CrylAb蛋白在拟环纹豹蛛体内的富集及对其体内酶活性的影响

用Cry1Ab蛋白处理的果蝇喂养拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata,在第1d、3d、5d、7d、9d、11d用酶联免疫(ELISA)检测技术测定实验组和对照组拟环纹豹蛛体内Cry1Ab蛋白含量,运用紫外分光光度法检测拟环纹豹蛛体内超氧化物歧化酶( SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性,探讨拟环纹豹蛛体内Cry1Ab蛋白的富集作用与其体内3种酶活性的关系.结果表明,从第1d至第7 d Cry1Ab蛋白在拟环纹豹蛛体内均具富集作用(p＜0 05),到第7d的时候达到最高值,达极显著差异(p＜0.01),然后逐渐降低,但仍显著高于对照(p＜0.05).SOD酶活性总体趋势是降低的,在第7d达到最低;用Cry1Ab蛋白处理拟环纹豹蛛后其体内的AChE和GSH-Px酶活性随饲养时间的延长而增加,并均高于对照组(p＜0.05).该研究证明Cry1Ab蛋白在拟环纹豹蛛体内具有富集效应,并且其体内Cry1Ab蛋白对其体内GSH-Px、AChE具有一定诱导作用,对SOD酶具有一定程度的抑制作用.     

转基因水稻表达的Bt蛋白对拟环纹豹蛛（Pardosa pseudoannulata）体内保护酶活性的影响

把取食24h的转Cry1Ab／Cry1Ac基因水稻叶片的稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis（Guenée）幼虫,分别喂养拟环纹豹蛛3天、6天、9天、12天后,采用酶活力测定方法探究了转基因水稻表达的Bt蛋白对拟环纹豹蛛体内3种保护酶（SOD、POD和CAT）活性的影响。结果表明：就整体来看,实验期间处理组蜘蛛体内3种保护酶（SOD、POD和CAT）的活性均受到Bt蛋白的影响,且前期3种保护酶活性均表现不同程度的被抑制,明显低于对照组。在实验过程中,SOD活性随着处理时间的增加而逐渐增强,至处理第9天时达到最大值;同时处理组POD、CAT活性也随着处理时间的增加而增强,实验初期（前6天）均显著低于对照组,而至第9天则均高于对照组。由此可见,Bt基因在水稻体内所表达的Bt蛋白能够沿食物链传递至次级消费者,并且在一定程度上对次级消费者产生影响。     

Cry1Ab蛋白在拟环纹豹蛛体内的富集及对其体内酶活性的影响

用Cry1Ab蛋白处理的果蝇喂养拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata,在第1d、3d、5d、7d、9d、11d用酶联免疫（ELISA）检测技术测定实验组和对照组拟环纹豹蛛体内Cry1Ab蛋白含量,运用紫外分光光度法检测拟环纹豹蛛体内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）、乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性,探讨拟环纹豹蛛体内Cw1Ab蛋白的富集作用与其体内3种酶活性的关系。结果表明,从第ld至第7dC~IAb蛋F1在拟环纹豹蛛体内均具富集作用（P〈0．05）,到第7d的时候达到最高值,达极显著差异（p〈0．01）,然后逐渐降低,但仍显著高于对照（p〈0．05）。SOD酶活性总体趋势是降低的,在第7d达到最低;用Cry1Ab蛋白处理拟环纹豹蛛后其体内的AChE和GSH—Px酶活性随饲养时间的延长而增加,并均高于对照组（p〈0．05）。该研究征明Cry1Ab蛋白在拟环纹豹蛛体内具有富集效应,并且其体内Cry1Ab蛋白对其体内GSH—Px、AChE具铂一定诱导作用,对SOD酶具有一定程度的抑制作用。     

