猪伪狂犬病毒Fa株侵染对PK-15细胞microRNAs表达谱的影响

【目的】分析猪伪狂犬病毒Fa株(PRV-Fa)侵染对猪肾传代细胞PK-15 microRNAs(miRNAs)表达谱的影响。【方法】利用Illumina高通量测序技术,鉴定感染和非感染PRV-Fa的PK-15细胞的miRNAs;筛选并利用实时荧光定量RT-PCR(RT-q PCR)验证差异表达miRNAs;对差异miRNAs进行靶基因预测和Gene ontology(GO)分析。【结果】在感染和未感染PK-15细胞中分别检测到384个和405个miRNAs,其中感染PRV-Fa后差异表达的miRNAs共127个(60个上调,67个下调)。荧光定量结果显示差异miRNAs的表达趋势与高通量测序结果一致。GO分析显示,miRNAs广泛参与信号传导、细胞代谢、免疫反应、基因表达等生物学进程,其中miR-10b、miR-16、miR-18a、miR-19b、miR-20a、miR-145-5p、miR-146a、miR-181a、miR-499-5p等miRNAs与免疫相关。在靶基因调控网络图中,ssc-miR-30a-5p与ssc-miR-30d处于关键位置。研究鉴定出5个新的病毒编码miRNAs,其中PRV-miR-LLT2与PRV-miR-LLT4靶向PRV早期蛋白基因EPO。【结论】伪狂犬病毒Fa株感染对PK-15细胞编码miRNAs有显著影响。     

甘蔗耐寒相关miRNA的生物信息学分析及其靶基因预测

为了解不同基因型甘蔗(Saccharum officinarum)响应低温胁迫的分子机制,该研究以低温胁迫4 ℃处理 24 h 后的3个不同耐寒性甘蔗品种的叶片为材料进行Illumina HiSeqTM 2000 高通量测序,构建了18个低温胁迫前后sRNA文库。结果表明:(1)共获得分属于84个家族的322个已知miRNA及预测得到110个新miRNA,并在已知miRNA中筛选出100个差异表达miRNA(61个上调,39个下调),新miRNA中筛选出37个差异表达 miRNA(15个上调, 22个下调)。(2)利用psRNATarget、TargetFinder、Tapirhybrid软件对所获得的差异表达miRNA进行靶基因预测,得到1 844个靶基因并进行GO分析揭示其主要功能类别,即分子功能、细胞组分与生物过程。(3)为验证高通量测序数据的可靠性,筛选14个miRNA及其靶基因进行qRT-PCR验证,结果显示这些miRNA均被检测发现且大多表达结果与测序结果一致。(4)鉴定出部分差异表达miRNA的靶基因,这些基因参与植物生长、发育及低温胁迫反应。综上认为,耐寒型甘蔗体内miRNA直接或间接作用靶基因实现表达调控相关代谢途径,对其重要农艺性状均起着关键的调控作用。     

猪β-干扰素的原核表达及其对猪流行性腹泻病毒的抑制作用研究

本研究通过PCR技术克隆了猪β干扰素全基因,设计引物亚克隆猪β干扰素成熟蛋白编码基因并对,5'端1个稀有密码子进行了大肠杆菌偏嗜性改造.构建了猪IFN-β原核单纯表达载体pRLC-poIFNβ,实现了poIFN-β在大肠杆菌中的表达,表达产物约占菌体总蛋白的17.3%.表达产物以包涵体形式存在,用含6mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSH-GSSG复性液复性处理,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后,MDBK细胞-VSV病变抑制法测定结果表明,重组猪β干扰素具有良好的抗病毒活性,约为5.6x105U/mg.用重组猪β干扰素处理猪肾传代细胞PK-15后,细胞病变抑制法(CPE50)测定结果表明重组猪β干扰素可显著抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)的感染.     

