精制Vero细胞狂犬病疫苗的灭活和纯化

通过狂犬病病毒灭活和纯化试验,试验精制Vero细胞狂犬病疫苗。疫苗经检测残余小牛血清白蛋白含量,Vero细胞残余DNA含量,疫苗效价,安全试验均能达到WHO规程要求。初步建立了适合大规模生产精制Vero细胞狂犬病疫苗的灭活和纯化工艺。     

地高辛标记DNA探针杂交法检测Vero细胞DNA残留量的适用性验证及应用

目的对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行适用性验证及应用。方法对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行特异性、灵敏度及稳定性验证,并应用该方法检测3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的DNA残留量。结果地高辛标记探针的标记效率为0.1 pg。验证结果显示探针与非同源DNA无杂交;最低检测限度为1 pg;探针在-20℃放置7个月后,检测灵敏度仍可达到1 pg;3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中残留DNA含量均符合《中国药典》规定质量控制标准。结论地高辛标记DNA探针杂交法特异性、灵敏度好,结果稳定,适用于人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量的检测及疫苗生产过程和其成品的质量控制,对其他以Vero细胞为基质的病毒性疫苗质量控制具有借鉴意义。     

地高辛标记探针检测生物制品中残余DNA含量

用地高辛标记探针检测由传代细胞系生产的人用精制狂犬病疫苗,重组（CHO细胞）乙肝疫苗,出血热疫苗及痢疾多糖结合疫苗原液中残余DNA含量。结果表明,该方法特异性强,灵敏度高,可用于上述生物制品中残余DNA含量的检测。     

Vero细胞作为基质的病毒性疫苗研制进展

使用传代细胞系Vero细胞生产脊髓灰质炎疫苗和狂犬病疫苗已有多年的历史。随着传代细胞系潜在致癌性的相关检测技术不断发展完善,消除了人们对其潜在致癌性的担忧,监管部门正逐步认可使用传代细胞系来生产病毒性疫苗。目前,Vero细胞被越来越多地用于生产病毒类疫苗,并用生物反应器工艺取代转瓶工艺,便于规模化培养。本文就Vero细胞作为基质研制的病毒性疫苗作一综述。     

Vero细胞狂犬疫苗的研制

利用自建的狂犬病毒Vero细胞适应株和细胞反应器微载体系统培养Vero细胞和狂犬病毒,病毒滴度达到6．0～8．0log(10)LD(50)／ml。病毒原液纯化后制出的纯化狂犬疫苗质量基本上均能达到WHO对此类型疫苗的主要质控要求。表明疫苗小量试制工艺基本可行。     

应用生物反应器建立人用冻干狂犬病疫苗(Vero细胞)生产工艺的研究

应用15L生物反应器,采用片状载体对Vero细胞进行高密度培养、制备高毒力滴度的狂犬病毒收获液,经纯化后生产人用冻干狂犬病疫苗。采用15L生物反应器对培养方法(批次培养和连续灌流培养)进行试验,收获高毒力滴度的狂犬病毒收获液并制备人用冻干狂犬病疫苗。结果表明:Vero细胞在接种狂犬病毒后可以连续收获病毒液达到25d以上,冻干狂犬病疫苗的效价可以达到5.54IU/剂。本工艺可以用于进行大规模的人用冻干狂犬疫苗的生产。     

精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺的建立

分别用Srpharose4B、Sephacryl-200HR和Sepharose6-Fastflow柱色谱进行地鼠肾细胞狂犬病疫苗浓缩原液纯化试验,试制精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗.对疫苗的残余牛血清含量、效力、收获率和安全性进行检测,优化和建立了精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺.     

粗制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺的建立

分别用Sepharose 4B、Sephacryl-200HR和Sepharose6-Fast flow柱色谱进行地鼠肾细胞狂犬疫苗浓缩原液纯化试验,试制精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗。对疫苗的残余牛血清含量、效力、收获率和安全性进行检测,优化和建立了精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺。     

微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗

本文研究在生物反应器中用微载体连续灌注培养Vero细胞生产狂犬病毒制备技术。在5L体积的生物反应器中,加入含10g/L微载体的199培养基,接种Vero细胞至细胞浓度达到1×105/mL,培养7d后细胞可生长至6~7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种狂犬病毒VaG株,接毒后24h开始收获,连续收获12d左右,收获的病毒滴度范围在6.0~8.5logLD50/mL,收获的病毒原液经浓缩、灭活和纯化等步骤制备成疫苗,各项质量指标均达到《中国生物制品规程》2000年版要求。实验表明,用生物反应器微载体灌注培养制备人用Vero细胞狂犬病疫苗小试工艺可行。     

微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗

本文研究在生物反应器中用微载体连续灌注培养Vero细胞生产狂犬病毒制备技术.在5L体积的生物反应器中,加入含10g/L微载体的199培养基,接种Vero细胞至细胞浓度达到1×105/mL,培养7d后细胞可生长至6～7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种狂犬病毒VaG株,接毒后24h开始收获,连续收获12d左右,收获的病毒滴度范围在6.0～8.5log LD50/mL,收获的病毒原液经浓缩、灭活和纯化等步骤制备成疫苗,各项质量指标均达到<中国生物制品规程>2000年版要求.实验表明,用生物反应器微载体灌注培养制备人用Vero细胞狂犬病疫苗小试工艺可行.     