听觉对拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)定位猎物的影响

为探明蜘蛛的听觉感受器在寻觅定位猎物中的作用,在实验室内比较拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)对有果蝇振翅声源端和无声源端的反应。结果表明:近距离内,拟环纹豹蛛对有声源端选择指数显著高于无声源端,但距离增大至15 cm后,拟环纹豹蛛选择指数无显著差异;拟环纹豹蛛停留时间也呈类似变化,距离12 cm内,拟环纹豹蛛在有声源端停留时间较长,多于总观察时间的1/2,且拟环纹豹蛛在有声源端停留时间显著高于无声源端,距离增加后,拟环纹豹蛛对声音敏感程度下降,停留时间无显著差异;总之,离声源距离越近,拟环纹豹蛛对声音的敏感性越高,随着距离增加,敏感性逐渐降低,声源间距与拟环纹豹蛛成功定位猎物有明显负相关性,拟环纹豹蛛在一定距离下可以依靠听觉定位猎物;另外,拟环纹豹蛛性别对听觉感受器的敏感度有一定影响,雌性拟环纹豹蛛对果蝇振翅声音更为敏感,选择指数更高。     

四种杀虫剂对拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)肠黏膜通透性的影响

采用异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-D)作为示踪物质,通过检测拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)血液内的荧光素浓度,研究了两种生物源杀虫剂和两种化学源杀虫剂对拟环纹豹蛛肠黏膜通透性的影响.结果表明:4种杀虫剂处理后拟环纹豹蛛血液中的荧光素浓度远高于对照组,各个处理组拟环纹豹蛛血液样本中的荧光素浓度均与对照组存在极显著差异,可见4种杀虫剂均将对拟环纹豹蛛肠黏膜的屏障功能造成损伤,导致大分子物质易于通过;其中1.5%除虫菊素水乳剂三保奇花和Bt制剂强杀处理后拟环纹豹蛛中肠黏膜的通透性高于仿烟碱类化学杀虫剂吡虫啉处理组,差异达到显著水平,但与有机磷杀虫剂敌百虫处理组差异不显著.拟环纹豹蛛的肠黏膜组织亦具有一定的抗逆能力,接受单次杀虫剂处理后,存活的拟环纹豹蛛其肠黏膜的屏障功能约在6～10d内可以恢复.     

应用单克隆抗体评价拟环纹豹蛛对褐飞虱的控制作用

应用褐飞虱的单克隆抗体 4 B8研究了 1999年浙江大学华家池校区农场汕优 6 3单季晚稻田中拟环纹豹蛛对褐飞虱的捕食作用。采用盘拍法的调查结果表明 ,褐飞虱、拟环纹豹蛛种群数量高峰期均在水稻生长后期 (9月中旬 ) ,最大种群密度分别为12 6头 /丛和 1.83头 /丛。对每次捕获的每头拟环纹豹蛛样品的抗体夹心 EL ISA检测结果表明 ,拟环纹豹蛛对褐飞虱单克隆抗体的阳性反应率与田间褐飞虱的生物量及拟环纹豹蛛对褐飞虱的占有量显著相关。定量评估结果表明 ,在此密度条件下 ,拟环纹豹蛛对褐飞虱的最大捕食率仅为 2 .2 8%。拟环纹豹蛛对褐飞虱的平均捕食量、总捕食量和捕食率与田间褐飞虱的生物量显著相关。总捕食量、捕食率与拟环纹豹蛛种群密度极显著相关     

Cry1Ab蛋白对拟环纹豹蛛胚胎发育过程中形态和化学物质含量变化的影响

利用稻田蜘蛛优势种拟环纹豹蛛为研究对象,检测Cry1Ab蛋白在拟环纹豹蛛卵囊内的含量及Cry1Ab蛋白对拟环纹豹蛛胚胎发育过程中形态特征的变化、化学物质含量和卵粒内4种保护酶活性的影响。结果表明：在胚胎发育过程中,卵粒中Cry1Ab蛋白含量随发育时间延长而减少,通过对卵粒中的化学物质的测定,发现蛋白质含量水平对照组要显著高于实验组（P〈0.05）,糖和脂肪含量对照组和实验组之间无显著差异。卵粒内超氧化物歧化酶（SOD）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）4种酶活力除了GSH-Px酶活力实验组高于对照组外,其余3种酶活力均低于对照组。通过石蜡切片和液体石蜡透明观察,实验组较对照组胚胎发育历期延长。该研究证明在胚胎发育时期Cry1Ab蛋白影响了卵粒内SOD、AchE、GSH-Px和CAT酶的活力,且Cry1Ab蛋白对拟环纹豹蛛的胚胎发育产生了一定程度的影响。     

