线粒体DNA数目不同的人角质形成细胞模型的建立

该研究采用溴化乙锭(ethidium bromide,Et Br)对人永生化角质形成细胞(HaCaT)进行诱导,采用RT-PCR法、MTT法和健那绿染色技术联合鉴定Et Br对HaCaT细胞线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)拷贝数的影响,建立不同mt DNA拷贝数目的HaCaT细胞模型。结果显示,HaCaT细胞经100 ng/m L和50 ng/m L Et Br分别处理10 d后,细胞形态随着处理时间的延长发生改变,由规则铺路石形状逐渐变圆,某些细胞体积变小,成团生长,细胞膜边缘不光滑,且随着mt DNA数目的减少,细胞增殖速率明显下降。RT-PCR分析结果显示,与对照组相比,50 ng/m L和100 ng/m L Et Br处理10 d的HaCaT细胞中,mt DNA的拷贝数分别减少了52.9%和97.6%[以线粒体DNA脱氢酶1(mitochondrial NADH dehydrogenase 1 gene,ND1)与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的比值来表示mt DNA的相对拷贝数变化情况]。健那绿染色显示,对照组HaCaT细胞中可见分散存在的蓝绿色线粒体颗粒,100 ng/m L Et Br处理10 d后的HaCaT细胞中,显微镜下蓝绿色线粒体颗粒明显减少。综上所述,该研究证明了HaCaT细胞可通过Et Br诱导被成功培养成ρ–细胞,且Et Br浓度与HaCaT细胞mt DNA拷贝数的变化在一定的范围内存在着剂量–效应关系。     

CXC趋化因子配体8促进结直肠癌微环境中M2型巨噬细胞趋化及浸润

CXC趋化因子配体8(CXC chemokine ligand 8,CXCL8)在结直肠癌等多种肿瘤中高表达,并促进肿瘤恶性进展。研究发现,结直肠癌微环境中有大量M2型巨噬细胞浸润,但CXCL8是否影响M2型巨噬细胞的浸润及其潜在机制尚未可知。本文旨在探讨CXCL8对结直肠癌中M2型巨噬细胞浸润及趋化作用的影响。本研究首先分析了TCGA数据库结直肠癌样本中CXCL8表达水平及免疫细胞浸润情况,并在临床组织中进行验证。随后Western 印迹及qRT-PCR检测5种结直肠癌细胞株CXCL8的表达情况。佛波酯(PMA)及IL-4诱导THP-1至M2型巨噬细胞后,与HCT116、SW480细胞及过表达CXCL8的HCT116(CXCL8/HCT116)、SW480(CXCL8/SW480)共培养,检测M2型巨噬细胞趋化情况。白细胞介素1β(IL-1β)处理HCT116、SW480细胞,检测CXCL8表达情况,与M2型巨噬细胞共培养,分析趋化结果。结果显示,患者癌组织CXCL8表达高于癌旁组织,CXCL8高表达癌组织中存在更多M2型巨噬细胞浸润;IL-1β作用于HCT116或SW480后,CXCL8的mRNA及蛋白质表达水平升高(P<0.05)。Transwell实验证实,CXCL8趋化M2型巨噬细胞(P<0.05)。综上所述,结直肠癌细胞中CXCL8可由IL-1β诱导产生,CXCL8表达增加能够促进M2型巨噬细胞的趋化,结直肠癌微环境中M2型巨噬细胞大量浸润可能与CXCL8表达升高有关。     

溴化乙锭诱导无线粒体DNA宫颈癌HeLa细胞系的构建和鉴定

[目的]构建和鉴定由溴化乙锭(EB)诱导的无线粒体DNA(mtDNA)宫颈癌ρ~0HeLa细胞系,探讨mtDNA与宫颈癌发生的关系。[方法]采用含50ng/ml溴化乙锭、100μg/ml丙酮酸钠和50μg/ml尿嘧啶核苷的高糖DMEM完全培养基中传代培养HeLa细胞。低剂量EB连续诱导60d后,采用营养缺陷鉴定、PCR和WesternBlot鉴定无mtDNA的ρ~0HeLa细胞系;采用透射电子显微镜观察ρ~0HeLa细胞内线粒体形态变化;采用CCK8法测定ρ~0HeLa细胞增殖曲线。[结果]经溴化乙锭诱导60d,可以培养出具有尿嘧啶核苷依赖性的无mtDNA宫颈癌HeLa细胞系。普通PCR和qPCR结果均显示,低剂量EB诱导60d的ρ~0HeLa细胞中mtDNA完全缺失。WesternBlot结果显示,HeLa细胞中能表达核编码的NDUFA9蛋白,也能表达线粒体编码MT-ND1蛋白。而ρ~0HeLa细胞中已无MT-ND1蛋白表达,但核编码的NDUFA9蛋白能够正常表达。透射电子显微镜观察显示,ρ~0HeLa细胞内部分出现空泡改变,线粒体嵴被破坏。CCK8细胞增殖实验结果显示,ρ~0HeLa细胞系生长速度显著低于正常HeLa细胞系,且差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]无mtDNA的宫颈癌HeLa细胞系的建立,为后续研究mtDNA突变和线粒体功能在宫颈癌发生发展中的作用及机制奠定了基础。     

