人重组白细胞介素-6对缺氧时大鼠海马神经元Bcl-2表达的影响

目的和方法 :采用免疫组化方法 ,观察缺氧对体外培养大鼠海马神经元Bcl 2表达及人重组白细胞介素 6(rhIL 6)的影响。结果 :经rhIL 6孵育的海马神经元缺氧后神经元活存数、Bcl 2表达阳性神经元数和Bcl 2表达阳性神经元的平均光密度均明显高于对照组。结论 :rhIL 6能增强缺氧神经元Bcl 2的表达 ,抑制缺氧后神经元的死亡 ,提示rhIL 6参与脑缺氧损伤的调控。     

PCR-DGGE法评价连续培养模型中肠道菌群的多样性

目的建立人体肠道菌群连续培养模型,验证连续培养模型培养肠道菌群的可行性和稳定性。方法建立连续培养系统,把正常人粪便接种于发酵罐中培养,通过活菌计数和PCR—DGGE法分析连续培养系统中菌群的多样性变化。结果连续培养系统中菌群数量由接种前的10^10～10^11CFU／ml降至10^8-10^9CFU／ml并最终达到稳态;PCR—DGGE法分析结果表明,菌群的多样性指数稳定,各条带均匀度趋于一致。结论连续培养模型能较好模拟人体肠道微生态环境,再现了肠道菌群组成的多样性,可作为肠道菌群培养及菌群相关性研究的离体模型。     

重组人白介素—12在银纹夜蛾中的表达纯化及其生物活性

KB细胞经PDBu刺激 ,采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA ,RT PCR法获得重组人白介素 12 (rhIL 12 )P35和P4 0cDNA。将hIL 12P35cDNA和P4 0cDNA分别克隆到 pAcUW 5 1载体的Polyhedrin和P10启动子下游 ,构建 pAcUW 5 1 IL12转移载体。pAcUW 5 1 IL12与坏死缺陷型线性苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒基因DNA共转染Sf9细胞 ,获得重组杆状病毒Ac hIL12。该病毒经血腔感染银纹夜蛾幼虫 ,采用亲和层析法纯化rhIL 12 ;SDS PAGE(银染法 )、Westernblot鉴定表达和纯化的产物 ;ELISA检测rhIL 12含量 ;MTT法检测rhIL 12样品生物活性。rhIL 12分子量为 75kD。rhIL 12在Sf9细胞培养中表达水平为 17.8μg/10 6细胞 ;在银纹夜蛾幼虫中表达水平为 2 0 0 - 30 0mg/L血淋巴。纯化的重组rhIL 12样品对经PHA P激活的PBMC有明显的增殖活性 ,且具有明显的促NK细胞杀伤活性的生物活性     

白介素-10抑制TNF-α诱导的血管平滑肌细胞增殖

研究观察了重组人白介素 10 (rhIL 10 )对肿瘤坏死因子 (TNF α)刺激的离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖、细胞周期及对p4 4 /p4 2丝裂素活化蛋白激酶的影响。实验培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞 ,采用MTS/PES法确定血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells,VSMCs)的增殖状态 ;应用流式细胞术测定细胞周期 ;利用p4 4 / 4 2磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印迹法测定MAPK蛋白表达。结果显示 :( 1)TNF α处理组与对照组相比 ,TNF α对VSMC增殖具有明显的刺激作用 (P <0 0 5 )。rhIL 10单独应用对VSMCs生长没有影响 (P >0 0 5 )。在TNF α刺激下 ,低至 10ng/ml的rhIL 10可抑制VSMCs的生长 (P <0 0 5 )。流式细胞术测定的结果显示 ,rhIL 10分别可使TNF α作用下的VSMC大部分处于G0 /G1期 ,与对照组相比有明显差异 (P <0 0 1)。 ( 2 )TNF α对p4 4 /p4 2MAPK蛋白表达有显著的增强作用 ,此作用可被rhIL 10抑制。结果提示 ,rhIL 10可抑制TNF α诱导的VSMC增殖及p4 4 /p4 2丝裂素活化蛋白激酶的表达     