拟环纹豹蛛的视觉距离和颜色选择

为了探明拟环纹豹蛛（Pardosa pseudoannulata）的视觉距离与环境颜色选择情况,通过采用死果蝇(Drosophila melanogaster)和拟环纹豹蛛为试验材料,自制试验设备,分别测定了拟环纹豹蛛的视觉距离（3 cm、4 cm、5 cm、6 cm、7 cm）和其对红、橙、黄、绿颜色的选择。第一组试验中,在拟环纹豹蛛饥饿的情况下,观察记录其对不同距离下果蝇的选择停留时间,以此来确定它们的视觉距离。第二组试验中,观察记录拟环纹豹蛛对不同颜色的选择停留时间,以此来确定它们的环境颜色选择情况。第一组试验结果表明,拟环纹豹蛛在视觉上可以感知距离,它们的视觉对于3cm,4cm,5cm,6cm这4个距离的果蝇都具有敏感性。拟环纹豹蛛对距离3 cm和距离4 cm的果蝇的视觉敏感性相近且最好,对距离5 cm和距离6 cm的果蝇仍具有视觉敏感性,且敏感性相近,但对距离5cm比距离4cm的果蝇的偏爱选择指数明显下降（P<0.05）,说明敏感性显著下降,对距离7 cm以上果蝇的视觉感知几乎不存在。通过拟环纹豹蛛选择停留在有果蝇处的标准曲线y=-9.6770x 118.74,R2=0.8378和选择停留在无果蝇处的标准曲线y=9.6750x-18.729,R2=0.8377,可知随着果蝇距离的增加,拟环纹豹蛛视觉的感知性逐渐减弱,甚至消失,说明果蝇的距离与拟环纹豹蛛视觉的敏感性呈负相关的关系。第二组拟环纹豹蛛对颜色选择的试验中,通过计算出拟环纹豹蛛对4种颜色的偏爱选择指数,即红色为35.40%±1.60%,绿色36.03%±1.60%,黄色18.01%±1.60%,橙色10.56%±1.60%,得出拟环纹豹蛛对黄色和橙色的敏感性显著低于对红色和绿色的敏感性（P<0.05）,它们对红色和绿色最敏感,说明拟环纹豹蛛对不同波长的光色敏感性存在差异。     

拟环纹豹蛛对白背飞虱的嗅觉反应

采用视觉屏蔽法和Y型嗅觉仪法研究了拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata.雌性成虫对水稻害虫白背飞虱Sogatella furcifera嗅觉反应.在视觉屏蔽的条件下,拟环纹豹蛛对被刺死猎物的捕食成功率为78.95%,高于没有视觉屏蔽蜘蛛的捕食成功率(68.18%),但2者间差异不显著;而在Y型嗅觉仪中,34.38%拟环纹豹蛛雌性成虫能正确选择猎物的方向,显著高于错误的选择(6.25%).因此,拟环纹豹蛛能依靠嗅觉正确判断猎物的方向而进行捕食活动.     