猪β-干扰素的原核表达及其对猪流行性腹泻病毒的抑制作用研究

本研究通过PCR技术克隆了猪β干扰素全基因,设计引物亚克隆猪β干扰素成熟蛋白编码基因并对,5’端1个稀有密码子进行了大肠杆菌偏嗜性改造。构建了猪IFN-β原核单纯表达载体pRLC-poIFNβ,实现了poIFN-β在大肠杆菌中的表达,表达产物约占菌体总蛋白的17.3%。表达产物以包涵体形式存在,用含6mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSH-GSSG复性液复性处理,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后,MDBK细胞-VSV病变抑制法测定结果表明,重组猪β干扰素具有良好的抗病毒活性,约为5.6x105U/mg。用重组猪β干扰素处理猪肾传代细胞PK-15后,细胞病变抑制法(CPE50)测定结果表明:重组猪β干扰素可显著抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)的感染。     

人卵巢癌OVCAR3细胞FOXM1相关差异miRNA表达谱分析鉴定

为探究人卵巢癌OVCAR3细胞FOXM1基因敲减前后miRNA表达差异,并建立FOXM1相关miRNA差异表达谱,我们应用感染复数为20的靶向FOXM1 shRNA慢病毒颗粒及阴性对照慢病毒感染人卵巢癌OVCAR3细胞96 h,此后提取并鉴定细胞总RNA,纯化分离miRNA,应用高通量miRNA芯片技术分析2组miRNA的表达差异,并对5倍以上差异表达的miRNA进行RT-PCR验证。通过实验我们共发现34个miRNA发生表达变化,其中上调超过5倍的miRNA 4个:miR-327、miR-505、miR-1297、miR-122;下调超过5倍3个:miR-21、miR-409-3p、miR-200a,其中miR-122、miR-1297、miR-21、miR-200a等4个miRNA经RT-PCR验证为真实差异表达。这表明我们成功建立人卵巢癌OVCAR3细胞FOXM1相关miRNA差异表达谱,所筛选出的差异表达miRNA可能与FOXM1具有密切调控关系。     

猪流行性腹泻病毒功能性受体的鉴定

为研究猪氨基肽酶(Porcine Aminopeptidase N,pAPN)是否作为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的细胞感染受体,通过转染技术,使PEDV非容许性细胞MDCK表达pAPN,并用PEDV感染转染细胞。结果发现转染的MDCK细胞可以感染PEDV,并且该病毒可以在转染细胞中连续传代。免疫荧光法鉴定存在病毒抗原。进一步实验证实,抗pAPN血清可以抑制PEDV感染转染的MDCK细胞。这些结果展示转染的MDCK细胞、pAPN表达及PEDV病毒复制之间存在直接联系,证明pAPN是PEDV的细胞感染受体之一。     

马立克病病毒pUL56蛋白对DF-1细胞免疫通路相关基因的转录调控研究

马立克病病毒（Marek’s disease virus,MDV）UL56基因编码α-疱疹病毒同源蛋白pUL56。为全面了解该病毒蛋白与宿主细胞的互作关系,本研究首先将表达红色荧光蛋白标记的MDV pUL56质粒转染鸡DF-1细胞系,瞬时表达蛋白的细胞经流式细胞术分选,富集阳性细胞群进行高通量测序及mRNA转录组分析。测序结果显示,表达pUL56的DF-1细胞存在914个差异表达基因,其中462个上调,452个下调。通过GO、KEGG和Reactome通路富集分析,发现富集的显著差异表达基因分布于先天性免疫反应、细胞因子产生等相关信号通路。在此基础上,随机选取了I型干扰素信号通路和促炎症细胞因子基因进行RT-qPCR验证,IFI6、IFIH1、CD83、HSP90AA1、IL-1β和IL-8L1基因的表达量均为上调,而IL-12β表达则下调,该结果与高通量测序相符。本研究提示pUL56作为非结构蛋白,可能对宿主细胞过程有广泛的调节作用。     

