福建产尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒的柱层析分离及酶活力和某些生理效应的测定

用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶A—50(DEAE-Sephadex A—50)对福建产尖吻蝮蛇蛇毒进行柱层析分离,获得11个蛋白峰。其中第一峰具有蛋白水解酶及磷酸二酯酶活力,同时还有纤维蛋白溶解作用及局部出血作用。第Ⅵ峰具有较强的精氨酸酯酶活力及凝血酶样的直接凝血效应。第Ⅰ及Ⅳ峰能明显延长血液凝固时间,呈抗凝血效应。第Ⅹ峰具有明显的毒性作用,腹腔注射于小白鼠,可致远隔部位的皮下、肌肉,胸壁内侧以及腹腔等处出血甚至死亡。 尖吻蝮蛇粗毒具有较高的蛋白水解酶、精氨酸酯酶、5′一核苷酸酶及磷酸二酯酶的活力,而碱性磷酸单酯酶、L—氨基酸氧化酶及磷酯酶A的活力均较低,胆碱酯酶的活力近于零。     

蛇毒的研究与利用——Ⅴ.福建产圆斑蝰蛇(Vipera russelli siamensis)蛇毒的柱层析分离及酶活力和生理效应的测定

用羧甲基葡聚糖凝胶C-50对福建产圆斑蝰蛇(Vipera russelli siamensis Smith)蛇毒进行了柱层析分离,获得12个蛋白峰。其中有2个组份具有促凝作用,4个组份具有抗凝作用。对各蛋白峰进行7种酶活力测定的结果表明,福建产圆斑蝰蛇毒的促凝作用与精氨酸酯酶无明显关系。而致死毒性与磷脂酶A活力相重迭。粗毒具有较高的精氨酸酯酶、磷脂酶A和磷酸二酯酶活力,而无出血和纤维蛋白溶解作用。     

蛇毒的研究与利用——Ⅴ.福建产圆斑蝰蛇(Vipera russelli siamensis)蛇毒的柱层析分离及酶活力和生理效应的测定

用羧甲基葡聚糖凝胶C-50对福建产圆斑蝰蛇(Vipera russelli siamensis Smith)蛇毒进行了柱层析分离,获得12个蛋白峰。其中有2个组份具有促凝作用,4个组份具有抗凝作用。对各蛋白峰进行7种酶活力测定的结果表明,福建产圆斑蝰蛇毒的促凝作用与精氨酸酯酶无明显关系。而致死毒性与磷脂酶A 活力相重迭。粗毒具有较高的精氨酸酯酶、磷脂酶A 和磷酸二酯酶活力,而无出血和纤维蛋白溶解作用。     

烙铁头(Trimeresurus mucrosquamatus)蛇毒的研究[Ⅰ]柱层析分离及酶活性与生物活性测定

本文报导了用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶A-50和氯化钠直线梯度洗脱方法,获得14个蛋白峰。测定了11种酶活性,含有精氨酸酯酶,蛋白水解酶,L-氨基酸氧化酶,5′-核苷酸酶,腺三磷酸酶,磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,核苷焦磷酸酶,磷脂酶A9种,不含核糖核酸酶,胆碱酯酶。对每个蛋白峰的生物活性测定表明,出血毒主要分布在12峰,其次为10—14峰。致死活性表现在1,12—14峰。1峰具有较强溶解纤维蛋白的活性。8,10—14峰具有明显的凝血酶样作用,酶活性的分布及其对凝血系统的作用接近一致。11—13峰能使血小板聚集。 烙铁头毒蛇在我国分布很广,成都生物所两栖爬行动物研究室1974年作过报导。蛇毒的研究已被许多学者所重视,Suzuki在Anthony.T.Tu.编著的Venoms Chemistry and Moleculor Biology(1977)报导了该蛇毒含磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,5′-核苷酸酶及小分子活性多肽,1970年Ouyang报导含透明质酸酶,1963年Murata报导有蛋白水解酶活性。Ouyang等(1976—1978)分离纯化纤溶组分,并研究了该组分的理化性质。但对各组分的酶活性及生物活性测定尚未见报导。为充分利用这一丰富资源,我们对湖南产烙铁头蛇毒进行了柱层析分离和各组分的酶活性和生物活性测定,结果报导于下。     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒的分离及其生物活性的研究