具核梭杆菌通过调节肠道代谢产物丁酸钠上调Cdk1促进结直肠癌发展

该文探讨了肠道微生物具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)通过调节代谢产物丁酸钠(NaB)对结直肠癌(CRC)发生发展的影响及其分子机制。提取临床组织RNA和蛋白,RT-qPCR和Western blot检测肿瘤组织与正常/癌旁组织Cdk1的mRNA及蛋白表达,同时检测具核梭杆菌的mRNA的相对水平,并分析其与Cdk1的相关性。具核梭杆菌处理结直肠癌细胞24 h后检测周期相关蛋白Cdk1和P21的表达水平,核磁共振检测培养基上清差异代谢物。不同浓度差异代谢物NaB处理结直肠癌细胞DLD-1、SW480、HCT116,使用MTT和克隆形成实验检测DLD-1、SW480、HCT116增殖能力。流式细胞术检测NaB对结直肠癌细胞SW480周期阻滞位点,Western blot检测周期相关蛋白Cdk1、P21、C-myc的表达水平。流式细胞术检测NaB处理后结直肠癌细胞SW480凋亡率变化情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved-Casepase3、Cleaved-PARP、Bcl-2的表达水平。采用MTT实验检测不同MOI具核梭杆菌作用结直肠癌细胞4、8、24 h后对其增殖能力的影响。将结直肠癌细胞与具核梭杆菌共培养24 h,Western blot检测相关蛋白Cdk1、c-myc、Cleaved-Caspase3的表达情况。结果显示,在肿瘤组织中Cdk1蛋白水平和mRNA水平均明显高于正常/癌旁组织(P0.05),并且Cdk1与具核梭杆菌mRNA表达水平存在一定相关性。具核梭杆菌处理结直肠癌细胞DLD-1和HCT116后,Western blot结果显示Cdk1和P21蛋白水平上升。核磁共振结果表明,菌处理组代谢模式与未处理组存在明显差异,主要代谢物NaB相对含量明显低于未处理组(P0.01)。使用1 mmol/L NaB处理结直肠癌细胞系DLD-1、SW480、HCT116 24 h后,细胞生存率分别为(89.18±1.92)%、(85.07±0.61)%、(83.59±2.18)%,且随着药物浓度升高,药物对细胞活性的抑制率逐步上升。同时,经1 mmol/L NaB处理后,DLD-1、HCT116和SW480细胞的克隆形成率相比于对照分别下降了(20.07±4.85)%、(36.47±5.31)%、(31.13±5.22)%。流式检测细胞周期显示,NaB引起结直肠癌细胞S期阻滞。NaB处理结直肠癌细胞24 h后,周期相关蛋白P21表达水平上升,Cdk1、C-myc蛋白表达水平下降(P0.05)。流式检测细胞凋亡显示,NaB引起结直肠癌细胞SW480凋亡增加。NaB处理结直肠癌细胞24 h后,凋亡相关蛋白Cleaved-Casepase3、Cleaved-PARP表达水平上升,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降。MOI=50的具核梭杆菌分别处理结直肠癌细胞SW480、HCT116 4 h后,细胞增殖率分别增加了(4.45±0.25)%、(2.61±0.75)%;并且随着具核梭杆菌MOI的增加和处理时间的延长,结直肠癌细胞的增殖率逐渐上升。将SW480细胞与HCT116细胞与具核梭杆菌共培养24 h,Western blot结果显示,具核梭杆菌感染促进了周期相关蛋白Cdk1、C-myc的表达,而其与NaB共同处理时则大大减弱了这一作用;NaB诱导Caspase3的剪切,导致Cleaved-Caspase3表达增加,而具核梭杆菌感染则减弱了这一作用。综上所述,肠道微生物具核梭杆菌通过调节肠道代谢物NaB上调Cdk1,促进结直肠癌细胞增殖,抑制结直肠癌细胞凋亡,进而影响结直肠癌的发生发展。     

人线粒体DNA缺失肝癌细胞株建立

人线粒体DNA缺失肝癌细胞株(ρ0SK-Hep1)的建立及鉴定。采用溴化乙锭(EB)诱导,PCR、Southern杂交及选择性培养方法进行鉴定。ρ0SK-Hep1细胞在含EB、无尿嘧啶和丙酮酸的选择培养基中从第1天始细胞逐渐悬浮、肿胀,培养第5天以后大量悬浮死亡,且贴壁疏松,10～12天细胞完全悬浮死亡。在选择性培养基中可以正常生长增殖成单层,有少量悬浮。同期非选择培养的SK-Hep1细胞生长正常。PCR结果显示,细胞色素氧化酶I、II(COXI、COXII)及内参G3PDH在SK-Hep1细胞中均可扩增出相应的条带,ρ0SK-Hep1细胞只见内参条带的形成。Southern杂交结果显示,ρ0SK-Hep1细胞未见COXI、COXII杂交条带形成。经EB诱导后成功地获得了ρ0SK-Hep1细胞株。     