HMCES蛋白促进猪流行性腹泻病毒在Vero细胞中的复制

【目的】鉴定能够调控猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)复制的关键宿主蛋白。【方法】利用LC-MS/MS技术结合串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)，分析PEDV感染Vero细胞36 h后和未感染组的蛋白组学差异。鉴定筛选了114个显著差异表达蛋白，其中宿主胚胎干细胞特异性5-羟甲基胞嘧啶结合蛋白(5-hydroxymethylcytosine binding,ES cell-specific protein,HMCES)显著上调。进一步构建HMCES真核表达质粒，通过蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR检测过表达HMCES对PEDV复制的影响；合成针对HMCES基因的特异性si RNA，利用Western blotting和RT-q PCR检测si RNA对HMCES表达的干扰效果及HMCES被干扰后对PEDV复制的影响。【结果】过表达HMCES能显著促进PEDV在Vero细胞中复制，并且复制水平随着HMCES的剂量递增呈现剂量依赖式增加；si RNA-341下调内源性HMCES表达进而抑制PEDV复制。【结论】H...     

猪流行性腹泻病毒非结构蛋白nsp9互作宿主蛋白对病毒复制的影响

猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)导致仔猪和育肥猪发生急性肠道传染病，是危害养猪业最重要的病原体之一。目前发现PEDV能够编码至少16个非结构蛋白，其中nsp9能够结合至单链RNA中，但是其功能机制还不清楚。本研究通过免疫沉淀联合蛋白质谱分析，筛选出潜在的与PEDV nsp9宿主互作蛋白。通过进一步免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)和激光共聚焦技术确认了nsp9与热休克蛋白HSPA8、Toll相互作用蛋白Tollip、热休克蛋白HSPA9、线粒体外膜蛋白TOMM70互作。其中，过表达HSPA8使nsp9的表达量先上调而后下调，并促进PEDV的增殖；过表达Tollip使nsp9的表达量显著上调，并抑制PEDV的增殖；过表达TOMM70使nsp9的表达量显著下调，但对PEDV的增殖无明显影响；过表达HSPA9对nsp9的表达以及PEDV的增殖均无明显影响。该研究为探索nsp9互作蛋白在PEDV感染过程中的功能提供了重要信息。     

胆囊结石患者血清microRNA表达谱及其意义

目的:建立胆囊结石患者与健康人的血清microRNA(miRNA)表达谱,并分析其差异miRNA功能。方法:收集解放军总医院诊治的胆囊结石患者的血清(试验组)及健康人的血清(对照组),采用miRNA测序技术,建立胆囊结石患者的miRNA表达谱,并通过qPCR技术验证其差异miRNA,利用生物信息学技术预测其差异miRNA的生物功能。定量资料以x±s描述,两组数据间比较采用t检验。结果:试验组与对照组miRNA表达谱序列分别为14 899 245和11 783 121个,miRNA种类分别为686和633个,其差异表达miRNA为16个,均为下调。GO分析显示差异miRNA的靶基因在细胞过程上富集于细胞转化、生物调节和代谢过程等,在细胞组成上富集于细胞成分和细胞器成分等,在分子功能上富集于结合和活性催化等;KEGG功能分析显示差异miRNA的靶基因主要参与环腺苷酸、催产素、生物节律等代谢通路。利用qPCR方法验证miR-1228、miR-1249、miR-3614和miR-766在2组间差异趋势与测序结果基本一致,其中miR-1228、miR-3614和miR-766在2组间存在统计学差异,而miR-1249无统计学差异。结论:血清中的差异miRNA在胆囊结石的形成中可能发挥重要作用,其对胆囊结石疾病的防治具有重要意义。     