甲醇诱导模式对重组人白介素11发酵的影响

目的：建立一种在150L发酵罐中提高rhIL-11蛋白产出率的控制方法。方法：研究在毕赤酵母表达rhIL-11的发酵过程中,分别采用间歇法(甲醇浓度0．5%,每24h诱导一次)、分批补料法(甲醇补料速度在8h内从2．88ml/min提高至8．64ml/min)以及恒甲醇浓度法(利用甲醇浓度传感器检测并控制甲醇补料速度使甲醇浓度始终保持0．5%左右)的不同甲醇诱导模式,对工程菌生长及目的蛋白表达的影响。结果：采用间歇法的菌浓OD_(600)可达到80、rhIL-11表达浓度可达到0．1mg/ml;分批补料法的菌浓OD_(600)可达到240、rhIL-11表达浓度可达到1．0mg/ml;恒甲醇浓度法的菌浓OD_(600)可达到300、rkIL-11表达浓度可达到1．0mg/ ml。结论：rhIL-11蛋白产出率,恒甲醇浓度法(约0．12g/d·L)比间歇法(约0．01g/d·L)和分批补料法(约0．09g/d·L)都高,分别提高了12～13倍和30～40%。     

重组人白介素-10抑制晚期糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞和血管新生内膜的增殖

研究观察了重组人白介素10(rhIL-l0)对晚期糖基化终产物(AGE)刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖及对SD大鼠血管损伤后新生内膜增殖的影响。体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,采用MTS／PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态;应用流式细胞术测定细胞周期;利用p44／42磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印迹法测定p44／42 MAPK磷酸化蛋白表达。利用大鼠颈动脉血管损伤模型,观察rhIL—10对新生内膜增殖的影响。结果显示：(1)AGE处理组与对照组相比,AGE对血管平滑肌细胞增殖具有明显的刺激作用(P＜0．05)。rhIL-l0单独应用对血管平滑肌细胞生长没有影响(P＞0．05)。在AGE刺激下,低至100ng／ml的rhIL-l0可抑制血管平滑肌细胞的生长(P＜0．05)。(2)流式细胞术测定的结果显示,rhIL—10可以使AGE作用下的VSMC大部分处于Go／G1期,与对照组相比有明显差异(P＜0．01)。(3)AGE对p44／p42 MAPK磷酸化蛋白表达有显著的增强作用,此作用可被rhIL—10抑制(P＜0．001)。(4)大鼠颈动脉损伤后,rhIL—10治疗组的动脉血管新生内膜/中层面积比低于对照组约45％(P＜0．01)。表明抗炎细胞因子rhIL—10可抑制AGE诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和血管新生内膜的增殖。     

腺嘌呤对大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株DA19生长和代谢的影响

大肠杆菌DH5α和DA19在碳源限制的基本培养基中进行分批培养和氮源限制的基本培养基中进行连续培养,发现添加腺嘌呤会使DH5α生长改善,乙酸产生减少;对DA19的生长和代谢影响不明显。连续培养细胞的蛋白质组分析结果显示:添加腺嘌呤后DA19 purH表达水平降低,而DH5α purH表达水平不变,表明DH5α嘌呤核苷酸从头合成能力差;DH5α yddS表达上调,gnd表达水平稍有提高,细胞生长改善。     

VHb在产L-苯丙氨酸工程菌中的表达及其抗贫氧效率

人工设计合成密码子优化的VHb基因及其天然的低氧启动子序列,并进行融合T7终止子克隆至L-Phe的高表达质粒中,构建高产L-phe的抗贫氧高密度发酵基因工程菌。高密度发酵过程中的低氧情况可诱导VHb基因的表达,含VHb的工程菌较对照工程菌发酵结果显示:菌株的稳定期延长约4h,提高菌株的产酸周期,L-phe产量提高约14%。     

环境保护上的应用

870438海水中原油在连续培养中的发酵〔英〕/Rontani,J.F.…// Appl.Mierobiol.Bioteehnol一1986,23(3~4)。一3Q2、304〔译自CBA,2986,(4),1438〕, 利用混合细菌群体在连续培养和非消毒条件下使原油降解(80%),     

