跳跃探针式离子电导显微镜技术及其在生物学研究中的应用

跳跃探针式离子电导显微镜(hopping probe ion conductance microscopy,HPICM)技术是一种新型的扫描探针显微镜(scanning probe microscopy,SPM)技术,其能够在生理条件对形态复杂的活体生物样品进行非接触式的纳米尺寸成像。这项新技术克服了传统扫描离子电导显微镜(scanning ion conductance microscopy,SICM)连续负反馈控制会造成样品和探针损坏的缺点,扩大了SICM在生物学研究中的应用范围。本文综述了HPICM技术的基本原理,结合国内外研究现状介绍了HPICM在生物学领域的应用,并对其发展趋势进行了展望。     

动脉平滑肌细胞内钙瞬变与自发性瞬时外向电流同步记录技术(英文)

本文旨在建立一种可同步观察细胞内信号分子和细胞膜离子通道变化之间相互关系的实时研究方法。联合应用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)显微成像技术和全细胞穿孔膜片钳技术,在急性酶分离的小鼠脑动脉平滑肌细胞上同步记录自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents,STOCs)和细胞内的钙瞬变。在全细胞模式膜片钳记录平滑肌细胞膜钾电流的同时,LSCM可准确记录到胞浆内出现的钙瞬变。此技术对于从分子水平揭示细胞内信号转导过程和离子通道相关疾病的机制有重要意义。     

阳离子胶体金标记活细胞阴离子位点的双光子荧光成像及其应用

使用阳离子胶体金标记中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)的阴离子位点,并采用双光子荧光显微成像和荧光寿命成像技术记录活细胞的阴离子场分布.阳离子胶体金是纳米量级金微粒与多聚L-赖氨酸的结合物,金纳米微粒在超短激光脉冲的照射下可以产生高度局域化的光热效应.当飞秒激光脉冲聚焦在细胞膜上标记的金纳米微粒时会产生这种纳米尺度的微光热效应,并在不影响细胞活性的前提下暂时提高细胞膜的通透性.基于这种效应,使用聚焦的飞秒激光脉冲三维扫描照射CHO-K1细胞,将分子质量为10ku的荧光探针大分子异硫氰酸荧光素葡聚糖(fluorescein isothioeyanate-dextran, FITC-D)递送到CHO-K1细胞的内部,并用双光子荧光图像记录其递送的过程.使用流式细胞仪分析不同实验条件下FITC-D的转导率和细胞死亡率的关系.     

胰腺β细胞的离子通道和胰岛素分泌

1 .胰腺β细胞膜上几种重要的离子通道和动作电位β细胞内的离子通道特性和胰岛素分泌的机制研究是深入了解糖尿病的基础。 2 0世纪 70年代初 ,胰岛 (ｉｓｌｅｔ)电生理研究表明 ,葡萄糖刺激伴随着β细胞膜电势的变化 ,并推测其与胰岛素分泌相关[1] 。 2 0世纪 70年代末 ,Ｎｅｈｅｒ等[2 ] 发明了膜片钳记录技术 ,大大促进了包括β细胞在内的单细胞电生理的研究。1 .1　Ｋ 通道　　 2 0世纪 80年代前期 ,各种不同膜片钳构型的研究都表明 ,葡萄糖刺激下β细胞的膜电势变化源于膜上一种Ｋ 通道活性的改变 ,因其可直接被ＡＴＰ关闭而被命名为…     

豚鼠不同部位微动脉平滑肌细胞电生理学特性的比较

本研究应用电生理技术在豚鼠离体小脑前下动脉(anterior inferior cerebellar artery,AICA)、肠系膜动脉(mesenteric artery,MA)和耳蜗螺旋动脉(spiral modiolar artery,SMA)分支(直径小于100μm)上比较微动脉平滑肌细胞电生理学特性的异同。结果显示:(1)应用细胞内微电极记录技术测得AICA、MA和SMA细胞静息膜电位分别为(-68±1.8)(n=65)、(-71±2.4)(n=80)和(-66±2.9)mV(n=58),各微动脉间无统计学差异。(2)一段血管微动脉标本全细胞膜片钳记录的平滑肌细胞膜电容和膜电导都远大于单个细胞标本,且微动脉间存在统计学差异,大小顺序为MAAICASMA。应用缝隙连接阻断剂2-APB(100μmol/L)后记录一段微动脉平滑肌细胞膜电容和膜电导与单个细胞十分接近。(3)AICA、MA和SMA单个平滑肌细胞膜电流I/V关系呈明显的外向整流特性,都对1mmol/L4-AP和10mmol/LTEA敏感。当指令电压为+40mV时,AICA、MA和SMA血管平滑肌细胞电流密度分别为(26±2.0)、(24±1.7)和(18±1.3)pA/pF,SMA和AICA、MA间存在统计学差异。上述结果提示,豚鼠不同部位微动脉平滑肌细胞在缝隙连接耦联力和电流密度等电生理特性存在差异。     

