草地贪夜蛾组织蛋白酶L的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的组织蛋白酶L(cathepsin L,CatL)基因,分析该基因的序列特征并制备该酶多克隆抗体,为探析其生理功能奠定基础。【方法】根据甜菜夜蛾Spodoptera exigua的组织蛋白酶L基因开放阅读框(ORF)序列两端直接设计引物克隆草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因。利用生物信息学软件分析该基因的序列特征,利用ClustalX2软件进行同源比对和进化分析,利用同源建模预测该酶三维结构。通过原核表达重组蛋白,多次免疫新西兰大白兔制备该酶多克隆抗体。【结果】克隆获得了草地贪夜蛾的组织蛋白酶L基因SfCatL(GenBank登录号:HQ110065),ORF序列长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测N-末端含有长度为16个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为36.8 kD,等电点为6.69。SfCatL氨基酸序列与其他13个物种的组织蛋白酶L氨基酸序列比较有53.7%~96.8%的一致性,与甜菜夜蛾组织蛋白酶L氨基酸序列一致性最高,达96.8%。同源建模预测表明,SfCatL折叠成紧密而稳定的元宝状结构,含3个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白的表面。原核表达、纯化SfCatL蛋白制备抗血清,其效价超过1∶40 000,Western blot鉴定结果表明抗血清与草地贪夜蛾Sf9细胞SfCatL蛋白能够特异性结合。【结论】获得了草地贪夜蛾SfCatL完整ORF序列,分析了其特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,成功获得多克隆抗体。本研究为进一步研究该基因的功能并开发组织蛋白酶抑制剂类杀虫剂提供理论依据。     

金课背景下涉农高校生物化学课程思政教学的探索与实践

金课背景下,课程思政建设是涉农高校实现立德树人根本任务的重要抓手,是我国加快实现农业强国的必经之路,也是我国全面建设社会主义现代化国家、全面推进中华民族伟大复兴的必然要求。生物化学是一门与生命和生活息息相关的专业基础课程,具有较强的理论性和实践性,蕴含丰富的思政教育元素,具有良好的育人价值与育才潜力,是思政元素融入的有效载体。本文以生物化学课程为例,积极响应涉农高校将思政教育融入专业课教学、发挥专业课思政教育功能的党中央号召,先后进行了课程思政素材挖掘、育人案例筛选、教学方案设计、教学活动实施、教学评价反思等的探索和实践,旨在建立符合《高等学校课程思政建设指导纲要》要求的教学模式,进而实现生物化学课程教学质量的持续改进和大力提升。     

珠江三角洲水域底泥中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物分析

分析孔雀石绿(MG)、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐色结晶紫(LCV)标样的稳定特性(光、热), 结果表明: LMG、LMG、CV 和LCV 在自然光下照射40 h, 出现不同程度降解, 降解率分别为21.6%, 26.5%, 18.19%,29.28%。四种标样在0-50 ℃避光处理2 h, 均未出现明显降解。同时, 采用高效液相色谱技术对珠江三角洲水产养殖池塘和珠江出海口底泥的MG、LMG、CV 和LCV 含量进行了分析。样品采用乙腈: 二氯甲烷=1︰1 萃取两次, 经PbO2 柱后衍生后检测, 检测方法回收率为76.3%-89.9%, RSD≤3.9%, 检出限为0.001-0.0043 g·mL–1, 结果表明:水产养殖池塘10 个取样点的底泥均有MG 残留, 残留量最高的达0.0307 g·g–1, 其它样品残留量在 0.0011-0.0152 g·g–1之间; 其中有3 个取样点底泥有LMG 残留, 残留量在0.0073-0.0309 g·g–1 之间。珠江河口的虎门、蕉门、鸡啼门、 磨刀门、虎跳门和崖门均检测到CV, 含量在0.0028-0.0361 g·g–1, 洪沥门和横门均未检出CV。所有取样点均未检出到LCV。     

基于OBE理念的生物化学课程考核体系探索与实践

针对生物化学课程考核中存在的问题,本文以OBE理念为指导,结合形成性评价原理,建立了由“常规式考核”“进阶式考核”和“高阶式考核”组成的三大考核模块,并应用于线下教学中,形成生物化学课程考核和评价体系。这种多元化的考核评价体系注重过程性评价,关注学生平时的学习效果,旨在激发学生学习的积极性,发挥学生的主观能动性。该考核模式的实施,对学生和教师均产生了积极的影响,不仅使学生有章可循,有利于其知识、能力和素质目标的全面达成,而且使教师有据可依,力争做到公开、公平、公正、合理,有助于生物化学课程的教学质量持续改进和大力提升,同时也为国内其他兄弟院校生物化学及其他课程的考核模式改革提供参考和借鉴。     

草地贪夜蛾组织蛋白酶B的基因克隆、序列分析、三维结构预测及其分子对接模拟

昆虫组织蛋白酶B(Cathepsin B)在昆虫发育和代谢过程中发挥重要作用。本研究首先克隆了草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smmith)的组织蛋白酶B基因Cathepsin B(SCB),获得其开放阅读框(ORF)序列(Gen Bank登录号:HQ110064)。生物信息学分析表明,该基因的开放阅读框包含1 026 bp的片段,编码341个氨基酸,预测N-末端含有长度为20个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为35.6 k D,等电点为6.59。氨基酸序列与15种物种Cathepsin B比较有51.2%-96.2%的一致性,与甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hiibner)相似度最高,达96.2%。利用同源建模预测SCB的三维结构,经动力学的优化,SCB折叠成紧密而稳定的球状结构,含6个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白表面。同时分子对接模拟结果表明,SCB结合口袋比较浅,形状不规则,袋口较宽。ARG19、VAL23和ASN24为活性位点关键氨基酸残基,抑制剂CA与SCB活性位点3个关键氨基酸残基有较强的相互作用,且均主要表现为静电相互作用能,其中VAL23、ASN24与CA形成氢键。以期为进一步运用生物实验手段研究Cathepsin B的结构和功能,设计和开发昆虫组织蛋白酶类抑制剂类杀虫剂奠定基础。