临床相关毛孢子菌的鉴定及体外药物敏感性研究

目的探讨临床相关毛孢子菌的鉴定方法及对常见抗真菌药物的体外敏感性。方法对48株临床分离的毛孢子菌分别通过形态学、API20C AUX、Vitek 2 Compact及核糖体rDNA ITS序列分析等方法鉴定到种;采用浓度梯度法（E-test）测定氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B及卡泊芬净对48株毛孢子菌的最低抑菌浓度。结果形态学和API20C AUX、Vitek 2 Compact不能准确区分不同种的毛孢子菌,以核糖体rDNA ITS序列分析将48株毛孢子菌鉴定为8个种：阿萨希毛孢子菌,星型毛孢子菌,皮瘤毛孢子菌,真皮毛孢子菌,皮肤毛孢子菌,赖巴克毛孢子菌,T.domesticum,T.jirovecii。体外药敏结果显示：卡泊芬净对毛孢子菌无体外活性,MIC〉32μg/mL;氟康唑和两性霉素B对毛孢子菌活性差,体外活性最好的药物是伏立康唑和伊曲康唑。结论常规方法不易将毛孢子菌准确鉴定到种的水平,ITS序列分析准确快速,可以辅助临床区分难鉴定毛孢子菌。毛孢子菌药敏谱不同于临床常见其他酵母菌,氟康唑和两性霉素B对其活性差,伏立康唑具有良好的体外抗菌活性。     

广西地区隐球菌感染的临床特征、菌种鉴定及体外抗真菌药物敏感性CSCD

目的分析广西地区隐球菌感染的临床特征、致病菌种鉴定及其体外药物敏感性。方法收集86例确诊隐球菌病患者(14例为HIV阳性,72例为HIV阴性)中分离出103株隐球菌及其患者资料并对其临床特征进行分析,使用MALDI-TOF MS和ITS区测序分子鉴定方法,92株被鉴定为新生隐球菌grubii变种,11株被鉴定为格特隐球菌。使用CLSI M27-A4方法对菌株进行常用抗真菌药物氟康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑和艾沙康唑体外药物敏感性测试。结果①86例患者(男性59名,女性27名),年龄为21~84岁,其中55人无基础疾病,31人有基础疾病。②由于目前对于隐球菌尚无泊沙康唑、艾沙康唑和两性霉素B的折点,因此参考了念珠菌属的数据,所有菌株对大多数抗真菌药物敏感。抗真菌药物对新生隐球菌grubii变种最低抑菌浓度范围为:氟康唑0.05~4μg/mL,两性霉素B 0.25~1μg/mL,5-氟胞嘧啶0.0625~2μg/mL,伊曲康唑0.0625~0.25μg/mL,伏立康唑0.0078~0.25μg/mL,泊沙康唑0.0313~0.5μg/mL,艾沙康唑0.0020~0.125μg/mL。抗真菌药物对格特隐球菌最低抑菌浓度范围为:氟康唑1~16μg/mL,5-氟胞嘧啶0.125~1μg/mL,两性霉素B 0.25~1μg/mL,伊曲康唑0.0625~0.25μg/mL,伏立康唑0.0156~0.125μg/mL,泊沙康唑0.0156~0.25μg/mL,艾沙康唑0.0078~0.125μg/mL。结论MALDI-TOF MS是一种快速可靠的鉴定隐球菌的方法。广西地区分离隐球菌对临床抗真菌药物敏感,抗真菌药敏试验有助于早期发现耐药菌株,对有效地治疗隐球菌病具有重要意义。     

一株解磷细菌的筛选、鉴定及其溶磷培养条件的优化

从土壤作物根际筛选分离出的一株解磷能力较强的溶磷菌P0417,对其进行16S r DNA基因水平上的初步鉴定,测定其溶解磷的能力,并对该菌的溶磷培养基条件进行优化。结果表明,经序列分析,确定该菌株P0417为洋葱伯克霍尔德氏菌。且其溶磷能力与培养液p H呈显著相关性,当培养基条件为葡萄糖10 g/L、草酸铵0.5 g/L、Na Cl 1.0 g/L时,菌株P0417对Ca3(PO4)2盐培养基具有较好的解磷能力,其解磷能力可达791.84μg/m L。     

