一种获得猪诱导性多能干细胞的新方法

诱导性多能干细胞技术表明,通过过表达4个重编程因子可使体细胞逆转到多能性的状态,为建立更多家畜动物的多能性干细胞系提供了新的方法,如猪、牛、羊等农业动物.莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒载体被广泛应用于小鼠iPS细胞的建系和机制研究上,然而这种病毒只能感染小鼠和大鼠细胞,这限制了它在其他哺乳动物iPS细胞系建立上的应用.本实验采用一种新的逆转录病毒系统,可以高效便捷地从猪成纤维细胞中获得iPS细胞.通过在GP2-293细胞中包装VSV-G蛋白包被的病毒,仅一步感染猪成纤维细胞即可转入4个人源重编程因子（Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc）.在添加有碱性成骨因子bFGF的人类胚胎干细胞培养体系中,成功建立6株和人类胚胎干细胞形态极其相似的猪iPS细胞系.这些猪iPS克隆具有较大的细胞核/细胞质比例、边界清晰、细胞呈扁平状等特征.在体外可以分化成拟胚体,注射入免疫缺陷性小鼠体内可以形成畸胎瘤,含有3种胚层类型的组织.     

兔Oct4启动子驱动RFP基因表达载体的构建及验证

转录因子OCT4在维持和调控胚胎干细胞的多能性中发挥着重要的作用。Oct4基因启动子驱动标志蛋白的表达对研究胚胎干细胞多能性和建立iPs细胞有重要意义。由于GFP在慢病毒转染过程中常用作转染标记,计划构建兔Oct4基因启动子（rOct4）驱动红色荧光蛋白表达的载体,这将有利于兔ES细胞和iPS细胞制备的研究。通过PCR方法扩增rOct4,构建了rOct4驱动RFP基因的表达载体rOct4-RFP。经转染小鼠ES细胞验证正确后,将rOct4-RFP质粒转染兔成纤维细胞系获得rOct4-RFP成纤维细胞系。经过酶切和测序验证,证明rOct4-RFP构建成功,而且能够在小鼠Es细胞系E14中表达细胞红色荧光蛋白,并受细胞分化状态的调控。通过脂质体介导的基因转移、抗性筛选和PCR鉴定建立了rOct4-RFP转基因成纤维细胞系。     

人诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)系的建立

掌握建立人iPS细胞系(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的技术,以便为人肿瘤细胞重编程为iPS细胞建立技术平台.在人胚胎干细胞的培养条件下,通过携带Oct4、Sox2、c-Myc、Klf44个混合因子的慢病毒感染人皮肤成纤维细胞(CCD-1079SK细胞),从而诱导成干细胞样的克隆.根据人胚胎干细胞的特性进行如下鉴定:克隆形态、碱性磷酸酶活性、核型和CCD-1079SK细胞来源的克隆拟胚体(embryoid bodies,EBs)形成及分化等.结果显示,在人胚胎干细胞的培养环境中,导入Oct4、Sox2、c-Myc、Klf44个因子的CCD-1079SK细胞产生了一株iPSC克隆,这株iPSC克隆在细胞形态、增殖能力、胚胎细胞特异性表面抗原以及基因表达与人胚胎干细胞相似,此外,iPSC克隆在体外悬浮培养中形成拟胚体并分化成3个胚层.人iPS细胞系的成功建立为利用iPS细胞技术开展肿瘤细胞重编程研究奠定了坚实基础.     

