基于烟草脆裂病毒构建同时表达2种外源蛋白的载体及其应用

目的 构建在整个寄主植物中能同时表达两个非融合蛋白的病毒载体。方法 以烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，缺失TRV RNA2的2b基因5"端279 bp并将其起始密码子ATG改变为AGG、同时引入豌豆早枯病毒（pea early-browning virus，PEBV）外壳蛋白（coat protein，cp）基因启动子，获得pTRV2e²载体；在pTRV2e²载体的2b和PEBV的cp启动子下游插入不同的外源基因，测定病毒TRVe²表达外源蛋白的能力、携带外源基因后重组病毒的稳定性以及分析蛋白质的生物学功能。结果 病毒TRVe²能快速同时表达2个非融合的外源蛋白，且至少能表达70 ku外源蛋白，且该病毒携带~2.0 kb外源基因能稳定存活于寄主植物中；病毒TRVe²可用于分析蛋白质的生物学功能以及2个蛋白质间的相互作用。结论 本文构建的重组病毒TRVe²为快速有效地表达2个外源蛋白以及分析2个蛋白质间的相互作用提供技术工具。     

梨果黑斑病菌AaCaMK基因克隆、生物信息学分析及其在侵染结构分化中的表达分析

[背景] 钙/钙调素依赖型蛋白激酶（Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase,CaMK）是真核生物细胞钙信号途径中钙调素下游的一类重要靶蛋白,对病原物生长、胁迫响应及致病性等具有重要的调控作用。[目的] 对梨果黑斑病菌互隔交链孢（Alternaria alternata）AaCaMK基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在侵染结构分化过程中的基因表达情况进行分析,为进一步研究梨果黑斑病菌钙离子信号途径中AaCaMK对A.alternata侵染结构分化调控的分子机制提供一定的理论依据。[方法] 采用同源克隆法从A. alternata JT-03中克隆得到3个AaCaMK基因;通过TMHMM、ProtScale、SOPMA等软件对AaCaMK基因进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）技术分析AaCaMK在梨果黑斑病菌侵染结构分化过程中的表达情况。[结果] 克隆得到片段分别为1 212、1 200、2 349 bp的AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3基因;生物信息学分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3均含有典型的蛋白激酶超家族催化结构域（PKC_Like Superfamily）,并且AaCaMK1和AaCaMK2共同含有CaMK类丝/苏氨酸蛋白激酶催化结构域（STKc_CaMK）,AaCaMK3含有LKB1/CaMKK类丝/苏氨酸蛋白激酶催化结构域（STKc_LKB1_CaMKK）;同源性分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3分别与玉米大斑病菌CAK1、CAK2和CAK3的相似性高达94.32%、97.49%和86.57%;RT-qPCR分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3在疏水及果蜡诱导A. alternata侵染结构分化过程中均显著上调表达（P<0.05）,而且果蜡诱导作用更显著。其中AaCaMK1和AaCaMK2在附着胞形成时期（6 h）表达量为对照的1.51倍和3.05倍,而AaCaMK3在侵染菌丝形成阶段（8 h）表达量最高,为对照的2.86倍,并且在果蜡诱导下,这3个基因在芽管伸长阶段（4 h）的上调表达量显著高于疏水界面。[结论] 钙信号中AaCaMK基因在疏水及果蜡诱导A.alternata侵染结构分化过程中发挥重要的调控作用。     