2种杀虫剂对拟环纹豹蛛的毒力测定

采用浸渍法测定了2种杀虫剂对化学防治田（化防田）和生物防治田（生防田）中的拟环纹豹蛛Pardosa　pseudoannulata田间种群的毒力。结果表明,甲胺磷对拟环纹豹蛛杀伤较大,但锐劲特在高剂量下两地种群的死亡率也较高。甲胺磷对拟环纹豹蛛的毒力回归方程和LC50分别为：化防田y=1.387 7 x＋0.837 4, 999.09 mg/L,生防田y=1.778 4 x＋0.880 4, 207.23 mg/L;;锐劲特对拟环纹豹蛛的毒力回归方程和LC50分别为：化防田y=2．0215x＋0．0620,277．22mg／L,生防田y=2．0948x＋0．1568,205．11mg／L。锐劲特对两地稻田蜘蛛的毒力均大于甲胺磷,因此水稻生产中要合理使用农药,或与其他杀虫剂混配使用以达到最大限度的保护天敌。     

Effect of Cry1Ab protein on hemocytes of the wolf spider Pardosa pseudoannulata

Studies on the effect of Cry1Ab protein on hemocytes of the wolf spider Pardosa pseudoannulata revealed that Cry1Ab protein could accumulate in the four-instar and adult spiders via the food chain from transgenic rice expressing Cry1Ab protein through its prey brown planthoppers with approximate 20-time enrichment, but could not accumulate in hemolymph of the spider. The accumulated Cry1Ab had no significant effects on several elements of hemolymph including stored energy, calcium ion concentration and apoptosis rate of the hemocytes, indicating that Cry1Ab could not affect the hemocytes of P. pseudoannulata.     

转Bt基因水稻表达的毒蛋白Cry1Ab在害虫及其捕食者体内的积累动态

在室内对转基因水稻KMD1中的Cry1Ab毒蛋白经食物链在几种主要害虫及其捕食性天敌体内的积累进行了研究。结果表明： 无论是水稻孕穗期还是成熟期,二化螟Chilo suppressalis连续取食KMD1或取食KMD1.36 h后移至对照品种秀水11上取食不同时间后,幼虫体内的Cry1Ab含量均随取食时间延长逐渐下降。稻眼蝶 Mycalesis gotama幼虫连续取食KMD1或在KMD1上取食两天后移至秀水11上继续取食不同时间,体内的Cry1Ab含量也都随取食时间延长而下降,但下降速度较二化螟更快。取食KMD1的二化螟和稻眼蝶幼虫的粪便中均检测到较高浓度的Cry1Ab,对照组中均无Cry1Ab。取食KMD1的二化螟幼虫血淋巴中检测到Cry1Ab,含量为3.5 ng/g。取食KMD1的褐飞虱 Nilaparvata lugens、稻蚜Sitobion avenae以及饲喂取食过KMD1的二化螟或稻眼蝶幼虫的拟水狼蛛Pirata subpiraticus体内都含有一定浓度的Cry1Ab,其中,拟水狼蛛体内的CrylAb含量以饲喂取食KMD1稻眼蝶幼虫的含量最高,约为饲喂取食KMD1二化螟幼虫的60倍。这些结果表明Cry1Ab可以沿水稻害虫天敌食物链传递。     

转Bt基因稻谷对印度谷螟生长发育的影响

为建立仓储阶段转Bt水稻安全性评价中靶标害虫抗性汰选研究体系,配制了含不同比例(70%,50%,30%,10%)转Bt基因(Cry1Ab/Cry1Abc)明辉63水稻谷粉(简称Bt谷粉)的人工饲料饲喂印度谷螟Plodia interpunctella(Hübner),测定其对1～3龄幼虫在72h内的急性毒力,及对印度谷螟种群生长发育的影响,并采用ELISA法检测转基因稻谷和末龄幼虫体内Bt蛋白含量。结果发现:4种比例人工饲料对幼虫的毒力作用均发生在取食48h后,72h后剂量效应明显。含Bt水稻较高比例的饲料对印度谷螟发育的负面效应明显:幼虫死亡率高,发育历期延长。Bt蛋白在幼虫体内含量与对应饲料中的含量基本成正比。综合考虑,将Bt杀虫蛋白含量2.35μg/g作为转Bt基因稻谷对印度谷螟的亚致死剂量最为合适。     

