大豆遗传转化研究进展

综述了大豆遗传转化体系及其优缺点,转基因大豆的研究成果、生产状况和生物安全性评价,分析了大豆遗传转化中存在的一些问题及其解决办法,展望了未来大豆遗传转化的发展前景。     

大豆转基因的研究进展

近年来利用基因工程技术,大豆的遗传转化取得了较大的进展。该文介绍了几种主要的大豆遗传转化系统的优点和缺点。探讨了影响农杆菌介导大豆遗传转化的因素。分析了大豆遗传转化中存在的一些问题及其解决办法,评价了转基因大豆的生物安全性,展望了未来大豆遗传转化的发展前景。     

大豆遗传转化研究进展

近年来大豆的遗传转化取得了较大的进展.文章结合作者实验室的工作介绍了几种主要的大豆遗传转化系统及其操作方法,并探讨了影响农杆菌介导大豆遗传转化的因素.     

大豆遗传转化技术在转基因大豆研究中的应用

大豆是公认的难转化的作物,大豆的遗传转化还没有模式化。利用转基因技术的原理和方法,对大豆遗传体系进行优化,可以实现对大豆产量和品质的改良。综述了应用于大豆遗传转化的研究方法,浅谈转基因技术的重要性,对转基因发展方向进行了展望。现阶段大豆遗传转化的效率依旧偏低,无法形成规模化的转基因体系。因此,建立高效、快速、稳定的大豆组织培养再生体系,解决外源基因难导入的难题,使之广泛应用于大豆生产成为亟待解决的问题。     

大豆转基因体系的研究进展

从大豆的转基因方法和受体系统两个方面概述大豆转基因体系的最新研究进展,并讨论了大豆遗传转化的主要障碍及可能的解决途径。作者认为,以根癌农杆菌介导大豆子叶节和基因枪轰击大豆未成熟子叶是较有效的大豆遗传化系统。目前,在大豆遗传转化研究中存在着大豆组织培养体系有待于进一步完善、遗传转化率较低、重复性差、大豆受体基因型单一等问题,建立新的、高效和稳定的大豆组织培养体系,提高生产上栽培大豆品种的组织培养能力,改遗传转化现有的单一基因为多基因,可能是解决上述问题的有效途径。     

根癌农杆菌介导的高效大豆遗传转化体系的建立

利用根癌农杆菌对来自大豆成熟种子的胚尖进行遗传转化,研究了影响农杆菌介导大豆转化的各种因素,建立了一套优化的大豆遗传转化体系。研究结果表明:菌株KYRT1比EHA105和LBA4404具有更强的侵染能力;较酸的共培养基(pH5.4)、较低的培养温度(22℃)均有利于提高转化效率;恢复培养和分步抗性筛选方式有利于提高抗性组织的存活率和分化率。同时应用这种优化的遗传转化体系,获得了7个大豆品系的转基因植株,转化频率为4.29%-18%。经过PCR和Southern分析证明外源的双价抗虫基因cryIA(c)和pta已经整合到大豆的基因组中。     

根癌农杆菌介导的大豆遗传转化

农杆菌介导法是大豆遗传转化的重要方法之一 ,许多实验室应用该方法得到了转基因大豆 ,但目前使用该方法进行转化的效率还比较低 ,尚需深入研究。农杆菌菌株、大豆基因型、组织培养条件、T-DNA的转移效率和转化后的筛选模式都会影响大豆转化的效率。概述了近年来根癌农杆菌介导的大豆遗传转化的一些重要成果 ,以及转化过程中大豆的易感性与农杆菌的转化能力、乙酰丁香酮促进vir基因活化、转化的受体系统和巯基混合物减轻受体材料的褐化、提高T DNA的转移效率等几个重要因素的研究进展 ,并介绍了转化中常用的几个筛选标记基因 (nptⅡ、hpt、bar基因和突变的ahas基因 )及通过共转化法去除标记基因的方法 ,同时对今后研究的重点进行了讨论.     

大豆成熟种子萌发叶片体细胞胚的高频诱导和遗传转化（英文）

目的 虽然大豆遗传转化取得了较大进展,但其转化效率仍然偏低。因此,有必要建立一个更加简单和高效的大豆转化系统。本研究的目的是以大豆成熟种子萌发产生的叶片（MSDL）为靶外植体,高频诱导和转化大豆体细胞胚（somatic embryos,SEs）。方法 萌发7 d的大豆幼苗上摘取叶片,并将其切成1.2 cm×1.2 cm的外植体。将叶片外植体置于胚胎诱导培养基（EIM）上诱导体细胞胚发生。将叶片外植体浸入携带p CAMBIA1301植物表达载体的农杆菌EHA105菌液进行遗传转化。结果 MSDL （包括初生叶和次生叶）均能被诱导产生SEs。大多数SE发生在叶片切口处。所试的不同基因型均能诱导SEs。SEs的最高诱导率为95.0%。β葡糖醛酸糖苷酶（GUS）染色结果表明,平均转化效率达到75.4%。DNA印迹（Southern blot）结果表明,目的基因稳定整合在大豆基因组中,拷贝数为1～3个。结论 本研究建立了以大豆MSDL为靶组织的体细胞胚高频诱导和遗传转化。该系统有望在大豆基因组编辑技术的开发上得到应用。     