研究报告: 组织蛋白酶B介导NLRP3小体在砷致小胶质细胞炎症激活中的作用

目的 探究组织蛋白酶B（CTSB）介导NLRP3小体在砷致小胶质细胞（BV-2）炎症激活中的作用。方法 取处于对数生长期的BV-2细胞，分别暴露于终浓度为0、2、4、8 μmol/L亚砷酸钠（NaAsO₂）溶液培养24 h，检测细胞活性，测定各组细胞内CTSB和细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β的表达水平。流式细胞仪检测胞内溶酶体膜稳定性。基于实验结果，增设CTSB抑制剂组（5 μmol/L CA074-Me +8 μmol/L NaAsO₂、10 μmol/L CA074-Me+8 μmol/L NaAsO₂），检测两组细胞内炎症相关蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β、IL-18的表达水平。结果 与对照组比较，各染砷组细胞抑制率增高，呈现剂量效应关系，溶酶体膜稳定性下降，差异有统计学意义（P<0.01），胞内CTSB、NLRP3、IL-1β、IL-18、Caspase-1表达增高，差异有统计学意义（P<0.01）；与对照组（8 μmol/L NaAsO₂）比较，抑制剂组BV-2细胞胞内CTSB、NLRP3、IL-1β、IL-18、Caspase-1水平均降低，差异有统计学差异（P<0.01）。结论 NaAsO₂通过诱导小胶质细胞内CTSB水平的上升，介导NLRP3炎症小体激活小胶质细胞，促其释放炎性因子，致神经系统损伤。     

草菇过氧化氢酶基因(VvCAT1)异源表达及耐温度胁迫功能分析

[背景] 过氧化氢酶（catalase,CAT）参与真菌的生长发育,逆境胁迫时保护真菌免受氧化损伤。[目的] 实现草菇过氧化氢酶基因（VvCAT1）的异源表达,分析VvCAT1耐温度胁迫的功能。[方法] 克隆VvCAT1,构建过表达载体pBAR GPE1/VvCAT1,转化到大肠杆菌（Escherichia coli）菌株Stbl3中,异源表达草菇过氧化氢酶。测定温度胁迫后重组菌（pBAR GPE1/VvCAT1/Stbl3）与对照菌（pBAR GPE1/Stbl3）的过氧化氢酶活性和生长情况,验证VvCAT1的功能。[结果] 重组菌的CAT酶活性显著提高,生长情况显著优于对照菌。[结论] VvCAT1的导入及表达显著提高了大肠杆菌Stbl3的耐温度胁迫功能。     

TEAD1转录本的鉴定及其在鸡前脂肪细胞中的功能研究

目的 TEAD1转录因子1（TEAD1）在前脂肪细胞中表达,但是功能还不清楚。本研究旨在探讨TEAD1的两个转录本对永生化鸡前脂肪细胞系（immortalized chicken preadipocyte 1,ICP1）细胞增殖、迁移、凋亡和分化的影响。方法 克隆TEAD1基因的全长序列,对获得的两个转录本进行生物信息学分析。利用间接免疫荧光分析TEAD1转录本的亚细胞定位。通过RT-qPCR、CCK-8和EdU等方法,检测过表达TEAD1转录本对ICP1细胞增殖的影响。利用划痕实验检测TEAD1转录本对ICP1细胞迁移的影响。利用细胞凋亡-Hoechst染色和RT-qPCR,分析过表达TEAD1转录本对ICP1细胞凋亡的影响。通过RT-qPCR检测TEAD1转录本在不同组织、不同细胞系和ICP1细胞分化过程中的表达。利用油红O染色、BODIPY染色、RT-qPCR、Western blot和双荧光素酶报告基因技术,分析过表达TEAD1转录本对ICP1细胞脂滴积累及成脂相关基因转录的影响。最后,测定过表达TEAD1转录本的ICP1细胞中甘油三酯（TG）含量。结果 克隆TEAD1全长编码区,鉴定出两个TEAD1转录本。TEAD1-V1主要定位于细胞核,TEAD1-V2定位于细胞质与细胞核。过表达TEAD1-V1和TEAD1-V2均抑制ICP1细胞增殖。过表达TEAD1-V1促进ICP1细胞迁移,而过表达TEAD1-V2对ICP1细胞迁移没有影响。且过表达TEAD1-V1和TEAD1-V2均促进ICP1细胞凋亡。两个转录本在不同组织和细胞系中的表达模式相似,在前脂肪细胞分化过程中的表达先下降后上升。过表达TEAD1-V1能显著减少ICP1细胞中脂滴的积累（P<0.05）,抑制C/EBPα表达;而过表达TEAD1-V2对脂滴积累和成脂相关基因的蛋白质表达水平没有明显作用（P>0.05）。过表达TEAD1-V1能显著降低ICP1细胞中甘油三脂的含量（P<0.05）,而过表达TEAD1-V2对ICP1细胞中甘油三酯含量没有影响（P>0.05）。结论 本研究首次克隆并鉴定了鸡TEAD1基因的两个转录本。过表达转录本TEAD1-V1和TEAD1-V2抑制鸡前脂肪细胞增殖并且促进鸡前脂肪细胞凋亡;TEAD1-V1抑制前脂肪细胞分化并促进前脂肪细胞迁移,而TEAD1-V2对前脂肪细胞分化和迁移没有影响。     