重组人载脂蛋白ApoA-I表达条件的优化*

对大肠杆菌DH5α发酵培养表达人载脂蛋白ApoA I的发酵条件进行了优化研究。结果表明 :将重组质粒pBV220-ApoA I转化不同的大肠杆菌宿主菌 ,筛选得高表达水平的E. coliDH5α pBV220-ApoA I表达系统 ,摇瓶发酵表达率为 22.2 % ,BL2 1 (DE3)的表达水平与其相当 ,而TG1的表达率只有11%。在FMG-5L发酵罐进行发酵条件优化 ,认为细胞生长培养的最适pH为70 ,重组ApoA I表达时的最适pH为74。分批发酵的初始糖浓度为 3 0g·L 1     

High-level expression and stabilization of recombinant human chitinase produced in a continuous constitutive Pichia pastoris expression system

A continuous fermentation process has been developed in Pichia pastoris (P. pastoris) with the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) promoter in order to produce large quantities of recombinant human chitinase (rh-chitinase) for preclinical studies as a potential high-dose antifungal drug. Expression levels of about 200 to 400 mg/L have been demonstrated in fed-batch fermentations using strains with either the traditional methanol-inducible or the constitutive GAP promoter. Proteolytic degradation of the enzyme was typically seen in fed-batch fermentations. Continuous production of the enzyme by P. pastoris with the GAP promoter was demonstrated in a 1.5-L working volume fermentor using either glucose or glycerol as the carbon source. The fermentation could be extended for >1 month with a steady-state protein concentration of approximately 300 mg/L. Cell densities were >400 g/L wet cell weight (WCW) (approximately 100 g/L dry cell weight [DCW]) at a dilution rate (D) of 0.83 day(-1) or 1.2 volume exchanges per day (VVD). No proteolytic degradation of the enzyme was seen in the continuous fermentation mode.     

巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

目的研究巴曲酶在毕赤酵母菌中的表达。方法按Pichiapastoris偏好密码子人工合成巴曲酶全基因,克隆到酵母分泌型表达载体pPICZaA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入X-33。筛选鉴定转化子．经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的巴曲酶。经SDS-PAGE电泳确定其分子量为33．0 kDa．免疫印迹证明重组巴曲酶具有天然巴曲酶的免疫活性。结果经发酵条件的优化．发酵罐的表达量达到25000Ku／L发酵液。从每升发酵液中可纯化出11．0mg重组巴曲酶。结论巴曲酶毕氏酵母菌成功的构建．为重组巴曲酶止血药的开发奠定了基础。     

增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα,插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×106IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液,酶活性(发酵效价)达到1.2×107IU/mL发酵液以上,较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。     

来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达

柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的植酸酶是目前报道的比活最高的植酸酶。按照毕赤酵母(Pichiapastoris)对密码子的选择偏向性,对来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因AppA进行了密码子优化改造。改造后的基因AppA(m)按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9的α-因子信号肽编码序列3′端,通过电击转化得到重组转化子。通过PCR验证,AppA(m)已整合在酵母染色体上。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到3·2mg/mL发酵液,发酵效价达到每毫升发酵液1·4×107IU以上,高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。     

来源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因的高效表达

高效表达高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的一个有效途径。对源于Escherichiacoli的高比活植酸酶基因appA ,按照毕赤酵母 (Pichiapastoris)密码子的偏爱进行了密码子优化改造。该改造后的基因appA m按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9上的α 因子信号肽编码序列 3′端 ,通过电击转化得到重组转化子。对重组毕赤酵母的Southernblotting分析证实植酸酶基因已整合到酵母基因组中 ,并确定了整合基因的拷贝数。Northernblotting分析证实植酸酶基因得到了正常转录。SDS PAGE分析和表达产物的研究表明 ,植酸酶得到了高效分泌表达 ,在 5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到 2 5mg mL发酵液 ,酶活性 (发酵效价 )达到 7 5× 10 6 IU mL发酵液以上 ,大大高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。     

毕赤酵母工程菌高密度发酵研究与进展

毕赤酵母表达系统是近年来发展最为迅速的一种新型外源蛋白真核表达系统,被广泛应用于多种不同领域且成功表达了许多基因工程产品。高密度发酵技术已被广泛运用到毕赤酵母工程菌发酵工程当中。主要从毕赤酵母的表达常用菌株、载体及表型等方面介绍了其表达系统,从外源基因自身的特性、培养基的组成、温度、pH、溶氧量及补料流加策略方面阐述了对毕赤酵母高密度发酵的过程及蛋白质表达结果的影响,并对毕赤酵母工程菌高密度发酵进行了展望,为其今后的研究及应用提供借鉴。     