农杆菌介导大豆子叶节影响因素的研究

为提高大豆遗传转化效率,采用农杆菌介导遗传转化的方法,以大豆子叶节为外植体,研究共培养阶段浸染液浓度及外界培养条件(共培养温度和天数)和培养基添加物对转化效率和芽诱导率的影响。结果显示,浸染液OD600=0.5的诱导率最高,共培养温度为24℃,共培养天数为10 d具有较高转化效率,共培养基中加入一定浓度的单壁碳纳米管(Single-wall carbon nanotube,NM)对诱导卡那霉素抗性不定芽有促进作用。PCR检测表明PHR1基因已整合到T1代大豆基因组中,初步证明可在大豆基因组中稳定遗传。     

抗除草剂转基因大豆后代遗传分析

分析了来源于农杆菌介导的4个独立的大豆转化系的后代遗传特性。分别采用种子切片GUS染色方法和除草剂涂抹以及喷洒方法检测gus报告基因和抗除草剂bar基因在后代的表达。其中3个转化系T1代gus基因和bar基因能够以孟德尔方式3：1连锁遗传,说明这2个基因整合在大豆基因组的同一位点。这3个转化系在T2代获得了纯合的转化系,并能够稳定遗传至T5代。有一个转化系在T1代GUS和抗除草剂检测都为阴性,但通过Southern杂交证明转基因存在于后代基因组,显示发生了转基因沉默。为了证明转基因沉默是转录水平还是转录后水平,T1代植物叶片接种大豆花叶病毒（SMV）并不能抑制转基因沉默,说明该转化系基因沉默可能不是发生在转录后水平。     

A simple and efficient method for obtaining transgenic soybean callus tissues

In the present study, a simple and efficient method for obtaining transgenic callus tissues of soybean [Glycine max (L.) Merr.] was developed based on Agrobacterium-mediated transformation. Hypocotyl segments of soybean were used as the starting material. Several factors such as soybean genotype, Agrobacterium concentration, inoculation time, co-cultivation period and addition of antioxidants in co-cultivation medium affecting the transformation efficiency were examined. The explants were cultured on callus induction medium containing 0.5 mg L^?1 6-benzylaminopurine and 2.0 mg L^?1, 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid for callus induction. Callus tissues were induced at both the acropetal and basipetal ends. CaMV35S::GUS and CaMV35S::GFP transgenic callus tissues were obtained using the optimized protocol. The average transformation efficiency reached up to 87.7 % based on GUS detection. From inoculation with Agrobacterium to obtaining transgenic soybean callus will take about 3 weeks. In order to validate this method for gene function investigation, GVG::GmSARK transgenic soybean callus tissues were obtained and their senescence-associated phenotypes were assessed. To our knowledge, this is the first report using hypocotyl segments as starting materials to obtain transgenic callus, and this system provides a method for high-throughput screening of functional genes of interest in transformed soybean callus.     

离子束介导大豆DNA转化小麦后代高蛋白株的RAPD标记分析

利用离子束介导法将大豆DNA导入小麦,经过连续4代田间筛选和蛋白含量测定,获得高蛋白变异株系.采用RAPD分析技术,用34条随机引物对供体大豆、受体小麦和3个高蛋白小麦变异株的基因组DNA进行扩增.有29个引物扩增出清晰稳定的条带,其中18个引物扩增出的条带有不同程度的差异.高蛋白小麦突变株与受体小麦(对照)相比出现了条带的增加、缺失、扩增带深浅等变化,也出现了与受体小麦不同而与供体大豆相同的扩增带.实验结果表明,外源大豆DNA导入受体小麦可以引起后代基因组DNA序列变化,扩大小麦遗传基础.     