无线粒体DNA的人肺腺癌A549细胞系的构建

目的:建立无线粒体DNA(mtDNA)的人肺腺癌ρ~0A549细胞系。方法:在含50 ng/mL溴化乙锭(EB)、100μg/mL丙酮酸钠和50μg/mL尿嘧啶核苷的RPMI1640细胞培养基中传代培养A549细胞;用低剂量EB连续诱导培养35 d后,采用光镜观察、TaqMan探针法实时荧光定量PCR(qPCR)和Western印迹鉴定无mtDNA的ρ~0A549细胞系;采用MTT法测定ρ~0A549细胞增殖曲线。结果:倒置显微镜下野生型ρ^+A549细胞为多角形,ρ~0A549细胞形态呈拉长枝状;qPCR结果显示,低剂量EB诱导35 d的ρ~0A549细胞中无mtDNA的存在。Western印迹结果显示,ρ^+A549细胞中能表达核基因编码的线粒体蛋白SDHA和ATP5A,也能表达线粒体基因组编码的蛋白MT-COXI和MT-ATP6;ρ~0A549细胞中无MT-COXI和MT-ATP6蛋白表达,但核基因编码的SDHA和ATP5A蛋白能够正常表达。MTT结果显示,与ρ^+A549细胞相比,ρ~0A549细胞生长速度明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:构建和鉴定了无mtDNA的人肺腺癌ρ~0A549细胞系,为后续探讨mtDNA缺失或突变与人肺腺癌发生之间的关系奠定了实验基础。     

线粒体DNA拷贝量降低诱发人支气管上皮细胞钙信号失调

采用溴化乙锭（EtBr）诱导线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）拷贝量降低的人支气管上皮细胞株（ρ-HBE）;Real—timePCR与共聚焦成像表明,经EtBr诱导60d并挑取的单克隆细胞株,其mtDNA拷贝量下降为正常细胞的24％,成功构建了ρ-HBE。与母本细胞相比,ρ-HBE群体倍增时间延长,生长速度减慢。流式细胞术检测细胞线粒体膜电位（△ψm）下降,以Fura-2标记胞浆内游离钙,ρ-HBE[Ca2＋]i升高;线粒体解耦联剂FccP刺激细胞后,激光共聚焦扫描显微镜动态监测单个活细胞[Ca2＋]i变化,发现[ca2＋]i水平波动幅度小。提示mtDNA拷贝数降低可导致细胞内钙信号调节紊乱。     

人结直肠癌细胞HCT116红色和绿色荧光标记肿瘤模型的建立

目的筛选表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白基因的人的单克隆结直肠癌细胞系,为体内监测肿瘤的早期生长建立一种新的肿瘤动物模型。方法以脂质体2000介导chickenβ-actin-GFP-neo和chickenβ-actin-DsRed-neo转染人结直肠癌细胞HCT-116,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达红色和绿色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养。BALB/CA-nu裸鼠皮下接种1×10^6个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像系统观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达GFP、DsRed的人结肠癌细胞株,将其接种到裸鼠体内可成瘤,利用活体成像系统观察了肿瘤的生长过程,肿瘤的发光随着观察时间的延长而增加。结论红色和绿色荧光蛋白能够在人结直肠癌细胞HCT-116中长期稳定表达,用红色和绿色荧光蛋白标记的人结直肠癌细胞HCT-116建立的裸鼠肿瘤模型为进一步研究结肠肿瘤和相应的药物筛选提供了一种简便、可行的新方法。     

吴茱萸碱抑制人结肠癌HCT-116细胞体外增殖和迁移

吴茱萸碱(Evodiamine,Evo)对人结肠癌HCT-116细胞体外增殖和转移的影响及其可能机制初探。体外培养人结肠癌HCT-116细胞株,加入Evo1.5μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、24μmol/L、48μmol/L、96μmol/L继续培养48 h,CCK-8法检测Evo对HCT-116细胞生存活性的影响;Transwell法和划痕法检测STF-118804、Evo对HCT-116细胞体外迁移的影响;RT-PCR和Western blotting检测不同浓度的Evo(0μmol/L,1.5μmol/L,3μmol/L,6μmol/L)和STF-118804(10μg/L)诱导HCT-116细胞48 h后,细胞中SIRT1、NF-кB、MMP-9蛋白的表达情况。不同浓度的Evo(1.5μmol/L,3μmol/L,6μmol/L,12μmol/L,24μmol/L,48μmol/L,96μmol/L)作用于HCT-116细胞48 h后,细胞的增殖均受到明显抑制(p0.05),且在一定范围内呈浓度依赖性;且Evo能抑制HCT-116细胞的迁移。Evo可明显下调HCT-116细胞内SIRT1、MMP-9 m RNA和蛋白的表达,上调NF-кB m RNA和蛋白的表达。体外实验表明,Evo对结肠癌细胞增殖和迁移的抑制作用是通过抑制SIRT1的表达,激活NF-кB信号通路,进而抑制MMP-9来实现的。