致病菌体内诱导基因的功能分析—体内表达技术的应用

病原菌体内诱导的基因在致病过程中起重要作用,体内表达技术是一类很有前景的研究体内诱导基因的技术,本介绍了体内表达技术的基本原理,类型以及在致病菌体内诱导基因方面的研究进展和应用前景。     

甘蔗宿根矮化病病原菌Leifsonia xyli subsp.xyli 基因组学研究进展

综述甘蔗宿根矮化病病原细菌Leifsonia xyli subsp.xyli(Lxx)基因组组成特征、基因组进化、基因组中致病相关基因与寄主适应性等方面的研究进展,并对该病原茵、引起番茄细菌性萎蔫和溃疡的病原细菌、马铃薯环腐病痛原细菌的基因组和致病相关基因进行比较,发现它们存在同源致病基因,如celA、pat1基因,其致病机理可能有相似性.     

体内表达技术应用于基因筛选的策略

随着病原微生物基因组信息的公布和大量新技术的涌现,研究病原微生物与宿主的相互作用及致病机制成为功能基因组研究的一个重要领域。体内表达技术在这一领域有着广泛的用途。该文综述了体内表达技术的5种筛选策略及各自的优缺点。     

细菌毒力基因体内表达检测技术研究进展

病原菌入侵宿主是一个及其复杂的过程。为了深入了解病原菌的致病机理,人们需要鉴定那些在感染过程中特异表达的细菌毒力基因。为此,多种体内实验模型被建立起来分析细菌在宿主体内的基因表达,它们包括了体内表达技术、信号标签突变技术、差异荧光诱导、体外转座进行基因组分析和作图技术以及体内诱导抗原技术等。文章对目前运用的这些研究方法进展进行综述,并讨论了它们的优点与不足。     

荧光差异显示技术在分离细菌体内诱导表达基因中的应用

面对复杂的宿主环境,细菌是通过调节表达不同的毒力基因实施其感染过程。目前已建立起多种分析鉴定体内特异表达的细菌毒力基因的方法;其中荧光差异显示技术的应用为鉴定细菌的毒力基因以及揭示细菌致病机理开辟了新途径。本对此作一扼要综述。     

运用于原核生物表达谱的研究技术

越来越多基因组序列的公布,掀起了功能基因组学研究的热潮。新的表达谱研究技术也不断涌现和发展。它们包括：差异显示PCR技术（Differential display PCR,DD-PCR）;基因表达指纹分析（gene ex—pression fingerprinting,GEF）;抑制性消减杂交技术（Suppression subtractive hybridization,SSH）和代表性差示分析（Representational difference analysis,RDA）;体内表达技术（In vivo expression technology,IVET）;     

消减杂交筛选2BS细胞衰老过程中差异表达基因

细胞的复制性衰老最终导致不可逆的G1 期阻滞 ,研究此过程中差异表达基因对于阐明衰老发生机制有重要意义 .分别构建年轻和衰老 2BS细胞高表达基因的消减文库 ,经点杂交筛选后共得5 3个差异表达基因 .对其中部分基因的VirtualNorthern印迹分析证实差异表达确实存在 .选择Y1 1 4和S1 1 1片段 ,以Northern印迹分析确证其表达变化 ;并通过对新生儿和老年人白细胞中二者的表达分析 ,显示二者在体内也存在与体外衰老过程相一致的随增龄表达变化 .结果在一定程度上体现了 2BS细胞衰老过程中基因表达谱的变化 ;首次报道了TSSC3(tumorsuppressingsubtransferablecandidate 3)、hnRNPK (heterogeneousnuclearribonucleoproteinK)等基因在成纤维细胞衰老时发生差异表达 ;通过对Y1 1 4和S1 1 1在体内衰老时的表达分析 ,显示体内和体外衰老有一定的相关性     