柯萨奇病毒A组10型感染RD细胞的转录组学分析

探讨柯萨奇病毒A组10型（coxsackievirus A10, CV-A10）感染人横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma,RD）细胞的基因表达谱变化,为深入理解CV-A10致病机制提供重要基础数据。本研究将CV-A10以感染复数（MOI）为0.1的剂量感染RD细胞12 h后提取总RNA,通过RNA-Seq技术获取RD细胞中的全部转录本信息,基于生物信息学的方法对差异表达基因进行GO（gene ontology, GO）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）分析。结果显示,共筛选到2 610个差异表达基因,其中表达上调的基因有1 582个,表达下调的基因有1 028个。随机选取8个差异表达基因,经RT-qPCR验证后发现,其变化趋势与转录组数据一致。GO和KEGG富集分析结果显示,差异表达基因主要聚焦于细胞内信号转导、mRNA加工、抗病毒免疫反应等过程。结果表明,CV-A10感染可能会引起RD细胞发生自噬。     

非小细胞肺癌组织中mir-483-5p的差异表达

目的:寻找非小细胞肺癌组织中微小RNA(miRNA)表达谱的差异,并鉴定非小细胞肺癌组织与癌旁组织差异表达的miRNA。方法:应用miRNA芯片分别检测非小细胞肺癌组织与癌旁组织的miRNA表达丰度,并比较两者中差异表达的miRNA;挑选mir-483-5p通过荧光定量PCR进行验证。结果:非小细胞肺癌组织与癌旁组织检测的miRNA表达谱存在较大差异。其中,鳞癌组织中有16条miRNA上调,22条miRNA下调;腺癌组织中有40条miRNA上调,51条miRNA下调。对mir-483-5p进行了定量PCR验证,发现其在非小细胞肺癌组织中的表达丰度显著高于癌旁的正常组织。结论:mir-483-5p在非小细胞肺癌组织中高表达。     

猪轮状病毒感染小鼠肠道组织的转录组分析

猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）是在世界范围内与严重腹泻疾病相关的主要肠道病原体,是新生仔猪肠炎和腹泻致死的重要原因之一。为了深入了解猪轮状病毒感染肠道后其致病机制以及引起宿主的抗病毒和修复机制,我们分别饲喂培养基和猪轮状病毒病毒液5d后,采取5 d、10 d、15 d、20 d、25 d小鼠空肠组织进行高通量转录组测序分析。利用基因本体论（Gene Ontology,GO）数据库功能富集分析、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析差异表达基因（Differentially Expressed Gene,DEGs）,选取部分差异表达基因,进行qRT-PCR验证。结果显示,与对照组相比,5个时间段上调DEGs有849个,下调DEGs有824个。对DEGs进行5个功能富集,有共同差异基因15个。这些差异表达基因广泛参与脂质合成与代谢、免疫、细胞增殖、细胞凋亡等活动,主要注释到PPAR、NOD-like、IL-17等信号通路中。qRT-PCR验证上皮细胞增殖相关基因PBLD、C...     

临床疑似猪非典型瘟病毒感染仔猪小脑组织的转录差异

【背景】猪非典型瘟病毒作为一种新发病毒,近几年在国内各省份中陆续被检出,目前针对猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus,APPV)的研究报道大多集中于基因组学和流行病学,而其感染宿主后的致病机制尚不清楚。【目的】利用高通量测序技术,对感染仔猪小脑组织进行转录水平差异研究,初步探索APPV致病机制。【方法】将实验组3份排除其余能引发仔猪先天性震颤和神经症状相关病原干扰的APPV感染仔猪的小脑组织,与对照组3份健康仔猪的小脑组织进行高通量测序,比较实验组和对照组之间转录水平的差异。【结果】构建了两个cDNA文库：APPV感染小脑组织文库、健康小脑组织文库。在P≤0.05,|log2(FC)|≥0.263的筛选标准下,共筛选出差异表达基因(differentially expressed gene,DEG) 381个,其中上调基因163个,下调基因218个;随机选取8个差异表达的基因,经RT-qPCR检测,以β-actin作为内参基因,结果显示8个差异基因的表达趋势与高通量测序一致。【结论】通过对临床感染APPV的仔猪小脑样本进行转录组研究,通过GO、KEGG对差异基因进行功能注释、分类,发现Pak4、Robo4、Sema3f、Wnt5a等参与轴突导向信号通路的基因转录水平显著下降,可能表明APPV感染可能会导致仔猪体内轴突导向过程受到抑制,进而使其中枢神经系统发育受到抑制,为APPV的致病机制等进一步研究提供了方向和指导。     