Purification, potency and immunogenicity analysis of Vero cell culture-derived rabies vaccine: a comparative study of single-step column chromatography and zonal centrifuge purification

Continuous Vero cell lines are more suitable for large-scale production of rabies vaccine. The purification of Vero cell-derived rabies vaccine is critical because of the residual cellular DNA and serum proteins. The perfection of techniques using column chromatography with different matrix material, gel filtration and zonal centrifugation is of paramount importance for the optimal purification of rabies vaccine, leaving minimal residual cellular DNA, below the permissible level of 100 pg per dose and serum protein content of 1 ppm. In this study the potency, immunogenicity and safety of Vero cell-derived rabies vaccines were compared following purification by densely or loosely packed DEAE-sepharose CL-6B columns with different bed heights or by zonal centrifugation. The optimal virus recovery and maximum removal of substrate DNA and serum proteins were achieved only when the sepharose CL-6B column bed height was maintained at a thickness of 2-2.5 cm. The rabies virus material was purified by layering over the matrix without applying pressure. DEAE-sepharose CL-6B column purification using a simplified, cost effective technique as described in this study enhances the antigen yield by 50% in comparison with zonal purification.     

狂犬病毒CTN—1株在Vero细胞上的适应传代研究

本文报导了用我国狂犬病毒固定毒人二倍体细胞适应株（ＣＴＮ－１）进行Ｖｅｒｏ细胞适应传代研究。通过连续传代培养,滴度可达８．０１ｏｇＬＤ５０／ｍｌ,达到了ＷＨＯ规定的不需浓缩的标准。病毒用０．０１ＭＯＩ感染细胞其产量与１Ｍｏｌ感染量相仿。病毒增殖高峰在４－５天,维持达１５天无明显下降,且可连续收获４－５次。因此,该毒种符合ＷＨＯ提出的疫苗生产毒种要求,可用于狂犬病疫苗生产。     

狂犬病毒aG株在Vero细胞上传代适应研究

为研制有效、安全和稳定的Vero细胞狂犬病疫苗提供实验室基础资料。采用狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上进行传代适应,同时对该毒株在Vero细胞上的增殖条件,病毒液的回收方法进行研究。结果显示,狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上多次传代后获得一株Vero细胞适应株(4aG-V株),该毒株的毒力可达8.50 logLD50/ml,且具有很好的抗原性及免疫原性。结果表明,感染Vero细胞最适种毒比例为1∶103,病毒滴度随着时间的延长而增强到第12天后逐渐减弱,且采用低温冻融破碎法回收的病毒液滴度优于直接收液法。4aG-V株在Vero细胞上维持时间长,可连续收液,有望其生产高滴度的狂犬病毒液。     

Vero细胞无血清培养技术的研究与应用

Vero细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细胞系。随着对疫苗质量和安全性要求的不断提高,用无血清培养基取代含血清培养基培养Vero细胞已成为病毒疫苗生产的一个重要发展趋势。Vero细胞无血清培养的技术关键是研发或选择能支持细胞以贴附培养方式生长的无血清培养基。微载体培养是贴附依赖性细胞系规模化培养和病毒疫苗生产的有效技术途径。我们对Vero细胞无血清培养基的研发、Vero细胞无血清培养及病毒疫苗生产工艺做了讨论,对该领域存在的问题和发展策略进行了展望。     

硫酸鱼精蛋白去除Vero细胞乙脑疫苗残余DNA方法的条件优化

Vero细胞规模化生产疫苗时利用硫酸鱼精蛋白可去除乙型脑炎纯化疫苗中Vero细胞的DNA,实验中对不同条件进行了比较。首先在Vero细胞冻融浓缩液中分别按终浓度2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml加入鱼精蛋白去除DNA,确定0.2~2mg/ml均有良好去除效果;其次将Vero细胞培养的乙脑病毒浓缩液分3组:第1组按2mg/ml、1mg/ml和0.5mg/ml分别沉淀一次、两次;第2组加入终浓度1mg/ml PS后调pH值为pH6.0、6.4、6.8、7.2、7.6;第3组将NaCl浓度调整至0.029mol/L、0.145mol/L、0.725mol/L,加入终浓度1mg/mlPS。确定低浓度多次沉淀、pH值6.8~7.2、盐浓度0.145mol/L条件下沉淀效果最好。     

一种新型原代地鼠肾细胞（PHKC）精制狂犬病疫苗的实验室质量评估

本文通过对一种新型疫苗－ＰＨＫＣ精制狂犬病疫苗的全面实验室检定并与法国Ｖｅｒｏ细胞狂犬病疫苗比较,认为该疫苗安全性良好,纯度较高,与法国Ｖｅｒｏ细胞狂犬病疫苗具有相同的免疫效果。     

肾综合征出血热双价纯化疫苗（Vero细胞）安全性的研究

在肾综合征出血热（HFRS）双价纯化疫苗（Vero细胞）的研制中,对病毒培养用Vero细胞致瘤性和试制疫苗的过敏原性进行了动物实验研究,结果表明,病毒培养用Vero细胞无致瘤性,三批试制疫苗无过敏原性。说明用Vero细胞为培养介质的HFRS双价纯化疫苗是安全的。