利用膜片钳技术标记脑片神经元的方法

目的: 介绍一种利用膜片钳技术标记脑片神经元形态的方法。方法: 利用振动切片机切好实验目标部位的脑片,用含有Neurobiotin^TM Tracer的电极内液灌注玻璃微电极,并进行全细胞膜片钳记录;实验结束后将脑片先用4％多聚甲醛固定、漂洗,再用含有Streptavidin-Texas Red和Triton X-100的PB染色,2 h后即可用荧光显微镜观察着色的神经元。结果: 将细胞膜电压钳制在-70 mV,阶跃刺激后神经元表现为逐渐增大的膜电流。电流钳模式记录时,阶跃刺激使神经元去极化,达到阈电位后爆发动作电位。荧光显微镜下可看到胞体和主要突起清晰完整的神经元形态。结论: 本方法适用于在膜片钳实验后观察所记录的神经元的形态特征,操作方便,图像直观清晰。     

18β-甘草次酸抑制微动脉平滑肌细胞外向电流

本文旨在观察18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid,18βGA)对微动脉平滑肌细胞膜电流的影响。分离出豚鼠小脑前下动脉(anterior inferior cerebellar artery,AICA)和肠系膜动脉(mesenteric artery,MA)后,用酶消化法制备单个血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs),应用全细胞膜片钳技术记录平滑肌细胞外向电流的变化。结果显示:(1)1mmol/L4氨基吡啶(4-aminopyridine,4-AP)和1mmol/L tetraethylammonium(TEA)都可以部分抑制微动脉平滑肌细胞的外向电流。(2)18βGA电压和浓度依赖性地抑制微动脉平滑肌细胞外向电流。18βGA主要抑制0～+40mV电压区间的激活电流,其中对+40mV激活电流的抑制作用最强。10、30和100μmol/L18βGA对AICA平滑肌细胞外向电流(+40mV)的抑制率分别为(25.3±7.1)%、(43.1±10.4)%和(68.4±3.9)%,对MA平滑肌细胞外向电流(+40mV)的抑制率分别为(13.2±...     

美洲大蠊中枢DUM神经元的分离和电压门控Na+电流的记录

【目的】建立美洲大蠊Periplaneta americana中枢神经系统背侧不成对中间神经元（dorsal unpaired median neurons, DUM neurons）的分离方法和DUM神经元电生理实验模型。【方法】IA型胶原酶法消化美洲大蠊末端腹神经节, 机械吹打得到DUM神经元细胞, 运用膜片钳技术记录DUM神经元细胞电压门控Na+电流。【结果】分离得到的DUM神经元细胞状态良好, 具有DUN神经元典型的梨状形态和表面特征。以膜片钳全细胞方式记录到的Na+电流符合钠通道电流特征。【结论】IA型胶原酶消化得到美洲大蠊DUM神经元细胞的方法可靠, 能稳定地记录到Na+电流。本文描述的方法为昆虫神经细胞的电生理机制研究提供一个可用的实验模型。     

AFM对小鼠胚胎干细胞的形态学研究

目的：对已建系BALB/c小鼠胚胎干细胞膜表面进行纳米级超微结构的初步形态学研究,从而为从分子水平研究胚胎干细胞的增殖与分化调控机理奠定基础。方法：利用原子力显微镜（AFM）,在空气中对小鼠胚胎干细胞膜表面扫描成像。结果：AFM图像表现BALB/c小鼠胚胎干细胞呈圆盘状,直径约10-15μm,高约2-4μm,胚胎干细胞膜表面比较复杂,随着扫描范围的减小,切向分辨率逐渐增大,可达到纳米分辨,细胞表面有许多紧密堆积的椭球状颗粒。颗粒尺寸（x-y方向）为40-80nm。结果：利用AFM可以得到胚胎干细胞表面高分辨的,可重复的图像。     