模拟失重对大鼠血清胃泌素、胃动素和胃窦Cajal间质细胞的影响

目的：研究尾悬吊模拟失重环境对大鼠血清胃泌素（GAS）、胃动素（MTL）和胃窦Cajal间质细胞（ICC）的影响。方法：健康雄性Wistar大鼠64只随机分为8组（rt=8）,按模拟失重时相分别设为6h、12h、1d、2d、3d、5d、7d和0h（地面对照组）组,采用尾悬吊法建立模拟失重动物模型。应用放免法测定血清GAS、MTL浓度,免疫组化和RT—PCR技术检测各组大鼠胃窦组织中c—kit蛋白和mRNA表达情况。结果：尾悬吊6、12h阶段,血清GAS浓度明显升高,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;随尾悬吊时相延长,血清GAS含量呈逐渐下降趋势,与正常对照组水平相近。尾悬吊各组大鼠血清MTL浓度均升高,12h以后各组MTL浓度值与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。免疫组化结果显示,c—kit蛋白阳性表达为棕褐色,主要分布在ICC胞体和突起,正常对照组大鼠胃窦肌层ICC（ICC—MY）呈连续性浓染,肌层内ICC（ICC—IM）亦明晰可见;6h-5d的尾悬吊过程中,大鼠胃窦ICC—MY连续性出现中断现象且逐渐明显,染色逐渐减弱,ICC—IM染色减弱的同时c—kit阳性ICC也明显减少;7d组胃窦组织中c—kit蛋白表达有所恢复。模拟失重各组及对照组大鼠胃窦组织中均有c—kitmRNA表达,尾悬吊6、12h组的c—kitmRNA表达明显下降,与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）,1～3d组逐渐恢复,5d组又出现明显下降（P〈0．05）,7d组c—kitmRNA表达值明显复升。结论：尾悬吊模拟失重对大鼠血清GAS、MTL和胃窦Cajal间质细胞c—kit蛋白及mRNA表达造成明显影响,可能导致胃动力障碍。     

Transgenic Cabbage Expressing Cry1Ac1 Does Not Affect the Survival and Growth of the Wolf Spider,Pardosa astrigera L. Koch (Araneae: Lycosidae)

Both herbivores that consume transgenic crops and their predators can be exposed to insecticidal proteins expressed in those crops. We conducted a tritrophic bioassay to evaluate the ecotoxicological impacts that Bt cabbage (Brassica oleracea var. capitata) expressing Cry1Ac1 protein might have on the wolf spider (Pardosa astrigera), a non-target generalist predator. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays indicated that protein levels were 4.61 ng g^-1 dry weight in fruit flies (Drosophila melanogaster) fed with the transgenic cabbage and 1.86 ng g^-1 dry weight in the wolf spiders that preyed upon them. We also compared the life history traits of spiders collected from Bt versus non-Bt cabbage and found no significant differences in their growth, survival, and developmental rates. Because Bt cabbage did not affect the growth of fruit flies, we conclude that any indirect effects that this crop had on the wolf spider were probably not mediated by prey quality. Therefore, exposure to Cry1Ac1 protein when feeding upon prey containing that substance from transgenic cabbage has only a negligible influence on those non-target predatory spiders.     

CO_2倍增和转Bt水稻对二化螟幼虫的生理影响

通过开顶式气室研究了CO2浓度倍增(750vs.375μL/L)对取食转Bt水稻及其对照亲本秀水11的二化螟Chilo suppressalis(Walker)幼虫体内代谢酶乙酰胆碱酯酶(AChE)和保护酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD和过氧化氢酶CAT)活力的影响,以期明确该类害虫对大气CO2浓度升高及转Bt水稻的生理响应。研究结果表明:(1)AChE受CO2浓度水平影响显著,与对照CO2处理相比,高CO2条件下该酶活力显著降低;(2)高CO2水平及水稻中Bt毒素蛋白的存在均会导致二化螟幼虫体内POD活力显著降低,SOD初期活力显著升高,但不能维持较长时间,CAT活力表现为先升后降的特点;(3)当受到水稻品种、CO2浓度水平和取食时间的综合影响时,以上代谢酶和保护酶活力会发生显著变化。短时间内二化螟幼虫可通过体内以上生理代谢调节减缓受CO2浓度升高和水稻中Bt毒素蛋白的不利影响,但长时间环境胁迫下这种应对不利环境的响应机制将会失去作用,最终导致种群适合度的降低。     