用二乙氨乙基纤维素柱层析法将尖吻蝮蛇毒分成15个组分,并对粗蛇毒及各分离组分进行了各种生物活力的测定,结果表明:1.粗蛇毒中存在有精氨酸酯酶,蛋白水解酶、碱性磷酸酶,磷酸二酯酶,5′—磷酸二酯酶,5′—核苷酸酶,ADP酶、ATP酶,L—氨基酸氧化酶及磷酸酯酶A等10种酶活力;但不存在胆碱酯酶及核糖核酸酶的活力;2.蛋白水解酶,5′—核苷酸酶及ADP酶普遍存在于粗蛇毒经分离后的各组分中;3.精氨酸酯酶存在于组分6—13中,以第8组分的活性最高;4.第1及5—13组分显示有较高的凝血活性,第1—2组分及9—15组分显示有出血毒,第12(小鼠死亡率2/5)及第13组分(小鼠死亡率3/5)显示有较高的毒性;第1—2,9—15组分显示有纤溶活性。     

眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)蛇毒四个神经毒组份的纯化和某些性质的研究

根据前文报导的方法(蔡景霞等人,1980),用羧甲基纤维素葡聚糖凝胶C25分离我国广西眼镜王蛇(Ophiophasus hannah)蛇毒,获得十七个蛋白组份。其中组份7、8、9和11蛋白回收率比较高,且具有明显的抗去极化神经肌肉阻遏作用。 由于它们还含有磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,5'—核苷酸酶和核糖核酸酶等酶活性,我们进一步用羧甲基纤维素CM32和葡聚糖凝胶G50纯化了组份7、8、9和11。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,它们均为单一条带,且具有神经肌肉阻遏作用,没有磷酸单酯酶等酶活性。随后测定了它们的氨基酸组成和N—末端氨基酸。根据离体大白鼠膈神经膈肌标本和去神经大白鼠膈肌标本实验和氨基酸组成测定结果表明,眼镜王蛇毒似乎既含长链神经毒也含短链神经毒,它们的作用部位是在神经肌肉突触后膜,对突触前膜没有影响,都是突触后神经毒素。     

蛇毒纤溶酶的性质及应用研究

蛇毒中含有许多不同生物活性的酶类,包括金属蛋白酶、凝血酶、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶、磷酸二酯酶、透明质酸酶、精氨酸酯酶等。其中,在蝰亚科、蝮亚科和眼镜蛇科等蛇毒中存在着一类能直接溶解纤维蛋白（原）的酶,称为纤维蛋白（原）溶酶（简称纤溶酶,Fibrinolytic enzyme,FLE）。纤维蛋白原是由Aα、Bβ、γ三对肽链组成。纤维蛋白则是A、B两对肽链从Aα、Bβ两对肽链上水解下来后,剩下的（αβγ）2通过氢键聚合形成的不溶性纤维蛋白多聚体。纤溶酶对两者都有水解作用。自1976年Ouyang和Huang首次从尖吻蝮蛇毒中获得纯化的纤溶酶以来,迄今已从不同科属的至少15种蛇毒中获得了25种以上的纯化纤溶酶,并对其分子结构、酶学特性及出血活性的关系进行了深入的研究。纤溶酶是一种具有溶栓、抗栓等作用的药物,已成为蛇毒蛋白领域的一个研究热点。     

麦芽根中5''-磷酸二酯酶和5''-磷酸单酯酶的提取

建立一种高效快速的从麦芽根中提取5'-磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的方法.通过将麦芽根粉碎后,取一定粒度的麦芽根加一定量的去离子水浸泡,过滤后得粗酶液.用紫外分光光度法测定5'-磷酸二酯酶和5'-磷酸单酯酶的酶活,研究粉碎粒度、料液比、抽提温度、抽提时间等因素对麦芽根中5'-磷酸二酯酶和5'-磷酸单酯酶提取的影响.将原料粉碎至100目,以去离子水为提取剂,于4℃提取20h,料液质量比为1:10,5'-磷酸二酯酶的酶活力可达160U/ml.该法简单、快速、准确、适应性强,为5'-磷酸二酯酶的提取与检测提供了有效的工具.     

麦芽根中5′-磷酸二酯酶和5′-磷酸单酯酶的提取

建立一种高效快速的从麦芽根中提取5′-磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的方法。通过将麦芽根粉碎后,取一定粒度的麦芽根加一定量的去离子水浸泡,过滤后得粗酶液。用紫外分光光度法测定5′-磷酸二酯酶和5′-磷酸单酯酶的酶活,研究粉碎粒度、料液比、抽提温度、抽提时间等因素对麦芽根中5′-磷酸二酯酶和5′-磷酸单酯酶提取的影响。将原料粉碎至100目,以去离子水为提取剂,于4℃提取20h,料液质量比为1:10,5′-磷酸二酯酶的酶活力可达160U/ml。该法简单、快速、准确、适应性强,为5′-磷酸二酯酶的提取与检测提供了有效的工具。     

