鸡肾型传染性支气管炎病毒FX株的分离和鉴定

从自然发生的鸡肾病变型传染性支气管炎病例采集病死鸡肾脏为材料,通过接种9－11日龄SPF鸡胚尿囊腔,进行病毒的分离和传代,分离到1株病毒（FX）,敏感鸡人工感染后出现呼吸症状,剖检病鸡时大我鸡肾肿大并有尿酸盐沉积,病毒能死鸡胚和产生侏儒胚;病毒能干扰鸡新城疫病毒LaSota株在鸡胚中增殖,病毒经电镜观察,其大小在80－120nm之间,囊膜外有纤,病毒经IBV单抗ELISA检测呈强阳性反应。研究结果初步表明,FX毒株为肾型IBV。     

鸡传染性支气管炎病毒变异株的分离及其S1基因序列分析

本实验对山东省泰安地区某蛋鸡场产蛋下降鸡群发生的临床症状疑似鸡传染性支气管炎病例,无菌采集气管、肺脏、肾脏等组织,接种SPF鸡胚,经病毒形态观察、血凝特性试验、动物回归试验等证实,我们鉴定到一株鸡传染性支气管炎病毒(IBV);病毒中和试验表明,该病毒为一株变异毒株,使用国外针对IBV793/B血清型发表的血清型特异性引物经RTPCR方法获得了该毒株的免疫原基因S1基因,初步确定该传染性支气管炎病毒变异毒株为793/B血清型。     

鸡传染性支气管炎病毒变异株的分离及其S1基因序列分析

本实验对山东省泰安地区某蛋鸡场产蛋下降鸡群发生的临床症状疑似鸡传染性支气管炎病例,无菌采集气管、肺脏、肾脏等组织,接种SPF鸡胚,经病毒形态观察、血凝特性试验、动物回归试验等证实,我们鉴定到一株鸡传染性支气管炎病毒(IBV);病毒中和试验表明,该病毒为一株变异毒株,使用国外针对IBV 793/B血清型发表的血清型特异性引物经RT-PCR方法获得了该毒株的免疫原基因S1基因,初步确定该传染性支气管炎病毒变异毒株为793/B血清型.     

一株鸭源传染性支气管炎病毒的分离鉴定及结构蛋白基因和血清型分析

【目的】对从广西某鸭场发生呼吸道感染的11天龄樱桃谷肉鸭分离到的病毒株进行鉴定,并探索此鸭源病毒分离株的遗传变异情况。【方法】通过血凝试验、鸡胚接种实验、3?端非编码区(3'UTR)基因扩增与序列测定对分离株进行鉴定,并对该分离株的结构基因S1、E、M和N分别进行序列测定以及相似性、系统进化树分析和血清型鉴定。【结果】血凝试验为阴性,接种鸡胚盲传5代后出现侏儒胚,3?UTR基因测序结果表明为传染性支气管炎病毒(IBV)序列。该分离株S蛋白的裂解位点为RRSRR,S1、E、M和N基因与IBV毒株H120、4/91、LTD3核苷酸相似性分别为:78.6%–99.7%、85.4%–100.0%、91.6%–93.2%、86.7%–91.7%。除N基因存在点突变外,S1、E和M基因均存在氨基酸的突变、插入和(或)缺失。系统进化树分析显示,其S1基因属于4/91型,E、M和N基因均为LDT3型。血清型分析表明,该分离株的血清型不同于疫苗株H120和4/91。【结论】此鸭源病毒分离株为IBV,且该分离株的基因型与血清型均发生了变异。本研究结果暗示禽类传染性支气管炎的防控面临着更严峻的挑战。     

一株引起普通棉耳狨猴死亡病毒的分离与鉴定

1999年6月,天津医科大学动物中心饲养的珍贵灵长类实验动物--普通棉耳狨猴群体中暴发急性呼吸道传染病,病死率高达33%.在排除细菌感染的基础上,通过死亡狨猴肺组织匀浆接种鸡胚和MDCK细胞的分离培养,分离出一株具有高血凝效价的病毒株.经双份血清试验及动物接种试验,确认该病毒是本次疾病流行的病原体.又进一步通过与常见呼吸道病毒标准毒株及血清进行交叉血凝抑制试验、电镜观察、RT-PCR技术并结合生物信息学方法对该毒株进行鉴定,确认本次疾病流行的病原体是副流感1型病毒中的仙台病毒.     