基于转录组测序的花烟草低温胁迫响应转录因子挖掘

为了鉴定参与花烟草低温胁迫的转录因子,对花烟草幼苗进行了4℃低温处理,并在处理后12 h采集其幼苗样本,提取总RNA后,采用高通量测序技术,进行了转录组测序。在对差异表达基因进行GO及KEGG分析的基础上,对参与其中的转录因子进行了挖掘,并采用qRT-PCR的方法,对转录组测序的结果进行了验证。结果表明,低温处理后,花烟草基因表达量变化在2倍以上的基因有8388个(P<0.01),其中,上调表达4229个,下调表达4159个。这些差异表达基因的功能归类于生物过程、细胞组分及分子功能3大类69个GO条目,并显著富集在40条KEGG代谢通路中。同时,在低温胁迫下,花烟草有118个转录因子的表达发生了显著改变,其中,上调表达82个,下调表达36个。这些转录因子属于28个家族,其中,数量最多的为NAC家族19个,其次为ERF家族16个、MYB家族15个、WRKY家族15个。本研究的结果为花烟草低温响应分子机制的研究提供了借鉴。     

RNA-Seq探索低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌机制

为了探索低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌机制,本研究采用Illumina HiSeq 4000高通量转录组测序技术对低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌(P10748 MIC:8 mg/L)和利奈唑胺敏感粪肠球菌(3138 MIC:2 mg/L)进行测序及生物信息学分析,以标准菌株ATCC29212作为质量评估参考。利用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行注释与富集分析,并利用荧光定量PCR对测序中的差异表达基因进行验证。结果显示,测序共获得了3.57 Gb有效数据,通过De novo拼接获得1 920条unigenes,总长度为2 122 210 bp,平均长度为1 105 bp。差异基因模式聚类分析显示共有150个显著性差异表达基因(FDR≤0.001,|log2 Ratio|≥1),其中141个上调,9个下调。其中生物膜形成和外排泵相关基因esp、optrA、fexA在耐药菌中显著上调。GO功能注释结果显示,催化活性、代谢过程和细胞是注释最多的条目;Pathway富集分析发现,肽聚糖生物合成、缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸的降解和硫代谢为显著性富集通路(p<0.05)。荧光定量PCR结果与测序结果基本一致。推测膜转运蛋白和生物膜形成可能在耐药机制中具有重要作用,为低水平利奈唑胺耐药肠球菌机制提供了可参考的耐药靶标。     

基于表达谱芯片和下一代测序技术筛选先天性心脏病胎儿心肌组织差异表达的miRNA

目的 联合采用表达谱芯片和下一代测序技术同时高通量筛选先天性心脏病胎儿心肌组织表达差异的miRNA.方法 实验组为孕中期先天性畸形胎儿,对照组为同胎龄无心脏畸形的难免流产的胎儿,取胎儿心室心肌组织,联合采用Agilent Human 2.0 microRNAs表达谱芯片和SOLiD下一代测序技术同时观察心肌组织microRNA的表达变化,数据采用生物信息学方法进行分析,并用实时PCR方法验证芯片结果.结果 通过差异miRNA筛选,发现先天性心脏畸形组在表达谱芯片和下一代测序中共同差异的24个miRNA,生物信息学预测到1 606个靶基因,靶基因Gene Ontology分析表明其中与细胞进程、代谢过程、生物调控相关的靶基因为主,Pathway显著性分析表明,部分靶基因为生物信号通路中的关键因子;随机挑选共同表达差异的4个miRNA进行验证,结果表明定量PCR检测结果与芯片与下一代测序共同筛选结果基本相符.结论 这些在先天性心脏病中异常表达的miRNA为研究先天性心脏病分子水平上的发病机制提供了重要的线索,将有可能为心脏相关疾病的诊断和治疗提供新的靶点和研发新的药物.     