眼镜王蛇毒柱层析分离及其组份的活性测定和L—氨基酸氧化酶的分离纯化

用ＣＭ—ＳｅｐｈａｄｅｘＣ—２５分离广西产眼镜王蛇毒,得到了１３个蛋白峰,测定了６种酶在这些峰的分布,其中７个峰有酸活性。并对含量高的Ｌ—氨基酸氧化酶进一步纯化,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯一的Ｌ—氨基酸氧化酶     

来源于芽孢杆菌HJ14耐热酯酶的克隆表达、酶学性质及降解邻苯二甲酸二乙酯研究北大核心CSCD

【目的】克隆芽孢杆菌HJ14的酯酶基因Est Z1并利用大肠杆菌表达得到相应的酯酶,分析重组酯酶的酶学性质和对邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate,DEP)的降解。【方法】特异性扩增酯酶基因Est Z1并对其全长测序,分析其氨基酸序列。利用p EASY-E2表达系统将Est Z1转化到Escherichia coli BL21(DE3)中完成异源表达。根据组氨酸标签纯化Est Z1,研究其酶学性质并利用HPLC和LC/MS检测系统定性分析其对DEP的降解。【结果】Est Z1全长903 bp,编码300个氨基酸残基,蛋白分子量33.84 k Da。Est Z1氨基酸序列分析结果显示,与NCBI数据库收录的HSL-like家族酯酶相似度最高可达到98%。酶学性质分析结果显示,Est Z1可水解碳链长度较短的p-NP底物,最适底物为p-NPC4(p-NP butyrate)。Est Z1的最适p H和最适温度分别为9.0和50°C,并且在p H 7.0–9.5和40–70°C范围内保持50%以上的酶活,为耐热碱性酯酶。Est Z1对多数金属离子和化学试剂保有良好的抗性。Est Z1可将DEP水解生成相应的单酯和醇。【结论】本文报道了Bacillus sp.HJ14来源的酯酶基因并对其在大肠杆菌中表达获得的重组酶的酶学性质进行研究,Est Z1具有良好的碱性p H耐受性和热稳定性,能够部分降解DEP,本研究对邻苯二甲酸酯类的生物降解有一定的参考意义。     

蛇岛产蝮蛇(Agkistrodon halys pallas)蛇毒的柱层析分离及各组分的生理活性测定

应用二乙氨基乙基葡聚糖A—50(DEAE-Sephadex A—50)和盐浓度直线梯度洗脱的方法,对蛇岛产蝮蛇毒进行了柱层析分离,获得16个蛋白峰,并对柱层析的各组分进行了致死活性、出血活性、徐缓激肽释放活性及7种酶活力的测定。     

眼镜王蛇蛇毒的柱层析分离及神经毒组份的研究

用羧甲基葡聚糖C—25和氯化钠直线梯度洗脱方法,对我国广西产眼镜王蛇蛇毒进行了柱层析分离,获得了17个蛋白峰,测定了17个蛋白峰的毒性和生理活性。结果表明有7个毒性峰,其中6个峰具有阻断神经—肌肉接头传递的作用,另一个峰毒性很小,在相同剂量下也不表现上述作用。     

易错PCR法提高土芽孢杆菌ZH1羧酸酯酶的热稳定性

摘要:【目的】对土芽孢杆菌(Geobacillus sp.) ZH1的羧酸酯酶基因进行定向进化,筛选得到酶热稳定性提高的突变酶。【方法】利用易错PCR技术向羧酸酯酶基因中随机引入突变,建立酶基因突变文库,筛选获得热稳定性提高的突变体,并对突变酶进行诱导表达、纯化及部分酶学性质研究。【结果】通过筛选,获得羧酸酯酶热稳定性提高的突变菌株65。序列分析表明,突变酯酶65有2个氨基酸发生了改变,包括T113S和M160K。突变酶的三维结构模拟显示,突变T113S位于酶分子的第5个β-折叠上;突变M160K处在酶分子第5个和第6个α-螺旋之间的环结构上,位于酶分子表面,突变后的Lys160与邻近的Thr162形成一个额外氢键。在90 ℃下,突变酶65和亲本酶的半衰期分别为3.1 h 和1.9 h,表明筛选到的突变酶65比亲本酶的热稳定性好。【结论】基于易错PCR技术对Geobacillus sp．ZH1羧酸酯酶的热稳定性进行了定向进化,对改善酶的性质、扩大酯酶的应用范围,以及研究酯酶的结构与功能的关系具有重要意义。     

蛇毒中凝血酶样酶的研究

蛇毒中凝血酶样酶的研究韦世秀广西医科大学蛇毒研究所南宁５３００２１许多蝮亚科蛇毒中都含有一种氨基酸酯酶［１］,它催化纤维蛋白原分子特定部位Ａｒｇ－Ｇｌｙ肽键的裂解,释出血纤肽而转换为纤维蛋白。其作用与血浆凝血酶十分相似,因而称之为凝血酶样酶（Ｔｈｒｏ...     