一株引起普通棉耳狨猴死亡病毒的分离与鉴定

1999年6月,天津医科大学动物中心饲养的珍贵灵长类实验动物——普通棉耳狨猴群体中暴发急性呼吸道传染病,病死率高达33％。在排除细菌感染的基础上,通过死亡狨猴肺组织匀浆接种鸡胚和MDCK细胞的分离培养,分离出一株具有高血凝效价的病毒株。经双份血清试验及动物接种试验,确认该病毒是本次疾病流行的病原体。又进一步通过与常见呼吸道病毒标准毒株及血清进行交叉血凝抑制试验、电镜观察、RT—PCR技术并结合生物信息学方法对该毒株进行鉴定,确认本次疾病流行的病原体是副流感1型病毒中的仙台病毒。     

鸭细小病毒04Nb株的分离鉴定与rep基因测序与分析

采集浙江宁波地区以腹泻、呼吸困难为主要症状的病鸭肝组织,接种正常鸭胚尿囊腔增殖病毒.雏鸭感染试验显示发病症状及病理变化明显,死亡率为75%.电镜下可见纯化病毒直径约20nm左右的球形病毒粒子.免疫琼脂扩散实验结果显示与鸭细小病毒(duckparvovirus DPV)标准株阳性血清有明显沉淀线.经SDS-PAGE呈现3条结构蛋白带,与DPV标准株一致;参照GenBankDPV非结构蛋白基因序列设计引物,PCR扩增反应获得目的条带,克隆测序后,与DPV代表株序列同源性达98%.根据上述实验结果,确定引起本次鸭场疫病的病原为DPV.为进一步研究该分离株rep基因的序列特征,对其rep基因克隆测序,与GenBank中两株DPV、两株鹅细小病毒(GPV)进行序列比对,结果显示rep基因核苷酸序列与DPV参考毒株同源性为98%以上,与GPV同源性为80%左右.     

鸭细小病毒04Nb株的分离鉴定与rep基因测序与分析

采集浙江宁波地区以腹泻、呼吸困难为主要症状的病鸭肝组织,接种正常鸭胚尿囊腔增殖病毒。雏鸭感染试验显示发病症状及病理变化明显,死亡率为75%。电镜下可见纯化病毒直径约20nm左右的球形病毒粒子。免疫琼脂扩散实验结果显示与鸭细小病毒(duckparvovirusDPV)标准株阳性血清有明显沉淀线。经SDS-PAGE呈现3条结构蛋白带,与DPV标准株一致;参照GenBankDPV非结构蛋白基因序列设计引物,PCR扩增反应获得目的条带,克隆测序后,与DPV代表株序列同源性达98%。根据上述实验结果,确定引起本次鸭场疫病的病原为DPV。为进一步研究该分离株rep基因的序列特征,对其rep基因克隆测序,与GenBank中两株DPV、两株鹅细小病毒(GPV)进行序列比对,结果显示rep基因核苷酸序列与DPV参考毒株同源性为98%以上,与GPV同源性为80%左右。     