广西少数民族贫困地区县级综合医院收支结构调查

目的 分析广西少数民族贫困地区县级公立综合医院的收支结构。方法 通过自编调查问卷对广西少数民族贫困地区的27家县级综合医院进行调查，主要调查内容为2011-2014年医院收入结构、支出结构和患者医药费用等。采用描述性统计分析方法对调查数据进行分析。结果 （1）广西少数民族贫困地区县级公立综合医院总收入与总支出均呈现逐年上升趋势，但收支依然平衡；（2）医疗收入占总收入比例高于药品收入，财政补助占总收入的比例逐渐下降；（3）药品收支结余对医院的补偿能力逐步减弱。结论 （1）“以药养医”的经济运行机制已经得到改善；（2）政府不仅应进一步增加财政补助，更应优化投入方式；（3）加强县级公立综合医院预算管理；（4）医院应控制不合理费用增长，从而降低患者费用。     

四物汤在卵巢衰老大鼠骨骼肌中的雌激素样作用机制研究

摘要 目的：探讨四物汤通过胰岛素样生长因子-1（Insulin-ike growth factors-1，IGF-1）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）mTOR信号通路发挥对4-乙烯基环己烯二环氧化合物（4-Vinylcyclohexene Diepoxide，VCD）诱导的卵巢衰老大鼠骨骼肌的保护作用及其分子机制。方法：选用28日龄雌性F-344大鼠，随机选取6只作为空白对照组，剩余大鼠连续腹腔注射VCD溶液（160 mg/kg/d）20天，每天阴道涂片检测动情周期，连续观察12 d无角化细胞或仅有少量角化细胞即符合"卵巢衰老"表现，经动情周期筛选出24只造模成功的大鼠，分为模型组（Model）、阳性（戊酸雌二醇，E₂）对照组、四物汤高剂量（SWT-H）组和四物汤低剂量（SWT-L）组，每组6只，灌胃持续3周后取材。取大鼠骨骼肌组织进行HE染色观察病理组织结构；MASSON染色骨骼肌纤维形态变化；RT-PCR检测骨骼肌组织中各基因的mRNA水平。结果：与空白组比较，模型组骨骼肌肌纤维排列疏松，分布不均且有断点，胞浆不均，细胞核增多，出现增生的结缔组织，胶原纤维逐渐增多且肌纤维间距变宽；与模型组相比，E₂组、SWT-H组与SWT-L组肌纤维排列相对整齐，胞浆较为均匀。肌肉形态较规则，纤维间距缩短，胶原纤维减少。RT-PCR结果显示，与空白组相比，模型组IGF-1、PI3K、AKT、mTOR基因的mRNA表达量明显下调，E₂组、SWT-H组与SWT-L组的IGF-1、PI3K、mTOR的表达明显上升，SWT-H组AKT表达无明显变化，无统计学意义，SWT-L组AKT表达相对降低。与模型组相比，E₂组、SWT-H组与SWT-L组的IGF-1、AKT、mTOR的表达明显增加，且具有剂量依赖性，PI3K表达增加，但无明显剂量依赖性。结论：四物汤可以明显改善VCD诱导的卵巢衰老大鼠的肌肉减少情况，其机制可能是通过IGF-1-PI3K-AKT-mTOR信号通路来发挥其抑制肌肉流失的作用。     