利用piggyBac转座子制备牛成体多能干细胞诱导技术研究

通过逆转录病毒等媒介表达核转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc可将体细胞重编程为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSc)。时至今日,已经报道了小鼠、人、大鼠、猪、羊、马、牛的iPS细胞,但大动物iPS的多能性特别是嵌合体形成和生殖细胞传代还没有得到确认。与逆转录病毒等不同的是,piggyBac转座子转染效率高且无病毒源性、操作简单,可以在转座酶的存在下被安全切除。首次尝试了采用piggyBac转座子携带鼠源Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Rarg和Lrh16个核转录因子诱导胎牛成纤维细胞,成功获得牛类iPS细胞,其形态与小鼠胚胎干细胞相似,克隆边界清晰、呈丘状、克隆内细胞致密、核大。RT-PCR与免疫组织化学染色分析均显示牛类iPS细胞表达多能性基因。该类细胞体外诱导分化可形成类胚体EB,且表达3个胚层的基因;体内诱导分化可形成畸胎瘤,苏木精、伊红染色显示瘤体有三胚层的分化。上述结果显示利用piggyBac转座子制备牛多潜能干细胞诱导技术可行,产生的牛类iPS细胞具有潜在多能性。     

特定因子诱导多能干细胞

胚胎干细胞由于具有发育上的全能性,被认为是用于移植治疗的最佳来源。然而,由于人的胚胎干细胞直接运用引发免疫排斥以及触及伦理矛盾,人们一直在研发多能干细胞。2006年,多能干细胞的研究有了重大进展。首先,Yamanaka实验室构建用逆转录载体将候选因子导入成纤维细胞,而后检测多能性标志基因的表达。结果发现,四种因子Oct3/4、Sox2、c-Myc以及Klf4的组合产生了表达多能性标志基因才有的抗药性的克隆,意味着细胞获得了多能性。用这种方法筛选的细胞无论在形态和增殖分化能力方面均类似于干细胞,而且表达干细胞标志基因以及在体内外能向三个胚层的细胞类型分化,这种细胞被命名为诱导性多能干细胞(iPS细胞)。进一步,用更严格的筛选基因nanog得到的iPS能够嵌合到生殖系中。而后,运用改进的方法从人的成体成纤维细胞也可以得到iPS细胞。然而,这种方法得到的嵌合体小鼠存在肿瘤形成现象,可能是由于c-Myc逆转录病毒整合到了基因组。通过替代的方法,去掉c-Myc的iPS也能够获得。为了进一步降低肿瘤形成的几率,近来发展了一种不依赖于病毒的方法,用质粒载体作为介质。iPS进一步的研究热点在于安全性以及从更严格的医学角度提高诱导iPS的效率,其分子机理和相关的技术问题也有待解决和克服。     

2012年第3期《遗传》封面说明

2006年,日本京都大学的Yamanaka研究组在《Cell》上率先报道了利用逆转录病毒感染技术,把转录因子Oct3/4、Sox2、Klf4和cMyc导入胚胎或成年小鼠的成纤维细胞中,诱导出与胚胎干细胞极为相似的多能性干细胞,并将其命名为诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS细胞)。相较于胚胎干细胞,iPS细胞的生产不需要卵母细胞或早期胚胎细胞,因而不涉及胚胎毁损等伦理问题;此外,利用自体来源的iPS细胞进行移植治疗将可避免异体间的免疫排     

致心律失常性右室心肌病患者的诱导性多能干细胞系的建立

目的：建立致心律失常性右室心肌病（ARVC）患者特异性的诱导性多能干细胞（iPSCs）,为研究ARVC发病机制提供研究模型。方法：培养来源于ARVC患者皮肤成纤维细胞,并进行突变位点测序鉴定。通过仙台病毒转导入外源性多能转录因子,将ARVC患者皮肤细胞诱导为iPSCs,结合免疫荧光法,实时荧光定量PCR,以及体内外三胚层形成实验对iPS细胞全能型进行鉴定。通过调控Wnt信号通路诱导iPS细胞定向分化为心肌细胞。结果：ARVC患者来源的iPSCs显示碱性磷酸酶阳性,多能性相关基因高表达,胚胎干细胞标志物Oct4,SSEA4,TRA-1-81阳性。体外悬浮培养形成的拟胚体以及体内畸胎瘤形成实验均显示ARVC-iPSCs具有向3个胚层分化能力。经过体外心肌定向,ARVC-iPSC可诱导产生自主节律性搏动细胞团,免疫荧光显示cTnT阳性。结论：本研究使用仙台病毒,建立了无插入型ARVC患者特异的诱导性多能干细胞系,该细胞系具有多能分化特性,并可定向分化为心肌细胞,为研究ARVC的致病因素和药物筛选提供宝贵的实验模型。     