一种改进的人体心房肌细胞分离方法

本研究旨在探讨稳定的人体心房肌细胞分离方法,并观察分离的正常窦性心律（normal sinus rhythm,NSR）患者右心房肌细胞基本电生理特性。XXIV型蛋白酶和V型胶原酶两步法进行单个人体心房肌细胞分离,常规全细胞膜片钳技术记录正常的L-型钙通道电流（L-type calcium current,ICa-L）、钠通道电流（sodiumcurrent,INa）、瞬时外向钾通道电流（transient outward potassium current,Itol）和内向整流钾通道电流（inward rectifier potassium current,Ik1）。此方法分离的人体心房肌细胞数量多,细胞膜光滑,折光性强,横纹清楚,耐钙,可用于膜片钳实验的占分离细胞总数的50％-60％。该方法简单、稳定、可靠,酶用量少,分离的心肌细胞质量好,数量多,并能记录到多种离子通道电流,表明其具有正常的电生理功能,适合膜片钳实验。     

大麻素CB1受体对大鼠视网膜神经节细胞诱发动作电位的作用(英文)

激活大麻素CB1受体(CB1Rs)通过调控多种离子通道,从而调节脊椎动物视网膜的功能。本文旨在利用膜片钳全细胞记录技术,在大鼠视网膜薄片上研究CB1Rs对神经节细胞兴奋性的作用。结果显示,在电流钳制状态下,灌流CB1R激动剂WIN55212-2(WIN,5μmol/L)对神经节细胞的自发动作电位发放频率和静息膜电位均没有显著影响。在灌流液中加入CNQX,D-APV,bicuculline和strychnine以阻断神经节细胞的兴奋性和抑制性输入,灌流5μmol/L WIN对正向电流注入(+10pA到+100pA)诱发的动作电位的频率也没有显著影响。位相分析结果显示,触发动作电位的阈值电位和触发第一个动作电位的延迟时间在加入WIN前后也没有显著改变;然而,WIN显著降低动作电位的上升和下降相速率(±dV/dtmax),而且该作用可被CB1R拮抗剂SR141716所阻断。此外,在阻断突触输入的情况下,WIN对神经节细胞的膜电位也没有显著影响。以上结果提示,激活大麻素CB1Rs通过调控诱发动作电位,从而调节大鼠视网膜神经节细胞的兴奋性。     

大鼠大脑皮层神经元单离子钾通道门控动力学

采用膜片钳制技术,对新生大鼠大脑皮层神经元作了细胞贴附和内膜向外两种模式的单通道电流记录。通道开放和关闭事件的转换过程为一随机过程,开关时间服从指数分布。细胞膜单离子通道的时间常数和对离子通透性接近的构象组成构象集合态。由残差法获得模型参数初值,由非线性最小二乘法获得修正值。新生大鼠大脑皮层神经元在-40mV钳制电位和电极内外对称高钾溶液下,细胞贴附和内膜向外的两种膜片钳制模式的单通道电流的动力学特征有明显差异。通道开放时间分布接近一状态分布。细胞贴附时的通道平均开放时间为2.53ms。内膜向外时的通道平均开放时间为2.04ms。关闭时间分布接近三状态分布,细胞贴附时通道平均关闭时间为3.36ms,内膜向外时通道的平均关闭时间为7.58ms。细胞贴附下,通道关闭时主要处于第一和第二关闭态;内膜向外下,通道关闭时主要处于第一关闭态。经初值估计和参数修正,得到各状态间的转移概率密度常数。     

L型钙流和反向钠-钙交换在豚鼠心室肌细胞兴奋-收缩偶联中的作用

目的 :比较和探讨L型钙流 [ICa(L) ]和反向钠—钙交换 (NCX)在触发豚鼠心室肌细胞兴奋—收缩偶联中的作用。方法 :以分离的豚鼠单个心室肌细胞为对象 ,采用膜片钳和单细胞收缩测量技术 ,给予 35℃的各种含药物细胞外液快速灌流 ,同时记录ICa(L) 和细胞收缩。结果 :①在 +10mV的钳制电压 ,使用硝苯地平 (Nif) 10～ 10 0 μmol/L和Nif 30 μmol/L +Cd2 +30 μmol/L ,阻滞ICa(L) 越多 ,细胞收缩被阻滞得越多 ,呈线性相关。②在 +5 0mV的钳制电压 ,Nif 10 0 μmol/L以及Nif 30 μmol/L +Cd2 +3 0 μmol/L仅能抑制部分细胞收缩 ,但剩余的细胞收缩起始时间明显延迟 ,且能被 5mmol/LNi2 +所阻滞。③在 +10 0mV的钳制电压 ,细胞收缩起始时间较 +5 0mV明显延迟 ,且不能被Nif 10 0 μmol/L和Nif 30 μmol/L +Cd2 +30 μmol/L所阻滞。结论 :在生理条件下 ,ICa(L) 是触发心室肌细胞兴奋—收缩偶联的主要途径 ,但在膜电位 >+5 0mV时 ,反向NCX也参与兴奋—收缩偶联。     