基于转录组学的白扁豆总皂苷抑制前列腺癌细胞系PC-3细胞生长的机制研究

目的 白扁豆总皂苷是中药白扁豆经过提取分离纯化步骤制备得到,关于白扁豆的总皂苷成分如何影响前列腺癌细胞系PC-3细胞的生长情况缺少研究。因此,有必要探讨白扁豆总皂苷对前列腺癌细胞系PC-3细胞生长的机制研究。方法 本研究采用CCK8方法检测不同浓度的白扁豆总皂苷对前列腺癌细胞系PC-3细胞生长的影响。利用转录组学分析白扁豆总皂苷抑制前列腺癌细胞系PC-3细胞生长的分子机制,并且进一步通过实时定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）实验对相关差异基因的表达进行验证。利用Western blot和CCK8检测白扁豆总皂苷处理过表达醛脱氢酶7家族成员A1（ALDH7A1）的PC-3细胞存活率。结果 随着白扁豆总皂苷浓度升高,前列腺癌细胞PC-3的存活率显著下降,白扁豆总皂苷的IC₅₀值为1 086 mg/L。转录组学测序结果显示,与对照组相比,白扁豆总皂苷处理的细胞中有2 360个差异表达基因,其中1 982个基因上调,378个基因下调。基因功能注释（GO）结果显示,差异表达基因显著富集到与有丝分裂纺锤体检查点（mitotic spindle checkpoint）、纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint）等一系列跟癌症的发生发展密切相关的生物学过程。此外,基因组京都百科全书（KEGG）分析结果也显示,差异表达基因富集在肿瘤代谢等信号通路。进一步对其中的差异基因进行验证,结果显示,与对照组相比,白扁豆总皂苷处理的前列腺癌细胞中ALDH7A1、甘氨酸C-乙酰转移酶（GCAT）和磷酸甘油酸变位酶家族成员4（PGAM4）的蛋白质表达水平明显降低（P<0.05）,而二甲基甘氨酸脱氢酶（DMGDH）和胱硫醚β合成酶样（CBSL）的蛋白质表达水平显著升高（P<0.001）。体外细胞实验结果表明,白扁豆总皂苷通过下调前列腺癌细胞中ALDH7A1的表达抑制PC-3细胞生长。结论 白扁豆总皂苷可能通过下调ALDH7A1表达从而在体外抑制前列腺癌细胞的生长。     

组蛋白去乙酰化酶3对外周CD4+ T细胞分化的影响

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）对外周CD4⁺ T细胞分化及功能的调控作用。方法 采用CD4cre酶介导Hdac3杂合基因缺失小鼠（Hdac3^fl/flCD4^cre+/-）及其野生型正常对照小鼠（Hdac3^fl/fl，WT），流式细胞术检测HDAC3缺失对外周CD4⁺和CD8⁺ T细胞比例和数量的影响；在体外佛波酯（PMA）和离子霉素（Ionomycin）刺激条件下，流式细胞术检测HDAC3缺失对CD4⁺ T细胞中IFN-γ、IL-4和IL-17A的表达以及Tfh细胞产生的影响；采用ELISA检测HDAC3缺失对小鼠血清IFN-γ、IL-4和IL-17表达的影响；分选Hdac3^fl/flCD4^cre+/-和WT小鼠外周初始CD4⁺ T细胞，分别在Th1和Th2分化条件下培养，细胞内染色检测HDAC3缺失对Th1、Th2以及Th17相关细胞因子及其特异转录因子表达的影响；采用Microarray检测HDAC3缺失对CD4⁺ T细胞分化亚群相关基因表达的影响；采用链脲佐菌素（STZ）处理小鼠构建I型糖尿病（TIDM）疾病模型，检测HDAC3缺失对T1DM发病的影响。结果 与WT小鼠相比，Hdac3^fl/flCD4^cre+/-小鼠外周CD4⁺和CD8⁺ T细胞的比例和数量显著降低。Hdac3^fl/flCD4^cre+/-小鼠CD4⁺ T细胞及血清中IFN-γ的表达显著降低，而IL-4和IL-17A的表达显著增加，Tfh细胞比例也显著增加；HDAC3缺失抑制体外培养CD4⁺ T细胞向Th1分化但促进其向Th2分化；Microarray检测发现HDAC3缺失导致Th1型细胞谱系基因表达降低，而Th2、Th17以及Tfh细胞谱系基因表达增加；在STZ诱导条件下，HDAC3缺失抑制小鼠T1DM的发生和CD4⁺ T细胞向Th1分化。结论 HDAC3促进外周CD4⁺ T细胞向Th1细胞分化并加重T1DM的发生。     