中国广西地区格特隐球菌菌种复合体的基因型分析

目的探讨中国广西地区格特隐球菌菌种复合体的基因型特点、种群结构特征和全球菌株的进化关系。方法收集2014—2018年间分离自临床确诊为隐球菌病患者的隐球菌临床株,利用CGB培养基初步筛选格特隐球菌菌种复合体。采用多位点序列分型方法(MLST)确定基因型。通过MEGA7软件构建系统发育树,利用R语言进行主成分分析。使用微量肉汤稀释法M27-A3方案行体外抗真菌药物敏感性检验。结果120株临床隐球菌中,分离出11株格特隐球菌菌种复合体,6株属于C.deuterogattii(AFLP6/VGII),5株属于C.gattii sensus stricto(AFLP4/VGI)。分离自广西的AFLP6/VGII呈遗传多样性,主要起源进化自南美巴西格特隐球菌菌种复合体。11株分离菌株均对常用抗真菌药物敏感。结论中国广西可能出现高致病性AFLP6/VGII,对格特隐球菌菌种复合体进行有效的全国性监测是必要的。     

IGS基因及RAPD标记分析在加特隐球酵母基因分类中的应用

根据ITS1-5.8S-ITS2区域的特异核酸序列变化,加特隐球酵母Cryptococcus gattii(≡新型隐球酵母加特变种Cryptococcu neoformans var.gattii)可分为6种基因型。本研究通过检测加特隐球酵母的IGS基因,发现其IGS序列有着更丰富的变异和信息位点。通过结合加特隐球酵母RAPD(随机扩增的多态性DNA)图谱比较研究,与IGS和ITS的序列分析结果大体一致,说明新近发现的加特隐球酵母ITS8型确实有别于以前报道过的其他加特隐球酵母ITS基因型。研究证明IGS1及IGS2基因片段分析可以作为加特隐球酵母基因分类鉴定中有效的辅助鉴别的分子生物学方法,联合多种基因分类鉴定的方法可以更有效地揭示新型隐球酵母加特变种种内不同基因亚型间的遗传进化关系。     

格特隐球菌IGS5b基因亚型和a交配型菌株的鉴定

目的鉴定1株格特隐球菌VGⅢ基因型中的少见基因亚型IGS5b及a交配型菌株。方法采用PCR指纹法、基因内间隔区（IGS）和磷脂酶基因（PLB1）测序分析鉴定基因型。采用PCR特异扩增法和交配试验鉴定交配型。采用GEF1基因序列分析同步鉴定基因型和交配型。结果结合PCR指纹法和序列分析,鉴定受试株RV63979为VGⅢ基因型中的少见基因亚型。针对交配型位点内STE12和STE20基因的特异性引物均扩增阴性。交配试验证实为a交配型。GEF1位点测序准确鉴定其基因型和交配型。结论本文通过多种鉴定手段结合IGS序列分析,鉴定1株VGⅢ基因型中的少见基因亚型IGS5b,证实VGⅢ基因型中至少存在IGS5a和IGS5b2种基因亚型。交配型分析表明该菌为VGⅢ基因型中少见的a交配型。     

