一株假单胞菌属低温噬菌体的分离及其特性研究

目的从纳帕海湿地土样中分离和培养低温菌及其噬菌体,并对其特性进行研究。方法分离纯化低温宿主菌,采用"双层平板法"分离获得噬菌体,通过16S rRNA基因分析对宿主菌进行初步鉴定,对噬菌体进行电镜形态观察,并进行噬菌体基因组酶切片段长度多态性分析及噬菌体生理特性研究。结果从纳帕海土样中分离获得一株裂解性低温噬菌体,命名为SV-12,其宿主菌S-12鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。噬菌体SV-12有囊膜,头部为典型的正六边形,立体对称结构,直径约68.7 nm;尾管长约122.5 nm,直径约25 nm;在4℃时具有侵染活性,4～25℃均能产生边缘清晰、透明的噬菌斑。最适感染温度约为10℃,pH耐受范围较广,在pH=10时具有最多出斑数。结论 SV-12属于肌尾噬菌体科,为裂解性噬菌体,对氯仿极度敏感。基因组为dsDNA,大小约为74 kb。     

假单胞菌噬菌体基因组学研究进展

假单胞菌属(Pseudomonasspp.)是地球上重要的生态菌群之一,广泛分布于淡水、土壤等生态环境。假单胞菌噬菌体是以假单胞菌为宿主的病毒,不仅影响宿主的生存状况和进化过程,而且在生物物质循环和能量流动中扮演着重要角色。随着基因组测序技术的飞速发展,许多假单胞菌噬菌体的全基因组测序工作已经完成。截至2020年7月,GenBank收录的假单胞菌噬菌体基因组数有247条,占全部病毒基因组(10,069条)的2.45%。由于假单胞菌噬菌体基因组大小差异较大、遗传含量不同、基因组之间相似性较低,因此对假单胞菌噬菌体基因组的研究相对较少。本文主要对假单胞菌噬菌体基因组的特点、遗传多样性和功能基因方面的研究进行了综述,以期为理解细菌和噬菌体的对抗性共进化作用以及噬菌体的遗传进化提供参考。     

PB1样铜绿假单胞菌噬菌体PHW2的生物学特性

【背景】铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种引起医院感染、急性感染和慢性感染的常见条件致病菌。多重耐药铜绿假单胞菌仍然是引起严重医院感染的常见病菌,其临床治疗面临严峻挑战。噬菌体具有特异性杀菌的能力,在防治铜绿假单胞菌耐药菌方面具有应用前景。【目的】分离能裂解碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌的噬菌体,分析其生物学特性和基因组特征,为噬菌体治疗储备资源。【方法】采集环境水样,用双层琼脂平板法分离噬菌体,对其形态、一步生长曲线、感染复数等生物学特性进行研究;使用IlluminaMiSeq平台测定噬菌体的全基因组序列,利用Newbler3.0、GeneMarkS、BLASTp、Mauve2.4.0等生物信息软件进行拼接、注释和比较基因组学分析。【结果】分离到一株噬菌体PHW2,该噬菌体属肌尾病毒科成员,可裂解7株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌;其最佳感染复数为0.1。一步生长曲线结果显示,其感染宿主菌PA001的潜伏期为100 min,裂解期为360 min,裂解量为25 PFU/cell;噬菌体PHW2在温度25-50℃和pH 6.0-8.0范围内稳定;紫外照射7 min后PHW2活性明显下降;5%氯仿处理100 min内,PHW2仍保持较高的活性。噬菌体PHW2的基因组长65 984 bp,GC含量为55.69%,编码92个ORFs,不含tRNA。基因组比对结果显示PHW2与PB1样噬菌体高度相似。体外生物被膜抑制试验和清除试验结果显示,噬菌体PHW2能显著抑制宿主菌PA001形成的生物被膜并破坏24 h内形成的生物被膜。【结论】分离鉴定了一株新的PB1样噬菌体PHW2,对碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌裂解能力强。生物学特性、基因组特征、体外生物被膜抑制试验和清除试验结果表明该噬菌体具有治疗铜绿假单胞菌耐药菌的潜力。     