浙江产蝮蛇蛇毒对血小板聚集的影响

浙江产蝮蛇蛇毒的分离参照涂光俦(1979)的方法。浙江产蝮蛇蛇毒经DEAE-Sephadex A-50柱层析分离后得到14个蛋白峰,各峰的蛋白含量见表1。将收集的各峰经适当稀释后取0.2ml进行酶活力测定,除磷脂A酶活力按吴新陆、陈远聪(1981)方法测定外,其他酶活力测定如前文(云南省动物研究所,1976),然后做各峰对血小板聚集功能的影响,参照阮长耿等(1983)的方法,所用诱导剂的浓度为ADP(2μM),AA(100μg/ml)以及PAF(3×10~(-7)M),用这三种诱导剂诱导键康人对血小板产生不可逆性聚集,聚集强度分别为75％,75％和70％。粗毒在最终浓度为250μg/ml时能完全抑制上述三种诱导剂所致的血小板聚集。     

蛇毒的研究和利用 Ⅱ.湖南产眼镜蛇毒(Naja naja atra)的柱层析分离及各组分的毒性和酶活力测定

应用羧甲基葡聚糖C-25和盐浓度直线梯度洗脱的方法,对湖南产眼镜蛇毒进行了柱层析分离,获得14个蛋白峰,并对柱层析的各组分进行了毒性和酶活性的测定。     

草地贪夜蛾组织蛋白酶L的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的组织蛋白酶L(cathepsin L,CatL)基因,分析该基因的序列特征并制备该酶多克隆抗体,为探析其生理功能奠定基础。【方法】根据甜菜夜蛾Spodoptera exigua的组织蛋白酶L基因开放阅读框(ORF)序列两端直接设计引物克隆草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因。利用生物信息学软件分析该基因的序列特征,利用ClustalX2软件进行同源比对和进化分析,利用同源建模预测该酶三维结构。通过原核表达重组蛋白,多次免疫新西兰大白兔制备该酶多克隆抗体。【结果】克隆获得了草地贪夜蛾的组织蛋白酶L基因SfCatL(GenBank登录号:HQ110065),ORF序列长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测N-末端含有长度为16个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为36.8 kD,等电点为6.69。SfCatL氨基酸序列与其他13个物种的组织蛋白酶L氨基酸序列比较有53.7%~96.8%的一致性,与甜菜夜蛾组织蛋白酶L氨基酸序列一致性最高,达96.8%。同源建模预测表明,SfCatL折叠成紧密而稳定的元宝状结构,含3个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白的表面。原核表达、纯化SfCatL蛋白制备抗血清,其效价超过1∶40 000,Western blot鉴定结果表明抗血清与草地贪夜蛾Sf9细胞SfCatL蛋白能够特异性结合。【结论】获得了草地贪夜蛾SfCatL完整ORF序列,分析了其特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,成功获得多克隆抗体。本研究为进一步研究该基因的功能并开发组织蛋白酶抑制剂类杀虫剂提供理论依据。     

眼镜蛇蛇毒的分离及各组分毒性测定

应用羧甲基纤维素盐浓度阶段洗脱柱层析法分离湖南眼镜蛇毒获得15个蛋白峰,其中四个神经毒素峰,产率12%.两神经毒主峰合并对小白鼠皮下注射半数致死量为0.13mg/kg,全毒为1.27mg/kg,广西产克痛宁(眼镜蛇神经毒)为0.35mg/kg。本室制备的蛇神经毒活性较全毒提高近9倍。较广西产克痛宁高1.5倍。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果,四个神经毒峰蛋白迁移率分别为0.64,0.70,0.76,0.82。克痛宁为三条神经毒蛋白带,全毒为10条以上蛋白带.     

蜂毒肽片段的合成及其与钙调蛋白的相互作用

采用固相法设计合成了４个蜂毒肽片段：Ｍｅｌ１２、Ｍｅ１１３、Ｍｅｌ１４、Ｍｅｌ１５。应用电泳技术,抑制钙依赖性的磷酸二酯酶酶活方法和荧光技术研究了这些多肽与钙调蛋白的相互作用。结果表明这些多肽与钙调蛋白均形成１：１复合物,抑制钙依赖性的磷酸二酯酶的活性,其中Ｍｅｌ１４和Ｍｅｌ１５对钙调蛋白的结合活性与完整的蜂毒肽比较接近。