氮源受限条件下植物病原真菌氮调控基因表达特性

研究证实植物病害的发生往往是由于植物病原真菌分泌的效应子诱导引起的,在此过程中,调控效应基因表达能够了解病原菌的侵染过程。细胞的营养状况据推测对于效应基因的表达起着重要的作用。已有研究表明在氮胁迫条件下相同效应基因的诱导作用在植株体内和体外是一致的,表明氮源缺乏的环境在植物体进化的早期就已经存在了。文章阐述了在氮受限条件下真菌致病系统中效应基因调控机制及其已经发现的氮调节基因特异性表达研究结果,通过对比几个病原菌中氮调控基因的功能,比较寄主植物体内和体外在氮限制条件下基因的诱导效应,从而揭示出氮的有效性在寄主植物病害发展过程中起到重要作用。     

虫生真菌分子致病机理及基因工程改造研究进展

虫生真菌侵染寄主昆虫的复杂过程可分为体表附着、体壁穿透及体内定殖和致死等不同阶段.近年来,以金龟子绿僵茵(Metarhizium anisopliae)和球孢白僵菌(Beauveria bassiana)为代表的基因功能研究取得了长足的进展,从不同角度阐明了虫生真菌的分子致病机理;同时,基因工程技术的应用为昆虫病原真菌的遗传改良和选育高毒力杀虫菌株开辟了新的途径.对近年来昆虫病原真菌侵染寄主的分子对策及基因工程改造的研究进展进行了综述,并就进一步研究虫生真菌的毒力基因及功能进行了探讨.     

体内诱生抗原鉴定技术

体外不表达而只在体内才表达的基因称为体内诱导基因。研究表明,体内诱导基因涉及病原菌在体内的生存和致病过程,因此有重要意义。最近提出的体内诱生抗原鉴定技术(invivo-inducedantigentechnology,IVIAT)就是用于筛选病原菌体内诱导基因的一种方法。该方法不使用动物模型,而是采用经病原菌体外表达抗原吸收处理的病人血清来检测病原菌的表达文库,从而筛选体内诱导基因;方法简便、快速。这些筛选得到的体内诱导基因有助于病原菌致病机制的研究,同时也能够为抗菌药物、诊断试剂及疫苗设计等研究提供潜在靶标。     

果生刺盘孢CfHAC1调控应答二硫苏糖醇胁迫的转录组分析

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病优势病原菌。前期研究发现bZIP转录因子CfHac1参与调控该菌的生长发育和致病性。为了揭示转录因子CfHac1调控果生刺盘孢响应内质网压力和致病机理,本研究测定了ΔCfhac1突变体对内质网压力胁迫剂的敏感性,发现突变体对二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）的耐受性下降,说明CfHAC1基因可能参与调控果生刺盘孢响应内质网压力胁迫过程。进一步利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和CfHAC1敲除突变体菌株在DTT胁迫下的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 680个,其中上调表达基因有1 181个,下调表达基因有1 499个。Gene Ontology 功能分析结果显示,差异表达基因主要参与催化活性、结合、代谢过程、细胞过程、细胞成分合成、生物过程调控和应激反应等生物学过程。KEGG功能富集分析表明,上调表达基因主要被富集到核糖体、真核细胞的核糖体生物合成、RNA转运和氰基氨基酸代谢通路中;下调表达基因显著富集在内质网蛋白质加工、N-聚糖生物合成、类固醇合成和蛋白质分泌等通路中。分析发现转录因子CfHac1调控内质网胁迫应答和致病相关基因的表达。本研究提供了在全基因组水平上对CfHAC1基因与内质网压力胁迫应答之间关联的新认识,为阐明果生刺盘孢响应内质网压力胁迫和致病机制奠定了基础。     

尖孢镰刀菌古巴专化型MAPK FoSlt2敲除突变体的转录组分析

尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp. cubense（FOC）是威胁香蕉生产的重要土传病原真菌。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）FoSlt2信号通路在调控尖孢镰刀菌古巴专化型的生长发育、细胞壁完整性和致病性方面发挥着重要作用。为了揭示FoSlt2信号通路的致病机理和寻找农药靶标,本研究利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和FoSlt2敲除突变体菌株的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 164个,其中上调表达基因有1 184个,下调表达基因有980个。Gene Ontology（GO）功能分析结果表明,差异表达基因主要参与在结合、催化分子功能组和代谢过程、细胞过程生物学通路中。KEGG 功能富集分析结果表明,差异基因主要参与戊糖和葡糖醛酸盐转换、氨基糖和核苷酸糖、氨基葡聚糖降解、磷酸肌醇和碳类物质代谢通路,说明这些通路与尖孢镰刀菌古巴专化型的生长发育和致病性相关。该研究为尖孢镰刀菌古巴专化型致病机制的阐明奠定了理论基础。     