组蛋白H3第10位丝氨酸的磷酸化：金属纳米材料早期毒性的潜在生物标志物

目的 阐明金属纳米材料（MNPs）对组蛋白H3第10位丝氨酸磷酸化（p-H3S10）修饰变化的影响，探讨典型MNPs暴露后细胞全基因表达的变化，为MNPs早期毒性筛选提供理论基础。方法 通过蛋白质免疫印迹及流式细胞术等方法评价了10种MNPs对p-H3S10修饰变化的影响。此外，利用转录组测序技术在转录水平上探讨了1种典型MNPs——纳米氧化铜对细胞全基因表达的影响。结果 除纳米氧化镍外，其余用于测试的9种MNPs均在不同程度上诱导了p-H3S10。进一步分析发现，MNPs诱导的p-H3S10与MNPs的细胞内蓄积高度相关，且细胞内金属离子的持续释放可能是MNPs诱导 p-H3S10的关键因素之一。另外，转录组测序的结果表明，纳米氧化铜的暴露导致了275个基因的显著差异表达（P<0.05），其中185个基因上调，90个基因下调。基因本体分析表明，在分子功能类别中，排名靠前的术语包括与多种转录因子活性、序列特异性DNA结合及丝裂原活化蛋白激酶活性相关的术语。京都基因和基因组百科全书分析表明，纳米氧化铜暴露后丝裂原活化蛋白激酶的信号级联显著上调。结论 MNPs的细胞内蓄积与其早期诱导的p-H3S10表达高度相关，并且细胞内MNPs持续释放的金属离子可能会在MNPs进入细胞后的很长一段时间内持续诱导p-H3S10的高表达。综上，p-H3S10具有作为评估MNPs毒性的生物标志物的潜力。     

SARS-CoV-2 signaling pathway map: A functional landscape of molecular mechanisms in COVID-19

Coronavirus disease (COVID-19) is caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). COVID-19 has been declared a pandemic by WHO. The clinical manifestation and disease progression in COVID-19 patients varies from minimal symptoms to severe respiratory issues with multiple organ failure. Understanding the mechanism of SARS-CoV-2 interaction with host cells will provide key insights into the effective molecular targets for the development of novel therapeutics. Recent studies have identified virus-mediated phosphorylation or activation of some major signaling pathways, such as ERK1/2, JNK, p38, PI3K/AKT and NF-κB signaling, that potentially elicit the cytokine storm that serves as a major cause of tissue injuries. Several studies highlight the aggressive inflammatory response particularly ‘cytokine storm’ in SARS-CoV-2 patients. A depiction of host molecular dynamics triggered by SARS-CoV-2 in the form of a network of signaling molecules will be helpful for COVID-19 research. Therefore, we developed the signaling pathway map of SARS-CoV-2 infection using data mined from the recently published literature. This integrated signaling pathway map of SARS-CoV-2 consists of 326 proteins and 73 reactions. These include information pertaining to 1,629 molecular association events, 30 enzyme catalysis events, 43 activation/inhibition events, and 8,531 gene regulation events. The pathway map is publicly available through WikiPathways: https://www.wikipathways.org/index.php/Pathway:WP5115.Supplementary InformationThe online version contains supplementary material available at 10.1007/s12079-021-00632-4.     