透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究

为获得高效表达外源蛋白的Pichia pastoris菌株而设计了重组质粒pPIC9K—vgbbxn,其中透明颤菌血红蛋白基因vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度,腈水解酶基因bxn分泌表达。转化GS115菌株后,通过PCR、SDS-PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达,以及用准确的蛋白活性测定方法成功地检测到二所表达的产物均具有正常的活性。摇瓶发酵实验证明,血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和bxn基因分泌表达。     

人源性抗HBsAg Fab抗体的发酵生产研究

为了适应工业生产的需要,利用fed—batch方法,重组人源性抗HBsAg Fab抗体酵母工程菌在30L发酵罐中进行了高密度发酵,发酵最适温度30℃,pH值范围5．0～5．3,溶氧范围20％～30％。发酵液OD600值达到300时开始诱导,甲醇最佳诱导浓度为10mL／L。重组人源性抗HBsAg Fab抗体经离子交换层析纯化,纯化产品经SDS-PAGE、Western blot进行分析和ELISA方法进行活性测定。结果显示,重组Fab抗体在Fed-batch发酵系统中可高效表达,经过192h的发酵生产,重组人源性抗HBsAg Fab抗体的表达量可达412mg／L。发酵上清经过离子交换层析纯化,获得纯度为95％的重组Fab抗体,该Fab抗体经ELISA分析具有较高的HBsAg抗原亲和力和特异性。结果证实可以通过高密度发酵毕赤酵母工程菌来高效生产重组人源性抗HBsAg Fab抗体,为后续的工业化生产应用奠定了基础。     

用GAP启动子在Pichia pastoris GS115中组成型表达鼠灰链霉菌腺苷酸脱氨酶

【目的】构建产AMP脱氨酶的重组毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)菌株,并初步优化其发酵条件。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)基因组为模板PCR扩增获得腺苷酸脱氨酶基因AMPD,以pGAP9K为载体构建重组表达质粒pGAP9K-AMPD并通过电转化法转入Pichia pastoris GS115,筛选转化子对其酶活进行测定,并初步优化其发酵条件。【结果】构建了毕赤酵母重组菌,通过分光光度法测定,显示重组菌有明显的酶活;初步优化发酵条件为:该重组菌最适发酵培养基为:甘油2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,KH2PO40.5%,MgSO4·7H2O0.05%,pH 6.0;发酵条件为:接种龄24 h,转接量3%,30°C﹑200 r/min培养96 h,取发酵上清液测定酶活,重组菌腺苷酸脱氨酶酶活达到2 230±60 U/mL。【结论】构建了一株产AMP脱氨酶活性较高的重组毕赤酵母菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到2 230±60 U/mL。为AMP脱氨酶工业化生产奠定了一定的基础。     

Production of large quantities of isotopically labeled protein in Pichia pastoris by fermentation

Heterologous expression in Pichia pastoris has many of the advantages of eukaryotic expression, proper folding and disulfide bond formation, glycosylation, and secretion. Contrary to other eukaryotic systems, protein production from P.pastoris occurs in simple minimal defined media making this system attractive for production of labeled proteins for NMR analysis. P.pastoris is therefore the expression system of choice for NMR of proteins that cannot be refolded from inclusion bodies or that require post-translational modifications for proper folding or function. The yield of expressed proteins from P.pastoris depends critically on growth conditions, and attainment of high cell densities by fermentation has been shown to improve protein yields by 10–100-fold. Unfortunately, the cost of the isotopically enriched fermentation media components, particularly 15NH4OH, is prohibitively high. We report fermentation methods that allow for both 15N- labeling from (15NH4)2SO4 and 13C-labeling from 13C-glucose or 13C-glycerol of proteins produced in Pichia pastoris. Expression of an 83 amino acid fragment of thrombomodulin with two N-linked glycosylation sites shows that fermentation is more cost effective than shake flask growth for isotopic enrichment.