转录因子与诱导型多能干细胞

小鼠的成纤维细胞通过转染四种转录因子（Oct3／4、Sox2、c-Myc和K1F4）可以被诱导转变成类似胚胎干细胞的多能性干细胞,称之为诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPS）,这种多能干细胞在细胞形态、增殖速率、致瘤性、基因表达以及形成嵌合小鼠的能力上与胚胎干细胞有许多相似之处,将来可能成为胚胎干细胞在临床应用中的替代。本文综述了iPS相关的几种转录因子,及其在重编程过程中的作用以及iPS的发展前景。     

人胚胎干细胞传代培养及细胞化学染色特性

目的 体外建立人胚胎干细胞传代培养方法,研究人胚胎干细胞细胞化学染色特性.方法 以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层传代培养人胚胎干细胞,检测人胚胎干细胞、自发分化克隆及拟胚体的细胞化学染色特性.结果 人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传30代以上其形态保持不变;人胚胎十细胞碱性磷酸酶、过碘酸-雪夫反应、α-醋酸萘酚酯酶染色阳性,自发分化克隆细胞阳性程度明显减弱;人胚胎干细胞形成的拟胚体碱性磷酸酶染色弱阳性,过碘酸-雪夫反应、α-醋酸萘酚酯酶染色阳性.结论 小鼠胚胎成纤维细胞能支持人胚胎干细胞传代培养,细胞化学染色结果能初步鉴别人胚胎干细胞未分化特性.     

不同组织来源的细胞建立诱导多能干细胞系的研究

目的:比较不同组织来源的细胞生成iPS细胞的效率,获得高效制备iPS细胞的组织类型.方法:通过四种逆转录病毒(OCT4/SOX2/KLF4/c-MYC)转染羊水细胞、绒毛细胞和皮肤成纤维细胞,建立不同组织来源的iPS细胞系.结果:我们建立了羊水、绒毛细胞和皮肤细胞三个不同组织来源的iPS细胞系,并对其多能性基因Oct4、Nanog以及分子表面标记Tra-1.60以及体外分化为三个胚层能力进行鉴定,发现利用羊水细胞建立iPS细胞的效率显著高于绒毛细胞和皮肤细胞.结论:羊水细胞可能是制备iPS细胞的理想细胞类型.     

限定因子诱导胎猪成纤维细胞重编程为多能性细胞

尝试运用限定因子融合蛋白建立猪的诱导多能性干细胞．试验采用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种限定因子经慢病毒表达载体系统介导感染猪胎儿成纤维细胞,对表达外源限定因子的猪胎儿成纤维细胞进行培养传代,逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆,细胞集落生长状态稳定、核型正常、碱性磷酸酶检测为阳性,免疫细胞化学检测显示,Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性,体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤．结果证实分离培养的细胞克隆为猪诱导多能性干细胞,为进一步完善诱导方案和深入研究应用猪诱导多能性干细胞奠定了基础．     

两种细胞来源的21-三体综合征诱导多能干细胞系的建立及比较

21-三体综合征是染色体异常导致的疾病,通过重编程21-三体综合征患儿两种组织来源的细胞成为多能干细胞,比较两种组织来源的细胞建立21-三体综合征诱导多能干细胞（T21-iPSCs）系的效率,为进一步研究21-三体综合征发病机制提供细胞模型,并为选择高效制备T21-iPSCs的组织类型提供理论依据。该实验利用慢病毒介导4种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）分别诱导人21-三体综合征的羊水细胞和胎儿皮肤成纤维细胞,建立诱导多能干细胞系（Trisomy 21 human amniotic fl uid induced pluripotent stem cells,T21 hAF-iPSCs;Trisomy 21 human dermal fi broblast induced pluripotent stem cells,T21 hDF-iPSCs）,T21 hAF-iPSCs及T21 hDF-iPSCs在蛋白和mRNA水平上均表达人胚胎干细胞的多能性分子标记,如Oct4、Nanog等,具有在体外及体内分化三个胚层的能力,其在培养过程中能维持异常核型并能维持自我更新状态。结果发现,利用羊水细胞建立T21-iPSCs效率高于皮肤成纤维细胞,羊水细胞可能是制备T21-iPSCs的理想细胞类型。     