白假丝酵母天冬氨酸蛋白酶研究进展

白假丝酵母是免疫功能低下宿主条件致病感染中最常见的病原真菌之一,目前基本已肯定分泌型天冬氨酸蛋白酶(s印)在其致病过程中具有重要作用。现将近年来有关白假丝酵母Sap的研究从其编码基因、分子特性和表达以及在白假丝酵母致病中的作用等作一综述。     

毒力岛与细菌致病性

毒力岛作为细菌染色体上一段具有典型结构特征的基因簇,与多种致病茵毒力因子的产生和细菌的进化有密切的关系,研究毒力岛对于认识致病细菌的变异,阐述病原菌的致病机理,预测新病原茵的出现有着十分重要的意义。     

植物根特异性基因表达研究

植物根中基因表达的调控近几年渐始受到注意,一些分离自植物病原的外源基因启劝子能在植物根中特异性地启动编码基因表达。部分植物基因组基因查明存在根特异表达调控元件和反式作用因子,已分离和克隆了部分未知功能的根特异性表达基因。     

橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因克隆及蛋白表达纯化

由橡胶树白粉菌引起的橡胶树白粉病是橡胶树的重要的叶部病害之一,严重影响橡胶的产量。然而目前对橡胶树白粉菌的致病机理研究匮乏。分支酸变位酶是莽草酸途径的关键酶,能够将分支酸转化为预苯酸,为植物提供氨基酸及大量代谢产物,在植物抗病中起到非常重要的作用。而植物病原物在致病过程当中能够分泌分支酸变位酶影响植物莽草酸途径,从而抑制植物的防卫反应。因此研究橡胶树白粉菌分支酸变位酶在其致病过程中的功能具有一定的意义。试验利用同源比对分析在橡胶树白粉菌基因组中获得一个分支酸变位酶同源蛋白,并用PCR克隆获得橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因,命名为OHCmu。后续构建GST-OHCmu融合原核表达载体,筛选最优诱导条件,并利用GST亲和层析柱对蛋白进行纯化。结果表明橡胶树白粉菌OHCmu基因大小843 bp,具有1个内含子,编码263个氨基酸;具有d5csma_结构域,属于Chorismate mutaseⅡ蛋白家族;GST-OHCmu融合蛋白外源诱导表达在供试条件下(IPTG:0.8 mmol/L, 16℃)可以有较好的表达,获得融合蛋白大小约为56 kD。经过GST亲和层析柱纯化、切割GST标签后,顺利获得浓度较高、较纯的橡胶树白粉菌OHCmu蛋白。研究结果为后续OHCmu蛋白的特性及致病机理研究提供参考。     

致病钩体表层膜蛋白新基因（Lslp）的克隆表达及免疫原性研究

克隆表达钩端螺旋体表层膜蛋白新基因Lslp并分析表达产物的免疫原性。根据前期研究得到的致病钩体新基因Lslp(GenBankAF32 5 80 7)的序列设计引物 ,在 6株致病钩体中扩增Lslp基因并测序。以BamHⅠ酶切Lslp和pGEX 1 λT ,构建重组质粒并用酶切和PCR鉴定 ,进一步在大肠杆菌中诱导表达 ,并进行免疫印迹分析 ;纯化表达产物免疫家兔 ,ELISA检测血清抗体滴度。结果显示Lslp在 6株致病钩体中均能扩增出相应片段 ,且序列同源性达到99 6 % ;构建高效原核表达重组质粒pGST LslP ,经IPTG诱导在大肠杆菌中可表达出 6 6kDGST融合蛋白 ,并能与全钩抗血清发生免疫印迹反应 ;将上述融合蛋白免疫新西兰大白兔产生 1 :5 1 2 0高滴度的IgG抗体。研究结果提示致病钩体膜蛋白新基因Lslp可在大肠杆菌进行高效表达 ,表达产物能被全钩抗血清识别 ,为研究钩体的致病机制和筛选保护性抗原提供了基础     

