加,增加量约为对照组的37.74%,具有显著的统计学意义。结论：周期性的机械牵张作用于培养的骨骼肌细胞,可诱导α1和α2亚单位mRNA的表达量增加;α1和α2亚单位对周期性张应力刺激的作用时间反应不同,α2亚单位的反应可能更为敏感。周期性张力刺激的增加所产生的压力可能是转录调节的主要因素;周期性张应力对骨骼肌细胞Na＋/K＋-ATPase水解亚的调节作用不同,可能在面颌肌肉对功能矫形力的适应性改建中具有重要作用。     

对数生长与G_0期人包皮成纤维细胞Stat1对INF-α刺激反应的差异

Stat1 (信号转导与转录活化子 1 )的激活与刺激因子和细胞组织类型有关 ,它的活化受体有组织分布特异性 .本研究比较 G0 期和对数生长周期两个不同状态体外培养的人包皮成纤维细胞受到干扰素 ( INF-α)刺激后 Stat1基因 m RNA、蛋白质表达以及蛋白质合成效率的差异 .结果表明 :成对数生长的细胞 Stat1的m RNA表达量较对照组增加达 1 0倍左右 ,蛋白质表达增加 3～ 4倍左右 ;G0 期细胞 Stat1的 m RNA表达量较对照组增加约 3～ 4倍 ,蛋白质表达增加约 3～ 4倍 ;对数生长细胞 Stat1蛋白质合成效率明显降低 ,在翻译水平可能有调控 .以上结果提示对数生长和 Go 细胞对 INF-α刺激反应有差异     

胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、IGF结合蛋白-2和LH受体mRNA在卵泡闭锁过程中的表达及调节

研究了IGF-Ⅰ、IGF结合蛋白-2(IGFBP-2)和促黄体激素受体(LHR)mRNA在卵泡闭锁过程中的表达及调节.给26日龄大鼠注射15 IU PMSG,经检测,证实PMSG处理48 h后,一些小窦状卵泡的颗粒细胞已发生凋亡;96 h在排卵前卵泡中已可检测到凋亡细胞;120 h大多数的排卵前卵泡中均出现大量的凋亡细胞.48～120 h IGF-Ⅰ主要在窦前卵泡和小窦状卵泡表达;48与96 h,窦前与窦状卵泡的膜细胞均表达高水平的IGFBP-2.在48 h,颗粒细胞中有LHR的强信号,但在96和120 h,颗粒细胞的LHR表达减弱(P＜0.001).表皮生长因子(EGF)和IGF-Ⅰ均抑制窦前和窦状卵泡颗粒细胞凋亡.同时观察到EGF促进IGF-Ⅰ mRNA表达,IGF-Ⅰ刺激排卵前卵泡表达LHR mRNA.上述结果表明,各级卵泡的闭锁可能均受EGF和IGF-Ⅰ相互作用的调节.     

拉伸作用对成骨细胞粘附、铺展、粘弹性的影响

采用四点弯曲梁实验装置（自行研制）对离体培养的大鼠成骨细胞,施以拉伸应变影响,通过微管吸吮系统、显微摄录、计算机图像系统了解细胞的粘附、铺展行为和细胞的粘弹性变化,认识细胞形态、粘附力及变形性对机械刺激的响应。发现：（1）机械拉伸2h成骨细胞与基底粘附力以及细胞单位面积粘附力较对照组明显升高,但加载后期与对照无明显;（2）成骨细胞粘弹性较对照组略低;（3）加载24h(500με）实验组细胞增殖比对照组快。机械拉伸有成骨细胞生长,并可通过粘附、铺展调整、削减应变影响。     

慢病毒介导的稳定表达bFGF的胎儿肝脏基质细胞株的建立

通过重组慢病毒系统感染人胎儿肝脏基质细胞(fetalliverstromalcell,FLSC),建立了能够稳定、高效表达碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的细胞株bFGF/FLSC.从流产胎儿肝脏组织分离富集基质细胞,对其进行了生长特性和表面标志的鉴定,其在体外维持传代35代,依然保持正常的染色体核型.从胎儿骨髓间充质干细胞中克隆得到bFGF基因,构建重组慢病毒载体,感染FLSC,根据荧光表达强弱进行流式分选,获得能够继续稳定传代的低表达和高表达bFGF的两株细胞,RT-PCR和蛋白质印迹证实,细胞株中bFGF基因的稳定表达.RT-PCR结果显示,弱荧光和强荧光表达细胞的bFGF,在mRNA水平的表达分别是转染空载体细胞的2.33倍和6.19倍;蛋白质印迹结果显示,在蛋白质水平表达分别是1.76倍和5.05倍.用建立的bFGF/FLSC作饲养层细胞体外培养人胚胎干细胞(humanembryonicstemcells,hES),结果证明,其能在无或少量添加外源bFGF的条件下,维持人ES细胞增殖及其干性达20代.bFGF/FLSC细胞株的建立,将为构建低成本、安全高效的人胚胎干细胞的培养体系及研究造血细胞的发育分化提供适宜的微环境.     

MGF对人软骨终板干细胞增殖和迁移的影响

力生长因子(mechano growth factor,MGF)在多种组织均有表达,能促进力效应细胞的增殖和迁移。为研究MGF对人软骨终板干细胞(cartilage endplate derived stem cells,CESCs)增殖和迁移的影响,该研究采用CCK-8检测法、Transwell实验、蛋白免疫印迹法(Western blot)分别对CESCs的增殖、迁移以及Erk磷酸化表达水平进行检测。结果显示,MGF能促进CESCs的增殖和迁移,且效应具有剂量依赖性,当浓度为4.5 ng/m L时MGF促增殖和迁移的效应最大(P0.05)。给予细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,Erk)抑制剂PD98059时,MGF促增殖效应显著下降(P0.001);给予胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)抑制剂PQ401时,MGF促迁移效应也显著下降(P0.001)。Western blot检测结果显示,给予MGF后,CESCs的Erk磷酸化表达水平显著升高(P0.001),但IGF-1R抑制剂PQ401能抑制Erk磷酸化的表达(P0.001)。该研究表明,MGF具有促CESCs增殖和迁移的效应,该效应依赖于Erk的磷酸化表达,且IGF-1R在MGF促迁移的效应中扮演重要角色。