基于第三代长读段测序数据解析蜜蜂球囊菌基因的可变剪切与可变腺苷酸化

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的真菌病原,导致的白垩病是严重影响养蜂生产的顽疾,每年给养蜂业造成较大损失。本研究旨在基于已获得的第三代长读段测序数据对球囊菌菌丝(Aam)和孢子(Aas)中基因的可变剪切(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)进行深入分析。【方法】利用Astalavista软件鉴定Aam和Aas中基因的AS事件类型。利用IGV浏览器对部分剪切异构体(isoform)的结构进行可视化。通过TAPIS pipeline对Aam和Aas中基因的APA位点进行鉴定。通过MEME软件对Aam和Aas中全长转录本的APA位点上游50bp的序列特征进行分析并对motif进行鉴定。【结果】在Aam中共鉴定到286次AS事件,包括162次RI(Retained intron),87次A3(Alternative 3'splice-site)、32次A5(Alternative 5'splice-site)和5次SE (Skipping exon);在Aas中共鉴定到559次AS事件,包括305次RI、155次A3、85次A5、13次SE和1次MEE (Mutually exclusive exon)。进一步分析发现,现有参考基因组上的多数注释基因结构并不完整;部分注释基因在菌丝和孢子中转录形成的isoform在数量和结构方面均存在差异;部分isoform在参考基因组中没有对应的注释基因。Aam中共鉴定到2748个基因含有1个及以上的APA位点,其中含有1个APA位点的基因数量最多(726,26.42%);Aas中共鉴定到2768个基因含有1个及以上的APA位点,其中含有5个以上APA位点的基因数量最多(1180,42.63%)。部分基因在菌丝和孢子中含有不同的APA位点数。序列特征分析结果显示,球囊菌全长转录本的3'UTR的上下游表现出明显的碱基倾向性,U和A分别富集在3'UTR的上游和下游。此外,在球囊菌全长转录本的APA位点上游鉴定到4个motif,分别是UCUCCU、UCUUCU、CCCACC和CCCCCU。【结论】本研究通过对球囊菌菌丝和孢子中基因的AS和APA进行深入分析,揭示了球囊菌转录组的复杂性,为完善现有的基因组和转录组注释提供了宝贵信息,也为探究AS和APA在球囊菌的基因表达调控中的作用提供了关键基础。     

TCTP在肝癌细胞增殖过程中的作用及机制研究

目的:研究翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)在肝癌细胞增殖过程中的作用及相关机制。方法:通过western blot技术检测14对肝癌与癌旁组织中TCTP的蛋白表达水平。通过siRNA(small interference RNA)技术在肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7404中下调TCTP的表达,然后通过CCK-8实验、克隆形成实验和EdU实验观察下调TCTP对肝癌细胞增殖的影响。通过western blot技术分析TCTP促进肝癌发生这一过程中可能涉及的分子通路。结果:相比于对应的癌旁组织,TCTP在肝癌组织中显著高表达。用siRNA技术下调TCTP水平后能够明显抑制肝癌细胞的增殖能力。下调TCTP的表达之后,AKT和ERK蛋白的磷酸化水平也随之降低。结论:TCTP在肝癌组织中显著高表达,并且在肝癌细胞的增殖过程中发挥着极其重要作用,其作用机制可能与AKT和ERK通路的磷酸化激活有关。     

Broad antiviral and anti-inflammatory activity of Qingwenjiere mixture against SARS-CoV-2 and other human coronavirus infections