小麦叶锈菌休眠与萌发夏孢子的差异表达

【目的】小麦叶锈菌引起的小麦叶锈病是小麦的重要病害之一,孢子萌发和侵入气孔是保证叶锈菌正常侵染寄主的重要前提。本研究旨在研究小麦叶锈菌夏孢子萌发的差异表达特性,为揭示萌发的机制及其与致病的关系提供依据。【方法】利用小麦叶锈菌致病类型THTT的休眠夏孢子和萌发夏孢子进行RNA-seq分析。【结果】在萌发夏孢子中筛选出相比休眠夏孢子上调表达的基因为4400个,下调基因5325个。GO富集分析发现,上调差异基因主要涉及细胞进程、有机物代谢、信号传导、单个有机体过程、催化酶活性等;下调基因主要涉及单组织过程、单个有机体细胞过程、有机物代谢过程、催化活性调节等过程。利用KEGG分析发现,差异基因共参与109条通路,从中筛选出两条与孢子萌发相关的通路——丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路和囊泡运输中的SNARE蛋白交流。10个基因的定量分析结果与基因数字表达谱分析结果一致。【结论】研究获得了叶锈菌孢子萌发及侵入气孔过程中的重要差异基因,研究结果为研究叶锈菌致病机制奠定基础。     

临床疑似猪非典型瘟病毒感染仔猪小脑组织的转录差异

【背景】猪非典型瘟病毒作为一种新发病毒,近几年在国内各省份中陆续被检出,目前针对猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus,APPV)的研究报道大多集中于基因组学和流行病学,而其感染宿主后的致病机制尚不清楚。【目的】利用高通量测序技术,对感染仔猪小脑组织进行转录水平差异研究,初步探索APPV致病机制。【方法】将实验组3份排除其余能引发仔猪先天性震颤和神经症状相关病原干扰的APPV感染仔猪的小脑组织,与对照组3份健康仔猪的小脑组织进行高通量测序,比较实验组和对照组之间转录水平的差异。【结果】构建了两个cDNA文库：APPV感染小脑组织文库、健康小脑组织文库。在P≤0.05,|log2(FC)|≥0.263的筛选标准下,共筛选出差异表达基因(differentially expressed gene,DEG) 381个,其中上调基因163个,下调基因218个;随机选取8个差异表达的基因,经RT-qPCR检测,以β-actin作为内参基因,结果显示8个差异基因的表达趋势与高通量测序一致。【结论】通过对临床感染APPV的仔猪小脑样本进行转录组研究,通过GO、KEGG对差异基因进行功能注释、分类,发现Pak4、Robo4、Sema3f、Wnt5a等参与轴突导向信号通路的基因转录水平显著下降,可能表明APPV感染可能会导致仔猪体内轴突导向过程受到抑制,进而使其中枢神经系统发育受到抑制,为APPV的致病机制等进一步研究提供了方向和指导。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂20的表达特征分析

【目的】原核表达家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂20(Serine proteinase inhibitor 20,Bm Serpin-20),分析Bm Serpin-20基因和蛋白组织表达分布特点,以及不同外源病原物刺激家蚕后Bm Serpin-20基因的表达模式。【方法】利用p ET-28a表达载体在大肠杆菌Transetta(DE3)中融合表达Bm Serpin-20蛋白,利用纯化的重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用实时定量PCR技术及Western blot方法分别分析Bm Serpin-20基因和蛋白的组织表达水平,以及病原物免疫刺激后的表达模式。【结果】在大肠杆菌中正确表达和纯化了融合Bm Serpin-20蛋白,并制备了多克隆抗体;Bm Serpin-20基因和蛋白在脂肪体、中肠、血细胞、马氏管、表皮、睾丸、卵巢中均有表达,且在表皮中表达量最高;家蚕5龄幼虫经核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis viruses)、藤黄微球菌Micrococcus luteus、大肠杆菌Escherichia coli、白僵菌Beauveria bassiana处理后,Bm Serpin-20基因表达量先下调而后上调,但不同病原物在不同时间的影响不尽相同。【结论】研究了Bm Serpin-20基因和蛋白的表达模式,为下一步研究其在家蚕免疫系统中的作用奠定了基础。