经典饲养层细胞Wnt表达的差异及其对人胚胎干细胞Wnt/β-Catenin信号通路的影响

目的:研究比较三种经典饲养层体系使用的成纤维细胞中Wnt基因的表达,及其对共培养的人胚胎干细胞的影响。方法:PCR验证19种Wnt基因在三种不同来源饲养层细胞中的表达情况,q PCR验证各组共培养人胚胎干细胞的Wnt/β-Catenin信号通路相关基因表达水平,流式检测其在不同密度饲养层条件下的增殖分化情况。结果:在全部19种Wnt基因(Wnt1,Wnt2,Wnt2b,Wnt3,Wnt3a,Wnt4,Wnt5a,Wnt5b,Wnt6,Wnt7a,Wnt7b,Wnt8a,Wnt8b,Wnt9a,Wnt9b,Wnt10a,Wnt10b,Wnt11,Wnt16)的表达检测中,昆明白小鼠来源饲养层细胞表达其中的16种,ICR小鼠来源饲养层细胞表达其中的10种,人成纤维细胞来源饲养层细胞表达其中的10种;增加饲养层细胞密度能够不同程度活化Wnt/β-Catenin信号通路下游基因的表达,并激活人胚胎干细胞中的负反馈机制;高密度小鼠饲养层条件促进人胚胎干细胞的分化,高密度人饲养层条件促进人胚胎干细胞的增殖和分化。结论:不同经典饲养层体系提供的Wnt环境不同,其培养的人胚胎干细胞状态也有差异。     

诱导多能干细胞研究进展

用4个外源基因从完全分化的人成纤维细胞诱导获得了具有胚胎干细胞特性的诱导多能干细胞(iPS细胞),成功逆转了细胞单向发育的规则,取得了细胞重编程和干细胞研究中的重大突破.围绕c-Myc基因和基因载体、诱导效率和外源基因替代因子等方面的研究内容,综述了自2007年人iPS细胞构建至今,国内外在改进iPS细胞诱导方法上的主要研究进展.     

巴马香猪诱导多能干细胞系的建立

猪在农业和生物医学领域应用非常广泛,尤其是基因修饰的小型猪在器官移植和建立人类疾病模型中有重要的意义。然而,真正的猪胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)尚未建立,这极大地限制了转基因猪的产生。目前,诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)技术是产生多功能干细胞的有效策略。虽然猪iPS cells建系已有数篇报道,但许多有价值的小型猪的iPS cells仍有待建系。利用可诱导基因表达慢病毒系统(Tet-on系统)在小型猪贵州巴马香猪骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)内过表达外源基因Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4,获得两株巴马香猪iPS细胞系(biPS4-1,biPS4-2)。获得的巴马香猪iPS cells与人ES cells(hES cells)形态相似;呈碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)阳性;表达干细胞特异的标志物SSEA4、Tra-1-81、Nanog、Rex1和CDH1等,但不表达SSEA1;核型检测正常。进一步的研究显示,它在体外和体内均能分化为外、中、内三胚层,具有多向分化的潜力。可诱导的巴马香猪iPS细胞的建立将为建立转基因猪提供便捷的工具,而基于该细胞系建立的转基因猪也有望服务于医学基础研究和器官移植等临床研究。     