急性缺氧增强豚鼠小脑前下动脉平滑肌细胞外向电流并抑制缝隙连接

本文旨在研究急性缺氧对微动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)膜电生理特性的影响。分离出豚鼠小脑前下动脉(anterior inferior cerebellar artery,AICA)段,胶原酶A消化后用显微镊去除微动脉外层结缔组织,然后给予无糖低氧的灌流液,同时应用全细胞膜片钳技术观察VSMCs膜电流的变化。结果显示:(1)当钳制电压在40mV时,急性缺氧引起一个反应幅度为(36.4±9.2)pA的外向电流,细胞静息膜电位从(33.2±1.9)mV超极化到(38.4±1.5)mV。急性缺氧电压依赖性地增强VSMCs外向电流,主要增强0～+40mV电压区间的激活电流幅度,+40mV激活电流幅度从(650±113)pA增加到(1900±197)pA。背景灌流K+通道阻断剂tetraethylammonium(TEA,1mmol/L)后,急性缺氧对VSMCs外向电流的增强作用显著减小。(2)急性缺氧使AICA上VSMCs的细胞膜电阻(R input)从(234±63)MΩ增加到(1211±201)MΩ,细胞膜电容(C input)从(279.3±83.2)p...     

db-cAMP对转化细胞钙调素基因表达与细胞骨架的影响

转化的C_3H_(10)T_(1/2)细胞表现增殖速度加快、表面微绒毛增加,细胞变圆,叠层生长,ConA受体呈帽状分布,微管、微丝、纤粘蛋白分布明显减少。与增殖有关的癌基因c-fos表达增强,同时发现与细胞增殖、转化和细胞骨架调节有关的钙调素(CaM)基因表达加强。用1mmo/Ldb-cAMP处理转化细胞,观察到CaM基因和原癌基因c-fos的表达分别在处理后1小时和2小时急剧下降。处理后4—5天,转化细胞表型趋正常化,大部分细胞恢复单层生长。细胞表面微绒毛和泡状物减少,ConA受体帽状分布消失,恢复分散分布在细胞膜上的特点。细胞生长明显被抑制,用优先在G_1期表达的4F_1 cDNA为探针进行分子杂交,证实了经db-cAMP处理后的细胞被阻抑在G_1期。经db-cAMP处理6天的转化细胞中微管、微丝、纤粘蛋白基本恢复正常分布。实验表明CaM的表达增强与转化细胞表型变化和细胞骨架组装减弱密切相关,db-cAMP作用后CaM表达下降是抑制转化细胞增殖并使细胞表型和细胞骨架分布趋于正常的关键事件之一。     

近场光学显微镜结合量子点标记人胃腺癌SGC-7901细胞靶点的观察

扫描近场光学显微镜突破衍射极限,具有纳米量级的空间分辨率,量子点(QD s)标记有荧光强度高且抗光漂白能力强等优点。结合上述两种技术,对人胃腺癌SGC-7901细胞膜表面特异性结合的叶酸受体(FR)进行成像探测,获得了叶酸受体在SGC-7901细胞膜表面上的分布,以及细胞内化外源性叶酸过程中叶酸受体在细胞膜表面的分布变化,成像的光学分辨率达到120 nm。实验结果表明:特异性结合的叶酸受体在SGC-7901细胞膜表面的分布,绝大部分是以聚集体的形式存在。随着SGC-7901细胞内化叶酸量的增加,叶酸受体在细胞膜表面的分布密度逐渐降低,并在经过120 m in左右趋于稳定。上述方法和手段为实现单细胞水平上靶点分布和变化的长期监测,肿瘤细胞内化受体的机制研究提供了新的技术途径。     