细胞源与鸡胚源传染性支气管炎病毒激活JAK-STAT信号通路的差异性研究

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)对鸡的呼吸道、肾脏和输卵管等器官造成严重损伤,主要引起鸡产蛋率下降和雏鸡死亡.目前通过鸡胚传代获得IBV疫苗株和流行毒株.IBV Beaudette株是目前实验室研究的经典毒株,已经适应人源和猴源细胞,可利用Vero细胞进行制备.有研究表明,IBV感染延迟干扰素的表达,并对JAK-STAT信号通路具有拮抗作用.本研究中发现,通过Vero细胞制备的IBV Beaudette株,在感染早期激活STAT1,通过鸡胚制备的IBV Beaudette,则不能有效激活STAT1.进一步研究发现,鸡胚传代的IBV QX株和新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)亦不能有效刺激JAK-STAT信号通路.两种制备病毒的方式分别得到不同的试验结果,推测是由于在病毒感染条件下,Vero细胞分泌到培养液中的细胞因子所致.进一步研究揭示,病毒感染条件下,细胞分泌的因子,瞬时激活了 STAT1.本研究对于病毒的制备方式对天然免疫信号通路的影响,具有一定的参考和借鉴作用.     

猪源新城疫病毒JL01株分离鉴定及F基因遗传进化分析

2000年,在吉林省某猪场发生具有较高发病率和死亡率的急性传染病,发病率达到40%～50%,病死率15%,取其脾、肺、肾等组织进行电镜观察,可见副粘病毒样颗粒,表明其病原可能为某种猪源副粘病毒,命名为JL01株。在对该病毒的的血凝、血凝抑制等生物学特性进行鉴定后,初步确定该种猪副粘病毒为猪源新城疫病毒。病毒回归试验表明,纯化的病毒对猪仍有较强的致死性,并可从死亡猪体内分离到新城疫病毒。该病毒对鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和半数致死量(EID50)分别为55.2h、1.60和10-7.5/0.1 mL,表明该毒株属于新城疫病毒强毒株。在此基础上,采用RT-PCR方法克隆了猪源新城疫病毒F基因,与其他10株NDV毒株进行序列比较分析,结果表明,JL01株与B1、LaSota、Clone30等经典的新城疫病毒弱毒株同源性较高(91.5%～98.5%),与ZJ1、Mukteswar等强毒株的同源性较低。F基因氨基酸裂解位点的序列为112G-K-Q-G-R-L117,与弱毒株序列完全相同。基因分型结果表明JL01株属于基因Ⅰ型。因此,本研究所分离到感染猪的新城疫病毒属于基因变异的新城疫病毒弱毒株...     

传染性支气管炎病毒江苏分离株核蛋白基因序列测定与同源性分析

将本室鸡传染性支气管炎病毒（IBV）江苏省地方分离肾型毒株JS／95／03接种鸡胚,分离、纯化病毒,提取单股RNA做为反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）的扩增模板。用Genbank公开序列多重比较后设计一对引物,使用单管RT－PCR方法,物异扩增IBV核蛋白（N）基因5'端854bp的片段,扩增产物纯化后测,序列分析表明,IBV N基因也存在较大变异,此毒株与呼吸型疫苗株M41序列同源性最高。     

传染性支气管炎病毒江苏分离株 核蛋白基因序列测定与同源性分析

将本室鸡传染性支气管炎病毒（IBV）江苏省地方分离肾型毒株JS/95/03接种鸡胚,分离、纯化病毒,提取单股RNA做为反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的扩增模板。用Genbank公开序列多重比较后设计一对引物,使用单管RT-PCR方法,特异扩增IBV核蛋白（N）基因5'端854 bp的片段。扩增产物纯化后测序,序列分析表明,IBVN基因也存在较大变异,此毒株与呼吸型疫苗株M41序列同源性最高。     

引起免疫失败的IBV分离株的生物学特性及结构基因分析

本研究应用鸡胚尿囊腔接种的方法,从广西患传染性支气管炎的免疫失败的病鸡中分离到一株传染性支气管炎病毒(IBV)(命名GX-YES),通过间接血凝试验、动物回归试验和气管环交叉中和试验对该毒株进行鉴定和主要生物学特性的研究,同时利用RT-PCR技术扩增克隆该病毒的SI基因和N基因并测定其核苷酸序列.结果表明:该病毒株有间接血凝性;致病性较强;血清型不同于常用疫苗株H120、Ma5、4/91.同源性分析表明,SI基因核苷酸和氨基酸序列与参考株的同源性分别为63.5%～81.2%和50.7%～78.8%;N基因核苷酸和氨基酸序列与参考株的同源性分别为85.7%～87.2%和89.5%～91.7%;SI基因和N基因系统进化分析表明分离株与其它参考毒株的亲缘关系较远.SI基因和N基因分型与血清学试验结果相吻合.本研究结果提示了广西分离株GX-YL5可能是一个新的变异株,这可能是目前免疫失败的重要因素,同时也为研制适合本地使用的IBV疫苗提供了科学依据和物质基础.     