单细胞因子支持人胚胎干细胞生长的培养体系

[目的]为2株中国人胚胎干细胞系建立培养液中仅添加1种细胞因子的培养体系。[方法]两株人胚胎干细胞h ES-846XX和h ES-18 46XY分别使用含有成纤维细胞生长因子(b FGF)160ng/ml、转化生长因子(TGFβ1)20ng/ml和noggin 200ng/ml的培养液进行无饲养层培养,观察细胞的生长情况并对所得细胞进行鉴定。[结果]培养液中添加b FGF 160ng/ml可以有效地支持人胚胎干细胞的长期增殖,传代8次的细胞仍然保持胚胎干细胞的特性。添加TGFβ1或noggin的培养基无法维持人胚胎干细胞的长期增殖,3代以后细胞完全分化。[结论]证明培养液单独添加高浓度b FGF 160ng/ml支持2株中国人胚胎干细胞长期保持未分化状态增殖,实际未分化率为68.2±1.08%。     

人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究

目的寻找可以维持人胚胎干细胞未分化生长的人源性细胞作为饲养层细胞,从而解决使用鼠源性细胞作为饲养层带来的安全问题。方法尝试以人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞来培养人胚胎干细胞,检验其是否可以维持人胚胎干细胞的未分化生长状态。用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,光镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测其表面标志;诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行分化。将人胚胎干细胞系H1接种于丝裂霉素C灭活后的人脐带间充质干细胞上,每隔5d进行一次传代。培养20代后,对人胚胎干细胞特性进行相关检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达、分化能力。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117,不表达CD14、CD38、CD133、CD34、CD45、HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能。人胚胎干细胞在人脐带间充质干细胞饲养层上培养20代后,继续保持人胚胎干细胞的典型形态,碱性磷酸酶染色为阳性,免疫荧光染色显示OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60的表达为阳性,SSEA1表达为阴性,体外悬浮培养可以形成拟胚体。结论人脐带间充质干细胞可以作为人胚胎干细胞的饲养层细胞,支持其生长,并维持其未分化生长状态。     

造血直通车——从人成纤维细胞未经多功能干细胞直接转化成血液前体细胞

用转录因子诱导的多功能干细胞(induced pluripotentstem cell,iPS)应用于临床治疗病人目前有三个障碍:一是诱导效率极低,二是致肿瘤性,三是iPS的定向分化。最近,Szabo等可以将人成纤维细胞直接转化成多种血液细胞,无需经过多能干细胞阶段。他们在人成纤维细胞中高表达转录因子     

LSD1通过和Oct4/Nanog相互作用调节诱导多能干细胞的形成

将4个转录因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc转入成纤维细胞可以生成诱导多能干细胞(iPS细胞),转录因子和染色质修饰因子在这个过程中起重要作用。LSD1作为染色质结构的调节因子,在早期胚胎发育和ES细胞分化中发挥着关键作用。为了探索LSD1在iPS细胞产生过程中的作用,首先比较了LSD1蛋白在MEFs和ES细胞中的表达量,然后分别通过在重编程体系中过表达LSD1、加入RNAi和抑制剂的方法探索LSD1的功能,最后用免疫共沉淀的方法初步发现LSD1的作用机制。结果表明,LSD1在ES细胞中的表达量高于MEFs中,过表达LSD1对iPS细胞的形成效率没有影响,而RNAi抑制LSD1的表达和LSD1抑制剂tranylcypromine都能促进iPS细胞的形成。免疫共沉淀实验表明LSD1和Oct4/Nanog有相互作用。这些数据说明LSD1通过和Oct4/Nanog相互作用调控iPS细胞的形成。     

体细胞重编程为诱导多能干细胞的研究

通过逆转录病毒将4个基因(Oct4 、 Sox2、c-Myc和Klf4)导入小鼠胚胎成纤维细胞 (mouse embryonic fibroblast, MEF)中,能诱导形成胚胎干细胞样特性的诱导多能干(induced pluripotent stem, iPS)细胞.人类iPS细胞的成功构建开拓了广泛的应用前景.本文简要综述了 iPS细胞的基因筛选,转导基因的选择以及iPS细胞的表观遗传特性等.