大鼠肥厚心肌细胞钙电流及 Na~ /Ca~(2 )交换电流的研究(英文)

本文观察了心肌肥厚对大鼠心肌细胞Na ／Ca2 交换电流的影响。我们采用Goldblatt两肾一夹方法诱发大鼠心肌肥厚,应用全细胞膜片钳技术记录电流。结果表明：肥厚心肌细胞的Ni2 -敏感Na ／Ca2 交换电流密度大于正常细胞。在钳制电压为＋50mV时,正常细胞的外向交换电流密度为1．53±0．31pA／pF,而肥厚细胞则为2．62±0．53pA／pF（P＜0．01）;钳制电压为-100mV时,正常细胞的内向交换电流密度为0．42±0．14pA／pF,肥厚细胞达1．12±0．33pA／pF（P＜0．001）。这些结果提示,肥厚心肌细胞的Na ／Ca2 交换电流发生了改变,其意义有待进一步探讨。     

抗人精子蛋白17磁性纳米探针靶向的卵巢癌体内外磁共振成像

用MRI(magnetic resonance imaging)技术探索连接抗人精子蛋白17单克隆抗体(anti-Sp17 mAb)的磁性纳米探针对体外培养及动物体内Sp17+卵巢癌的靶向性。将anti-Sp17mAb连接到表面包覆壳聚糖的超顺磁性氧化铁纳米颗粒上,制成磁性纳米探针anti-Sp17-MNP,用作MRI阴性对比剂。将磁性纳米探针与Sp17+和Sp17-培养的肿瘤细胞共育,进行一系列体外磁共振成像实验。荷瘤小鼠尾静脉注射磁性纳米颗粒,用7T磁共振仪在体成像,观察肿瘤部位的信号变化,并用普鲁士蓝染色肿瘤组织切片,观察有无铁粒子聚集。体外MRI数据显示,anti-Sp17-MNP与细胞靶向结合,并与细胞共育2 h后,Sp17+HO-8910的T2*信号强度比Sp17-HepG2低2倍;anti-Sp17-MNP对肿瘤细胞的靶向作用可被重组人Sp17阻断。7T磁共振仪对动物在体肿瘤成像结果显示,感兴趣区因磁性纳米探针靶向聚集而导致信号降低,并经组织切片普鲁士蓝染色证实。本研究结果表明,用anti-Sp17抗体和新的合成路线制备的纳米探针具有用作MR对比剂进行分子成像的潜能。     

温度诱导的下丘脑神经元Kv簇状开放的特性

采用膜片钳细胞贴附式技术 ,观察和记录了32℃、37℃和39℃时下丘脑神经元电压依赖性K +单离子通道 (Kv)的活动 ,探讨Kv簇状开放 (Burstopening)与开放概率的关系。结果表明 ,温度升高时 ,单位时间内记录到的Burst开放明显增多 ,开放概率NPo从37℃时的0.175±0.124升至39℃时的0.696±0.187(P<0.01)。明显影响NPo的Burst开放有关参数包括Burst内部的开放数目和两个Burst开放的间期。温度升高 ,Burst开放内部开放数目增多 ,两个Burst开放间期明显缩短 ,39℃时出现较多的近Burst开放     

肌动蛋白的原子力显微镜研究

原子力显微镜 (AFM )是一种能够在生理条件下对生物大分子、活细胞表面以及细胞膜下结构进行在体或离体研究的强有力的新型工具 ,具有原子级的成像分辨率和纳牛顿级的力测定功能。目前原子力显微镜已被广泛地应用于生物大分子、超分子体系的结构解析、动力学过程观察 ,分子力学研究及细胞功能鉴定。原子力显微镜能够通过尖锐探针扫描待测样品表面 ,收集被测样品表面地貌坐标数据从而对单分子或细胞进行成像或操作 ,并能通过移动探针、记录探针与样品之间的作用力 ,对生物大分子 (蛋白质、核酸和多糖等 )的结构力学特性进行分析以获取分子构象、功能及其相互关系的有用信息。肌动蛋白是一种细胞内普遍存在 ,具有广泛、复杂生理功能的重要蛋白质 ,原子力显微镜的各项功能已广泛地用于肌动蛋白结构、功能及动力学研究。通过综述原子力显微镜在肌动蛋白研究中的应用 ,阐明了原子力显微镜在现代生命科学研究中的重要意义及巨大应用前景。