PH826噬菌体与抗生素联用有效抑制多重耐药铜绿假单胞菌生物被膜的形成

【目的】铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种重要的革兰氏阴性病原体,可以加重囊性纤维化患者的肺部感染,最终会导致患者的死亡。然而由于多重耐药(multi-drug resistant,MDR)和泛耐药(pan-drug resistant, PDR)铜绿假单胞菌菌株的出现,使其防控变得更为严峻。【方法】从养殖场污水中分离能有效裂解多重耐药铜绿假单胞菌的噬菌体,研究其形态特征、生物学特性、宿主谱范围、基因组特征和体外抑菌能力等,并采用噬菌体和抗生素联用的方法进行生物被膜的抑制试验。【结果】透射电子显微镜的形态分析和基因组分析结合表明,该噬菌体属于Nankokuvirus病毒属。生物学特性试验表明,PH826具有广泛的温度稳定性(4-60℃)和pH稳定性(3.0-11.0)。宿主谱测试显示,PH826可以裂解13株铜绿假单胞菌(包括人源和动物源),体外抑菌试验显示,PH826在感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别为10、1、0.1时对铜绿假单胞菌均有强烈的裂解作用。根据基因组分析,PH826噬菌体的基因组大小为87 95...     

快速从医院废水中大规模分离铜绿假单胞杆菌噬菌体

目的:从医院废水中快速分离多株不同的铜绿假单胞杆菌噬菌体,研究其生物学特性,为建立铜绿假单胞杆菌噬菌体库做准备。方法:利用噬菌斑法从未经处理的医院污水中分离和鉴定铜绿假单胞杆菌噬菌体,根据感染谱的不同确定它们为不同的铜绿假单胞杆菌噬菌体;重点研究其中一株宿主谱较广的噬菌体的生物学特性,采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小,提取该噬菌体的基因组并进行酶切电泳分析,测定噬菌体感染复数并观察其一步生长曲线。结果:通过噬菌斑法分离出90株铜绿假单胞杆菌噬菌体。电镜观察显示,噬菌体Pa27P1头部呈立体对称,有一长尾;酶切结果显示,噬菌体Pa27P1的基因组为双链DNA;生长曲线表明噬菌体Pa27P1感染宿主菌的潜伏期为25 min,爆发时间为25 min,裂解量为514。结论:90株铜绿假单胞杆菌噬菌体中有5株具有较广的噬菌谱,其组合能裂解所有18株铜绿假单胞杆菌,为深入研究铜绿假单胞杆菌噬菌体的生物学特性及其功能提供了依据。     

一株感染铜绿假单胞菌的双链RNA噬菌体PaP6的分离和鉴定

【目的】鉴定一株新分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP6的生物学特性。【方法】利用铜绿假单胞菌临床分离株PA038为宿主,从西南医院污水中分离得到一株裂解性噬菌体PaP6,观察其噬斑特点;氯化铯密度梯度离心纯化噬菌体颗粒后,用透射电子显微镜观察噬菌体形态;提取PaP6基因组,通过DNA酶和RNA酶酶切,做基因组酶切图谱分析;按照感染复数(MOI)分别为10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1加入噬菌体和宿主菌,裂解细菌后,测定噬菌体滴度;以MOI=10的比例加入噬菌体和宿主菌,绘制一步生长曲线;用112株铜绿假单胞菌临床分离株检测PaP6宿主谱。【结果】PaP6的噬斑直径约2 mm-4 mm,圆形透明,边缘清晰;PaP6噬菌体呈多面体立体对称的头部,直径约45 nm;酶切图谱表明PaP6基因组对DNase不敏感,对RNase敏感,未酶切基因组具有3节段双链RNA(dsRNA),长度分别约为9.0、4.5、3.5 kb,共约17 kb;当MOI为0.1时PaP6感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高,达到3.4×109 PFU/m L;用一步生长曲线描绘了其生长特性;PaP6可以感染40.1%的临床分离株,是一株比较广谱的噬菌体。【结论】首次报道了一株铜绿假单胞菌的ds RNA分节段噬菌体,分类学上属于囊病毒科,该噬菌体具有较广的宿主谱,在噬菌体治疗领域具有应用前景。     

铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及耐噬菌体突变频率测定

用铜绿假单胞菌为宿主菌自污水中分离到3株不同的铜绿假单胞菌噬菌体,命名为PaP1、PaP2及PaP3者均为DNA双链噬菌体,基因组大小分别约为47kb、34kb及24kb。3株噬菌体原液滴度（pfu）分别为109/mL、1011/mL和1011/mL。PaP1为裂菌性噬菌体,PaP2及PaP3为溶原性噬菌体。电镜观察,3株噬菌体头部均为多面体立体对称颗粒,直径分别约为70nm、55nm和65nm。PaP1属肌尾噬菌体科,PaP2和PaP3属短尾噬菌体科。研究中还发现了铜绿假单胞菌的耐噬菌体现象及耐受菌与敏感菌之间的“菌群交替”现象,经测定铜绿假单胞菌耐噬菌体的突变机率在1.4×10-7～7.9×10-7之间。     

假单胞菌NyZ12基因组的可塑多变特征

【背景】假单胞菌是广泛存在于土壤、水体环境的微生物,其中Pseudomonas plecoglossicida NyZ12是一株能够以环己胺为唯一碳源和氮源生长的革兰氏阴性菌,其基因组达到7.0Mb左右。【目的】研究假单胞菌NyZ12的基因组是否具有可塑性和多变特征。【方法】以环己胺为唯一碳源和氮源生长的P. plecoglossicida NyZ12为研究对象,以琥珀酸或者代谢中间产物环己酮为碳源连续传代让其自然发生突变,然后筛选在以环己胺为唯一碳源和氮源的无机盐培养基上不能生长的突变体。将获得的突变体进行全基因组测序,并与野生型假单胞菌NyZ12的全基因组进行比对。【结果】以琥珀酸和环己酮为碳源分别筛选到一株突变体T1和T2,测序比对后发现假单胞菌突变体T1、T2的基因组发生大量的缺失和突变。对基因丢失的原因进行了分析,丢失的2个大片段中存在大量的重复序列、转座酶、转座子和原噬菌体。【结论】假单胞菌NyZ12的基因组具有可塑多变的特征。其可能的机制为进一步揭示微生物的适应和进化提供了参考。     

铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及耐噬菌体突变频率测定*

用铜绿假单胞菌为宿主菌自污水中分离到3株不同的铜绿假单胞菌噬菌体,命名为PaP1、PaP2及PaP3者均为DNA双链噬菌体,基因组大小分别约为47kb、34kb及24kb。3株噬菌体原液滴度（pfu）分别为10⁹/mL、10¹¹/mL和10¹¹/mL。PaP1为裂菌性噬菌体,PaP2及PaP3为溶原性噬菌体。电镜观察,3株噬菌体头部均为多面体立体对称颗粒,直径分别约为70nm、55nm和65nm。PaP1属肌尾噬菌体科,PaP2和PaP3属     

林麝源铜绿假单胞菌噬菌体vB＿PaeM＿PAMD02的生物学特性与全基因组序列分析

【背景】圈养林麝一半以上的死亡是由铜绿假单胞菌引起的化脓性疾病导致。另外,由于细菌的抗性增加,噬菌体是继抗生素后的另一抗菌选择。【目的】以分离自病死林麝肺脏的铜绿假单胞菌为宿主菌分离一株噬菌体,对其进行生物学特性、全基因组序列分析与体内抑菌试验。【方法】通过双层平板法分离纯化一株裂解性噬菌体,测定其裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线、热稳定性、最适生长pH等生物学特性,通过电镜观察其具体形态,进行全基因组测序与序列分析,并进行小鼠体内抑菌试验。【结果】分离到一株裂解性铜绿假单胞菌噬菌体并命名为vB＿PaeM＿PAMD02,该噬菌体具有透明且边缘清晰无晕环的噬菌斑,其裂解谱较窄,最佳感染复数为0.1,裂解潜伏期为40 min,裂解暴发量较高,热稳定性较高,可耐受弱碱环境。其全基因组大小为66 264 bp,GC含量为55.59%,序列注释结果显示该噬菌体具有92个开放阅读框,不含毒力与耐药基因,属于肌尾噬菌体科。小鼠体内抑菌试验结果显示了PAMD02对其宿主菌良好的抑菌效果。【结论】本研究分离的噬菌体PAMD02有较高的裂解效率,对不利环境有较好的耐受性,不含毒力基因与耐药基因,具有应用...     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.