BackgroundQingwenjiere Mixture (QJM) is a traditional Chinese medicine (TCM) that has been shown to have remarkable clinical efficacy against COVID-19. However, little is known about the antiviral and anti-inflammatory activities of QJM against a wider range of human coronavirus (HCoV) strains.PurposeThe study aims to investigate the antiviral and anti-inflammatory activities of QJM, as well as the underlying mechanisms against HCoV infections.MethodsThe chemical compositions from QJM were analyzed by LC-MS. The inhibitory effect of QJM on infections of HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, and SARS-CoV-2 was evaluated in HRT-18 cells, Huh7 cells, LLC-MK2 cells, and Vero-E6 cells, respectively, by using cytopathic effect (CPE) inhibition assay or RT-qPCR detection of viral n, s, or RdRp/Hel genes. The expression of pro-inflammatory cytokines induced by HCoV-OC43, HCoV-229E, and SARS-CoV-2, as well as the host ace2 gene was also determined by RT-qPCR assay. Furthermore, the expression of key molecules in the NF-κB/MAPKs signaling pathways was determined by western blot.ResultsIn alcohol-extraction groups of QJM and reference decoction pieces, 53 similar ion peaks were identified, the majority of which were phenylpropanoids, iridoids, and flavonoids. In addition, QJM reduced CPE caused by HCoVs and the expression of viral n genes or N protein. Pretreatment with QJM also exerted inhibitory effect on viral n gene expression. QJM also inhibited the expression of RdRp/Hel and s genes of SARS-CoV-2, as well as the host ace2 gene. Besides, QJM markedly reduced virus-induced mRNA expression of a panel of pro-inflammatory cytokines, such as IL-6, CXCL-8/IL-8, CXCL-10/IP-10, CCL-5/RANTES, TNF-α, IFN-α, CCL-2/MCP-1, CXCL-9/MIG, and IL1-α. We further showed that QJM inhibited the phosphorylation of NF-κB p65, and JNK, ERK 1/2, and p38 MAPKs in HCoV-OC43-infected HRT-18 cells.ConclusionsQJM has broad antiviral and anti-inflammatory activity against both common and newly emerged HCoVs possibly by inhibiting the activation of key components in NF-κB/MAPKs signaling pathway. QJM also has a prevention effect against HCoV infections and inhibits the host receptor required for virus entry. These results indicate that QJM may have the therapeutic potential in the treatment of diseases caused by a broad range of HCoVs.     

siRNA下调20S蛋白酶体β5亚基抑制立氏立克次体细胞内增殖

【目的】探究宿主20S蛋白酶体β5亚基(proteasome 20S subunit beta 5,PSMB5)对革兰氏阴性专性胞内寄生菌立氏立克次体胞内生长繁殖的影响。【方法】利用小干扰RNA转染Vero和THP-1宿主细胞,设置未转染细胞为空白对照组、无义小干扰RNA转染组为阴性对照组、PSMB5特异性小干扰RNA转染组为实验组,采用SYBR定量PCR和蛋白印迹法评价宿主细胞PSMB5变化水平;随后利用立氏立克次体以感染复数为0.1感染转染后细胞系,采用光镜观察、荧光显微镜观察和PCR定量方法检测细菌胞内繁殖变化水平。【结果】与si-NC阴性对照和空白对照相比,si-PSMB5能够显著降低宿主细胞PSMB5 mRNA转录水平和蛋白表水平;在随后立氏立克次体感染过程中,能够降低立氏立克次体的胞内细菌载量。【结论】下调宿主PSMB5基因表达能够抑制立氏立克次体胞内生长繁殖。     

Sulforaphane inhibits the expression of interleukin-6 and interleukin-8 induced in bronchial epithelial IB3-1 cells by exposure to the SARS-CoV-2 Spike protein

BackgroundA key clinical feature of COVID-19 is a deep inflammatory state known as “cytokine storm” and characterized by high expression of several cytokines, chemokines and growth factors, including IL-6 and IL-8. A direct consequence of this inflammatory state in the lungs is the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS), frequently observed in severe COVID-19 patients. The "cytokine storm" is associated with severe forms of COVID-19 and poor prognosis for COVID-19 patients. Sulforaphane (SFN), one of the main components of Brassica oleraceae L. (Brassicaceae or Cruciferae), is known to possess anti-inflammatory effects in tissues from several organs, among which joints, kidneys and lungs.PurposeThe objective of the present study was to determine whether SFN is able to inhibit IL-6 and IL-8, two key molecules involved in the COVID-19 "cytokine storm".MethodsThe effects of SFN were studied in vitro on bronchial epithelial IB3-1 cells exposed to the SARS-CoV-2 Spike protein (S-protein). The anti-inflammatory activity of SFN on IL-6 and IL-8 expression has been evaluated by RT-qPCR and Bio-Plex analysis.ResultsIn our study SFN inhibits, in cultured IB3-1 bronchial cells, the gene expression of IL-6 and IL-8 induced by the S-protein of SARS-CoV-2. This represents the proof-of-principle that SFN may modulate the release of some key proteins of the COVID-19 "cytokine storm".ConclusionThe control of the cytokine storm is one of the major issues in the management of COVID-19 patients. Our study suggests that SFN can be employed in protocols useful to control hyperinflammatory state associated with SARS-CoV-2 infection.     