猪CD151转基因PK-15细胞系构建及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒的易感性

[目的]建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)易感的猪CD151转基因PK-15细胞系,研究CD151分子在PRRSV感染猪源细胞中的作用.[方法]用RT-PCR从猪肺泡巨噬细胞中扩增CD151全长cDNA,测序正确后克隆人真核表达载体pcDNA3;用重组载体pcDNA-CD151转染PK-15细胞,经G418抗性筛选获得转基因细胞系PK15-CD151,用RT-PCR和免疫荧光试验检测CD151表达;用VR-2332株PRRSV分别感染PK-15细胞、PK15-CD151细胞、MARC-145细胞和3D4-CD163细胞,定期观察细胞病变,用RT-PCR和免疫荧光试验检测病毒RNA基因组和病毒抗原,用半数组织细胞感染剂量测定病毒滴度.[结果]从猪巨噬细胞中克隆得序列正确的猪CD151 cDNA;从重组载体转染的PK-15细胞培养中筛选得G418抗性细胞克隆,并能正确表达猪CD151分子;在PRRSV感染后,PK15-CD151细胞虽然不表现明显的细胞病变,但能检测到病毒RNA基因组和病毒抗原,并能产生较高滴度的感染性病毒;该细胞系已在体外传30代以上,第10、20、30代细胞的PRRSV滴度无明显变化.[结论]猪CD151基因转染能使非易感PK-15细胞获得对PRRSV的易感性,提示猪CD151参与PRRSV感染猪源细胞.     

中国地鼠口腔颊黏膜癌中miRNA与mRNA表达谱的关联分析

目的构建中国地鼠口腔颊黏膜癌(OSCC)中差异表达的miRNA和mRNA表达谱,初步预测与OSCC发生发展相关的miRNA和mRNA。方法运用新一代高通量测序技术构建miRNA和mRNA表达谱,通过Gene Ontology功能富集和KEGG Pathway分析预测与OSCC发生发展相关的miRNA和mRNA。结果成功构建中国地鼠口腔颊黏膜癌中差异表达的miRNA和mRNA表达谱,共发现11个已知miRNA、3个新miRNA显著性差异表达和194个mRNA差异表达,且一个miRNA可调控多个mRNA,多个miRNA靶向调控某个mRNA。结论本实验OSCC中差异表达的miRNA通过调控mRNA形成复杂的调控网络,在口腔癌的发生发展中发挥重要作用,为口腔癌的发生、发病机制,及临床治疗及预后判断提供理论依据。     

关于miR-223在慢性乙型肝炎患者外周血中的表达及其生物学作用的研究

观察CHB患者与健康人群外周血microRNA(miRNA)差异表达谱,寻找具有抗HBV能力的miRNA.用高通量测序对CHB患者(C组)和健康对照人群(N组)各3例外周血样本进行检测,筛选差异表达的miRNA后进行qRT-PCR验证,并在细胞模型中转染miRNA mimic后,ELISA实验观察对HBsAg和HBeAg水平的影响.测序结果共1028个基因,其中上调的基因有27个,下调的基因有20个,无明显差异的基因981个(log2FC＜-0.585且P＜0.05为标准),取FC改变最显著的5个miRNAs进行扩大样本量qRT-PCR验证,发现只有miR-223表达水平下降83％,与芯片结果保持一致.与未转染相比,在HepG2.2.15细胞中转染miR-223 mimic后,miR-223表达水平上升5.81倍,而HBsAg和HBeAg分泌分别下降了 42％和34％,P＜0.05;而转染阴性对照的miR-223表达水平及HBsAg和HBeAg分泌无明显改变,P＞0.05.miR-223在CHB患者外周血中的表达显著下降,基于miR-223高表达的新型药物有可能对HBV有较好的抗病毒作用.