细胞凋亡及API5与糖尿病性勃起功能障碍的相关性研究

为探讨糖尿病(DM)大鼠阴茎海绵体凋亡情况,以及与API5表达的相关性,采用链脲佐菌素(STZ)诱导建立糖尿病大鼠模型,并使用APO阴茎勃起实验筛选DMED大鼠并检测各组大鼠阴茎海绵体压力(ICP).10周后取大鼠阴茎海绵体组织,通过原位末端标记法(TUNEL)和免疫组织化学法分别检测阴茎海绵体细胞凋亡及API5的表达情况.在该实验中,动物模型血糖浓度:观察组显著高于对照组(P<0.05);体重变化:观察组明显低于对照组(P<0.05);观察组ICP和ICP/MAP均明显低于对照组(P<0.05);观察组大鼠阴茎海绵体组织的细胞凋亡较对照组显著升高(P<0.05);观察组大鼠阴茎海绵体组织中API5蛋白表达较对照组明显减少.通过实验,可了解DM大鼠阴茎海绵体细胞凋亡率增加,这可能是糖尿病性勃起功能障碍的发病机制之一,而API5可能参与了DM大鼠阴茎海绵体细胞凋亡的基因调控.     

前列腺癌微环境中树突状细胞与各类血细胞的关系及其临床预后价值的研究

探讨前列腺癌微环境中DCs与各类血细胞的关系及临床预后价值.选取16例良性前列腺增生和42例前列腺癌患者的前列腺组织作为研究对象,以S-100、CD83、CD208抗体作为不同状态的DC标记物进行MaxVision法免疫组化染色和Masson染色.采用图像分析软件进行图像处理,其统计数据与患者外周血细胞计数进行统计学分析.S-100、CD83阳性细胞计数和胶原蛋白含量在前列腺增生组较前列腺癌组高(P<0.05).CD208阳性细胞计数在前列腺增生组和前列腺癌组无差异(P>0.05).S-100阳性细胞计数与Gleason评分呈负相关关系(r=-0.533,P<0.01).血小板计数在前列腺癌组较前列腺增生组高(P<0.05).单核细胞计数偏高为前列腺癌危险因素(P<0.05).各类型树突状细胞与血小板计数无直线相关关系(P>0.05).外周血各成熟类型细胞与前列腺癌微环境中DCs计数无明显相关关系.S-100标记的树突状细胞计数可能与前列腺癌患者的预后相关.更大量样本的分析有助于证实单核细胞计数与前列腺癌的发病以及S-100标记树突状细胞计数与前列腺癌的预后之间的相关性.     

骨髓间充质干细胞移植在小鼠急性肾损伤肾内的存活与分化情况研究

为探讨急性肾损伤后,移植骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs在损伤肾内的存活能力及分化情况,通过复苏、扩增培养已完成鉴定、经慢病毒EGFP转染的MSCs,观察备用MSCs的EGFP(enhanced green fluorescent protein)表达情况,采用雄性C57BL/6J小鼠12只建立小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型后(结扎双侧肾蒂40 min后开放血流并经尾静脉注射MSCs),分别于第1、3、7、14 d处死3只小鼠,采集小鼠左侧肾脏制作石蜡切片,倒置荧光显微镜下观察MSCs在肾内的存活及分化情况,定量分析每个时间点存活于肾内的数目的差异.结果表明复苏、扩增培养出的MSCs增殖活力旺盛,成功建立小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型.移植的细胞随时间的延长,存活于肾脏内的数量显著减少(第14 d存活于肾内的细胞数量仅为移植后第1d的1/5),第1、3、7、14 d表达EGFP的MSCs主要分布于肾小球周围、肾脏小血管内壁、肾小管与肾小管之间的间质而肾小管内壁未见到表达EGFP的MSCs分布.这说明移植的MSCs在缺血再灌注损伤后肾脏内能够存活,但肾脏内的微环境限制了移植细胞的存活能力.在肾小管内壁未观测到表达EGFP的MSCs,提示MSCs对肾脏修复的途径不是直接向肾小管内皮细胞分化而另有其它途径.     

小鼠survivin基因重组真核表达载体的构建及鉴定

目的：应用质粒pEGFP-N1构建含小鼠survivin基因的重组真核载体。方法：采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivin mRNA序列进行分析,自行设计一对分别含有HindⅢ、BamHⅠ酶切位点的survivin基因上下游引物,利用PCR扩增出该基因的全序列cDNA,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1/survivin重组真核表达载体。然后通过卡那霉素抗性筛选、双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序。结果：双酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组真核表达载体。结论：重组真核表达载体pEGFP-N1/survivin构建成功,为下一步研究sur-vivin在未成熟树突状细胞中诱导分化与致耐受作用奠定基础。     

小鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定和Survivin的表达研究

为培养及鉴定小鼠来源骨髓间充质干细胞,并测定细胞中Survivin的表达情况,采用全骨髓培养法获取骨髓间充质干细胞,绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,行成骨、成脂检测,RT-PCR测定Survivin表达情况.结果表明培养出的细胞呈长梭状成纤维细胞样,经流式细胞仪检测细胞表面高表达CD29、CD34、CD44、SCA-1,低表达CD117;细胞曲线显示传代细胞培养1～3d生长缓慢,第4d生长加快并于第7d达到高峰;成骨诱导20d经茜素红染色呈红色结节,成脂诱导14d油红O染色显示有大量脂质沉淀;RT-PCR结果显示Survivin mRNA阳性表达.经全骨髓培养法可以培养出大量骨髓间充质干细胞,同时Survivin在小鼠骨髓间充质干细胞中正常表达,提示可能参与骨髓间充质干细胞抗凋亡过程.     

pcDNA3.1(+)-VEGF165载体的构建及表达蛋白特性分析

构建含人VEGF165基因的重组真核表达质粒,并对其表达蛋白特性进行初步分析。将合成的VEGF165基因序列克隆至pCR2.1-TOPO载体,测序鉴定证实基因碱基序列无误后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建成pcD-NA3.1(+)-VEGF165重组质粒。利用DNAstar软件分析基因序列并翻译成氨基酸序列,再用ExPASy protscale和Protean软件分析其疏水特性、蛋白二级结构。经基因测序、酶切鉴定和PCR鉴定证实pcDNA3.1(+)-VEGF165重组质粒构建成功。Ex-PASy protscale和Protean软件分析表明VEGF165蛋白具有较好的水溶性。本研究为VEGF165的基因治疗应用和VEGF165蛋白直接治疗勃起功能障碍奠定了基础。