Test pigments in media for tissue culture and transformation

Accurate uses of key components and right media during tissue cultures are vital for a particular process and repeatable outcome in plant transformation. If additional components, as indicators, can be added into media, it could avoid some of the issues, such as adding a wrong component or misrecognition of a right medium. We tested to add a specific pigment into a set of media sharing a key common element, such as a selection agent, so that all media containing the same selection agent appeared in a certain coloration to provide a convenient marker for all people involved in the process of transformation. The effect of four color pigments on tissue cultures of corn, rice, and soybean was evaluated in this study. The results show pigment brilliant blue, Pyla-Cert green, and mixture purple neither impacted soybean cotyledon growth nor callus formation and shoot regenerations of corn and rice. In soybean hair root transformation, addition of pigment blue, green, erythrosine red and mixture purple into the selection media did not reduce its transformation frequency and copy number. However, erythrosine red resulted in lower callus formation rates and low regeneration rates among rice and corn. Further, fresh weight and dry weight of soybean cultures were increased on the media containing erythrosine red. Therefore, we recommend using pigment brilliant blue, Pyla-Cert green and mixture purple as indicators for selection agents in the transformation process of maize, soybean, and rice to prevent misuse of wrong components or wrong media.     

反馈抑制不敏感邻氨基苯甲酸合成酶基因作为筛选标记基因用于大豆遗传转化研究

目前广泛采用的抗菌素或抗除草剂基因作为植物转化筛选标记基因可能带来转基因逃逸,因此寻找能够用于植物转化的来源于植物本身的筛选基因是解决这一问题的方法之一。通过从烟草中克隆的邻氨基苯甲酸合成酶基因(ASA2)作为筛选标记基因,并采用氨基酸的类似物5—甲基色氨酸为筛选剂,进行了农杆菌介导的大豆成熟胚尖转化研究。Southern杂交结果表明ASA2基因成功整合到大豆基因组,Northern杂交也显示该基因在转化大豆叶片中表达。HPLC检测转化大豆叶片游离色氨酸的含量比野生型要高59％～123％。PCR检测转化子1代结果显示转化基因通过孟德尔规律稳定遗传。这些结果表明反馈抑制不敏感ASA2基因可以作为筛选标记基因用于大豆遗传转化。同时也证实来源于一种植物(烟草)编码的邻氨基苯甲酸α—亚基能够与另一种植物(大豆)编码该酶的β—亚基结合形成具有完整活性的邻氨基苯甲酸合成酶。对ASA2基因作为一种新的植物转化筛选标记基因的优缺点进行了讨论。     

不同大豆基因型对农杆菌敏感性研究及优异种质筛选

大豆遗传转化一直是植物基因工程领域的难点之一,受体品种对农杆菌的敏感程度以及不同农杆菌菌株对靶组织的侵染能力是影响转化效率的主要因素。本研究利用GUS组织瞬时表达技术,比较了4个农杆菌菌株对靶组织子叶节的侵染能力差异,同时利用筛选到的侵染能力最强的菌株评估了33个不同受体基因型对农杆菌的敏感性。结果表明,超毒农杆菌菌株Ag10对靶组织的侵染能力最强,优于其他3个菌株;地方与野生大豆种质在农杆菌侵染后GUS的平均瞬时表达效率显著高于选育品种。此外,通过鉴定筛选出6个对农杆菌敏感性较高的受体材料,其对农杆菌的敏感性优于前人报道的敏感材料Peking,为大豆高效遗传转化体系的建立和新型转化受体的开发提供了参考。     

非组培转化法获得转基因植株及其Basta耐受性研究

以玉米‘昌7-2’、大豆‘晋遗19’和高粱‘晋粱5号’的种子为受体,质粒pCAMBAR.CHI.11为供体,采用非组培转化法导入bar基因。PCR扩增和Southern杂交分析结果证明,‘昌7-2’、‘晋遗19’和‘晋粱5号’的划胚种子都获得了转化植株,转化率均在5%以上,未划胚种子的转化率为0。共培养液中加入浓度为200μmol/L的乙酰丁香酮(AS)能使玉米种子转化率比对照提高8倍,赋予300W强度的超声波处理,转化率可再提高60%。划胚处理对种子的出苗率影响较大,为17%左右。划胚种子于实验室条件下的Basta耐受试验结果表明,不同作物对Basta的耐受性存在差异,玉米、大豆和高粱转bar基因植株的Basta耐受临界值分别为0.15%、0.1%和0.05%,Basta处理后的幼苗成活率在各作物间差异不大。田间喷雾Basta溶液结果证明,按Basta耐受性大小排列顺序为高粱<大豆<玉米,但按对Basta敏感性的排序为大豆<高粱<玉米。不同生育期喷雾除草剂的实验结果(T2)证明,在生育期后期作物植株对除草剂的敏感性比前期有所降低,生长前期喷雾后玉米、大豆和高粱的苗存活率分别为57%、49%和52%,生长后期喷雾后苗存活率分别为77%、70%和73%,但各个群体的PCR扩增阳性结果率均在80%以上,证明存活率差异是由植株对除草剂耐受性和敏感性的差异引起的。多代转基因植株的检测结果证明目的基因可稳定遗传。