Cry1Ab杀虫蛋白在水稻-褐飞虱-拟水狼蛛食物链中转移与富集

采用ELISA方法检测了2个转cry1Ab基因水稻（Bt水稻）品系KMD1和KMD2不同生育期叶鞘内Cry1Ab杀虫蛋白的含量及其通过褐飞虱和拟水狼蛛的转移和富集情况。结果表明,这2个品系中抽穗期和黄熟期叶鞘内Cry1Ab的含量均显著低于苗期、分蘖期和孕穗期,KMD1和KMD2中Cry1Ab杀虫蛋白可以通过食物链转移到Bt水稻非靶标害虫褐飞虱及其天敌拟水狼蛛体内。褐飞虱在KMD1或KMD2上取食2 d后,体内均含有Cry1Ab杀虫蛋白,但连续取食2、4、6、8和10 d后,其体内含量并未因取食时间的延长而呈现明显增加的趋势。当拟水狼蛛捕食以KMD1或KMD2为食的褐飞虱时,在捕食2、4、6、8和10 d后,其体内均可检测到Cry1Ab杀虫蛋白,其含量并未随捕食时间的延长而明显上升,但均显著高于相应时间褐飞虱体内的含量。可见,该蛋白可通过水稻转移至褐飞虱,再转移至拟水狼蛛,并存在明显的富集现象,而这种富集并不随蜘蛛捕食时间的延长而加强。拟水狼蛛捕食以KMD1或KMD2为食的褐飞虱时,其捕食量未受到显著影响,其中肠酶粗提物对Cry1Ab杀虫蛋白具有明显的降解作用。     

Impacts of nitrogen fertilizer on major insect pests and their predators in transgenic Bt rice lines T2A‐1 and T1C‐19

Nitrogen is a critical factor for plant development and nitrogen input is one of the important tactics to enhance the development and yield of crops. Nevertheless, nitrogen input could influence the occurrence of insects positively or negatively. Nitrogen is also one of the main elements composing the insecticidal crystal (Cry) protein. Cry protein production could affect nitrogen partitioning in Bt plants and as such nitrogen input may influence insect pest management in transgenic Bt rice, Oryza sativa L. (Poaceae). To test this possibility, we evaluated the impacts of nitrogen regimes on the main insect pests and their predators on two Bt rice lines, T2A‐1 and T1C‐19, expressing Cry2A and Cry1C, respectively, and their non‐transgenic parental counterpart MH63. The results showed that Cry proteins with different nitrogen regimes have enough insecticidal activity on rice leaffolder, Cnaphalocrocis medinalis Guenée (Lepidoptera: Crambidae), in both laboratory and field experiments. Laboratory studies indicated that relevant parameters of ecological fitness in brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) (Hemiptera: Delphacidae), a non‐target insect pest, were significantly affected by nitrogen input both on Bt and MH63 rice lines. Nymphal survival, female adult longevity, and egg hatchability in N. lugens differed significantly among rice varieties. The experiments conducted in rice fields also demonstrated that nitrogen was positively correlated with the abundance of N. lugens on Bt rice, similar to that on MH63 rice. The abundances of two predators – the wolf spider Pirata subpiraticus (Boesenberg & Strand) (Araneae: Lycosidae) and the bug Cyrthorhinus lividipennis Reuter (Hemiptera: Miridae) – were significantly affected by rice growth stages but not by nitrogen input and rice varieties. In conclusion, the above results indicate that high nitrogen regimes for Bt rice (T2A‐1 and T1C‐19) and non‐Bt rice (MH63) cannot facilitate the management of insect pests.