过表达MicroRNA-21通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调控人退变髓核细胞自噬的研究

目的:探讨过表达mi R-21通过PTEN/PI3K/AKT通路对人退变髓核细胞自噬的影响。方法:构建稳定过表达mi R-21 mimic人退变髓核细胞,转染无意义序列作为mi R-21 mimic control组,采用RT-qPCR检测转染效率;利用MDC荧光染色法观察细胞自噬泡;Western-Blot检测细胞自噬相关蛋白LC3和P62的表达以及PTEN/PI3K/AKT信号通路中关键蛋白PTEN、PI3K及AKT的表达水平。结果:RT-qPCR结果表明mi R-21 mimic转染成功且效率较高,与mi R-21 mimic control组及空白细胞对照组相比,差异显著(P0.05)。荧光显微镜观察MDC染色情况,mi R-21 mimic组的细胞中几乎没有发现自噬体,而mi R-21 mimic control组以及空白对照组细胞中自噬体均较多,与前者相比差异均明显,具有统计学意义(P0.05)。mi R-21 mimic组细胞中LC3-II/LC3-I表达量的比值均显著低于mi R-21 mimic control组及空白对照组细胞(P0.05);而P62在mi R-21 mimic组细胞中表达量显著高于mi R-21 mimic control组及空白细胞对照组,具有统计学意义(P0.05)。mi R-21 mimic组中PTEN蛋白的表达水平较低,与另外两组相比具有统计学意义(P0.05);磷酸化的PI3K(p-PI3K)和AKT(p-Akt)在mi R-21 mimic组中均明显高于mi R-21 mimic control组和空白细胞对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:mi R-21可以通过靶向沉默PTEN,促进PI3K和AKT发生磷酸化,进而使PTEN/PI3K/AKT信号通路被激活,最终抑制人椎间盘退变髓核细胞的自噬。     

表达新冠病毒S基因重组狂犬病病毒的构建及其免疫原性

【背景】新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)在全球流行已近3年,除对人类造成了巨大伤害,也影响了人类的伴侣动物。人的COVID-19疫苗已在全球应用,但动物用的新冠病毒疫苗却鲜有报道。【目的】研制兽用新冠病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)和狂犬病病毒(rabies virus,RABV)的二联苗。【方法】将合成的SARS-CoV-2 S基因和S1基因分别克隆至RABV弱毒疫苗株rHEP-Flury基因组G与L基因间,并将2个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,拯救重组病毒rHEP-nCOV-S和rHEP-nCOV-S1。通过RT-PCR、Western blotting和荧光抗体染色,验证重组病毒、确证S和S1蛋白在RABV中成功表达。再将重组病毒接种NA细胞及成年小白鼠,测定病毒的体外生长特性、重组病毒的致病性及免疫原性。【结果】免疫荧光结果显示,转染7d后细胞上清均出现了绿色免疫荧光,表明已成功拯救嵌合SARS-CoV-2S和S1基因的重组病毒RABV rHEP-nCOV-S和rHEP-nCOV-S1,并且rHEP-nCOV-S1的增殖和扩散能力强于亲本株rHEP-Flury,但rHEP-nCOV-S与亲本株无显著差异。Western blotting结果显示,在目的位置处均出现72kDa和144kDa特异性条带,表明S和S1蛋白在重组RABV中高效表达。重组病毒免疫6周KM小鼠后,小鼠的体重变化与亲本RABV基本一致,重组病毒诱导小鼠产生狂犬中和抗体。【结论】本研究拯救出了嵌合SARS-CoV-2 S/S1基因的重组RABV,为动物COVID-19载体疫苗的研发奠定了基础。