伪狂犬病毒(PRV) GZ-JS2017株的分离鉴定及主要毒力基因分子特征分析

为查明贵州省遵义地区某规模化养殖场猪只发生急性死亡的病因,以及明确病原主要毒力基因的分子特征。本试验采用PCR技术、细胞接种试验、动物试验及透射电子显微镜观察等方法进行病原的分离鉴定,并对该病原的主要毒力基因进行克隆、测序及生物信息学分析。结果显示:PCR检测可扩增出PRV特异性核酸阳性条带,接种Vero细胞后可见明显CPE现象,在透射电子显微镜下可见囊泡中呈圆形、160 nm左右的成熟病毒粒子,胞核中可见病毒包涵体和实心、空心2种无囊膜病毒粒子;接种健康猪可引起神经症状,最后麻痹死亡;通过生物信息学分析显示该毒株的gE、gC、gD及TK基因序列均与参考毒株中湖北HNX株和河南HN1201株相对应的核苷酸同源性最高,且在gE基因的48位和496位都有1个天冬氨酸(Asp)的插入;根据gE、gC、gD及TK基因序列的遗传进化树结果显示本次分离毒株与2011年以后所分离鉴定的变异毒株属同一分支。说明本试验成功分离鉴定一株猪伪狂犬病病毒变异毒株,以期为贵州省猪伪狂犬病病毒的流行及变异提供一些参考。     

人偏肺病毒在传代细胞和人呼吸道上皮细胞中分离和鉴定

人偏肺病毒（Human metapneumovirus,HMPV）是2001年鉴定出的新发呼吸道病毒,婴幼儿、老人和免疫抑制人群易感,引起上呼吸道和下呼吸道感染,目前尚无疫苗和特异性治疗方案。为获得北京地区HMPV临床流行毒株,本研究将经荧光定量PCR检测为HMPV阳性的鼻咽抽吸物样本分别接种LLC-MK2、Vero-E6和分化良好的人呼吸道上皮细胞（Human Airway Epithelium,HAE）,观察细胞病变、检测免疫荧光、电镜观察病毒形态、测定病毒滴度及分析复制特点,对分离获得的HMPV分离株进行鉴定。结果表明,HMPV感染LLC-MK2细胞可形成合胞体,但在Vero-E6中多呈单个细胞感染;经免疫荧光检测,HAE、LLC-MK2和Vero-E6细胞均可见绿色荧光;电镜结果可见病毒为近似球型的颗粒,有包膜和刺突,直径约在150nm～200nm之间;HMPV在HAE和LLC-MK2两种细胞上的复制特点基本相同。本研究成功建立了临床样本在LLC-MK2、Vero-E6和HAE分离培养HMPV的方法,分离并鉴定了HMPV临床分离株,为HMPV感染机制的研究奠定基础。     

鸽基因Ⅶ型新城疫病毒的分离鉴定

从外表健康的法国进口鸽中分离到一株鸽Ⅰ型副粘病毒(FP株),电镜观察病毒形态不规则,以圆形为主,平均直径100mm～120mm,表面有许多突起。其鸡胚平均死亡时间(MDT)为59．2h,鸡脑内接种指数(IcPI)为1．88。接种1月龄鸽能使其发病。出现明显症状和病变并有80％试验鸽死亡,接种2月龄SPF鸡全部死亡。经多重RT—PCR鉴定,属速发型新城疫病毒。应用RT—PCR技术对F基因重要功能区片段扩增后进行序列测定、分析表明,F蛋白裂解位点处的序列(112R—R—Q—K—R—117F)与新城疫强毒在这一区域的序列相符。与国内强毒F48E9株、疫苗毒Lasota株的核苷酸同源性分别为84．1％、82％,氨基酸同源性为84．5％、80．6％。与多株已报道的NDV参考株相应片段进行序列比较,经遗传基因进化树分析,鉴定为基因Ⅶ型,由此首次报道了鸽源基因Ⅶ型NDV株的存在。     

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及全基因序列分析

2006年从辽宁省某猪场采集具有流感症状猪鼻拭子共30份,经9~11日龄SPF鸡胚分离,对分离株进行了血凝试验、血凝抑制试验、RT-PCR亚型鉴定,全基因序列比对和接种试验动物试验。结果表明:该毒株具有凝集0.5%鸡红细胞的活性,且与抗猪流感H1标准血清发生血凝抑制反应,RT-PCR分别扩增得到全基因8个片段,利用DNAStar生物学软件进行序列分析,HA基因与GenBank登录的H1~H16中的H1基因序列同源性最高,NA基因与N1~N9中的N1基因序列同源性最高,故该LN株分离毒为猪流感H1N1亚型病毒。全基因序列中,除了M基因不是猪源的,其它基因片段均与国内H1N1亚型猪流感参照株高度同源,推测LN株可能是由类人和类禽谱系的流感病毒与古典猪谱系的流感病毒重排形成的;用该病毒接种试验动物可成功复制出猪流感典型症状。该病毒的分离鉴定及全基因组序列分析为我国进一步调查猪流感的流行规律提供了基础数据。     

鸡传染性支气管炎病毒ZZ2004分离株3a、3b及E基因的序列测定与分析

采用随机引物PCR技术从具有腹泻、呼吸道症状及肾脏病变的肉鸡及无明显症状但生长迟缓的鸭体内获得一段长1171bp的片段,将此片段克隆入pMD18-T载体,测序后将序列用网上的BLAST软件和DNASTAR软件进行分析,结果表明所测序列与IBV主要参考毒株的同源率为82.0%-94.4%,与国内主要毒株CK/CH/LGD/04III、CK/CH/LGD/04II、chicken/JS/YZ07/2008、CK/CH/LSC/99I、SAIBK的同源率较高,达92.4%-94.4%,与国外毒株M41、H120、Beaudette、IBV4/91的同源性较低达85.2%-87.9%,从而确定所分离毒株ZZ2004为肾型传染性支气管炎病毒。     

鸡地方性肾型传染性支气管炎油佐剂双价灭活疫苗的研制

鸡肾型传支病的病原（IBV）为冠状病毒,该病毒的血清型较多,不同型之间小能完全交叉保护,而且血清型的分布有一定的地区性,故研制适用于本地区的疫苗是控制本病的最佳途径。本研究从典型病变鸡尸中分离出6株IBV,用10d龄鸡胚传至4代后,经系统鉴定及电镜观察,确认了所分离每株JN6为IBV。测定分离株JN6EID5n为10－4.375,对照标准株（澳大利亚T株）为10－3.243。经琼脂扩散试验分析,2毒株在抗原结构上存在一定差异,故选用此2株为种毒,经鸡胚增殖后,收取尿囊液,按1：1混合后火活,按1：3制成油性剂议价大活疫苗,再经杂检、…     

NDV山东分离株的生物学特性及其HN基因的克隆与序列分析*

2004年从山东某鸡场发病蛋鸡群中分离到一株新城疫病毒(编号:ShD-2-04),对其生物学特性进行了研究,并对其HN基因进行了克隆和序列分析。结果表明:该病毒的最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间(MDT)为50.4,1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数(ICPI)为1.85,6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2.42,表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征;其HN基因开放性阅读框架(ORF)为1,716bp,编码571个氨基酸;与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,核苷酸