云南省艾滋病患者新生隐球菌药物敏感性与临床分析CSCD

目的了解云南省艾滋病患者中新生隐球菌病的病原分离部位、耐药性及临床治疗效果。方法对2010年1月至2020年12月临床总共分离的424株新生隐球菌,用VITEK2 Compact全自动微生物分析仪鉴定菌种,ATB FUNGUS 3检测5种抗真菌药物的敏感性,并对临床资料进行分析。结果424株新生隐球菌以脑脊液检出比例最高,占62.50%(265/424);血液次之,占30.90%(131/424);第三是痰液,占2.83%(12/424)。424株新生隐球菌对唑类抗真菌药物伊曲康唑和伏立康唑MIC范围均≤2μg/mL,多烯类的两性霉素B MIC范围≤4μg/mL,氟康唑及5-氟胞嘧啶的MIC范围≤64μg/mL。对两性霉素B、氟康唑、5-氟胞嘧啶的敏感性分别为95.28%(404/424)、80.66%(342/424)、75.71%(321/424)。5种抗真菌药物的流行病学折点分别为:5-氟胞嘧啶和氟康唑16μg/mL;两性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑0.5μg/mL。结论新生隐球菌对两性霉素B的敏感性较好,而氟康唑及5-氟胞嘧啶在多年的临床用药过程中已慢慢出现非敏感菌株,伊曲康唑和伏立康唑MIC范围≤2μg/mL。新生隐球菌药敏试验结果为临床医生用药提供参考依据。新生隐球菌病治疗首选两性霉素B与5-氟胞嘧啶联合治疗。隐球菌作为临床重要的致病真菌,实验室及临床均应给予高度重视。     

一株耐铝隐球酵母菌株5-2的分离鉴定及耐铝特性分析

目的分离高耐铝的微生物菌株,为耐铝基因克隆和耐铝机制研究奠定基础。方法用含5 mmol/L铝的平板逐级筛选和纯化,PCR扩增ITS序列和26S r DNA D1/D2序列,用菌株在不同铝浓度的固体培养基和液体培养基中的生长状况鉴定耐铝能力,用ICP-AES测量菌液上清中剩余活性铝的含量。结果通过ITS序列和26S r DNA D1/D2序列比对及形态观察,初步鉴定该菌株为Cryptococcus podzolicus,该菌株的最大耐铝能力达到100 mmol/L,而且该菌株能够吸附溶液中的活性铝,这可能是其耐铝的原因之一。结论该菌种是首次发现具有耐铝能力,从而为土壤微生物耐铝机制的研究及克隆耐铝基因提供了很好的实验材料。     

rRNA基因序列分析在阿萨希毛孢子菌鉴定中的应用

作者对近年有关毛孢子菌属rRNA分析的研究进行了综述,目前的研究结果表明。RNA的26S亚基的D1／D2区、ITS和IGS区的序列分析对毛孢子菌属的鉴定均有一定价值,其中ITS转录间区与18S、5．8S以及26S相比具有较高的特异性;IGS区序列分析优于ITS区序列分析;IGS1区优于IGS2区。     

化妆品中腐败微生物的抗药性研究

对导致化妆品腐败变质的微生物进行分离鉴定,并分析腐败微生物对常用防腐剂的抗药性。根据API鉴定系统和分子生物学技术对腐败微生物进行鉴定,并采用最低抑菌浓度(MIC)的方法评估腐败菌对常用防腐剂尼泊金甲酯、卡松、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)、DMDM乙内酰脲(DMDMH)、布罗波尔的抗药性水平。经鉴定发现2个污染样品中的腐败微生物均为同一种革兰染色阴性杆菌即洋葱伯克霍尔德氏菌,抗药性分析显示腐败菌HZP1537A对DMDMH、卡松和布罗波尔的MIC(2 000μg/m L、25μg/m L和62.5μg/m L)均高于标准菌株(500μg/m L、3.13μg/m L和31.25μg/m L);腐败菌HZP1537B对DMDMH、卡松的MIC(2 000μg/m L、25μg/m L)均高于标准菌株(500μg/m L、3.13μg/m L);第一代腐败菌的抗药性强于第二代。洋葱伯克霍尔德氏菌容易引起化妆品腐败变质,且对多种防腐剂具有抗药性,在化妆品微生物控制时应给予高度关注。     

新型隐球菌L型生物学性状的研究

本文制备了新型隐球菌L型高渗培养基。新型隐球菌L型的特征为:革兰氏染色性改变;大小不一;能通过孔径0.8μm的滤器;电镜检查细胞壁有不同程度的缺损。在高渗液体培养基中,新型隐球菌L型缓慢生长、不易回复;在高渗平板上则易回复。稳定、不稳定隐球菌L型的生化反映与其酵母型相似,但稳定L型的同化能力及尿素分解能力减弱。新型隐球菌形成L型后,其形态、培养特性及生化反映发生变异,这在菌种鉴定与临床检验时要注意。     

红海榄根际土壤来源的青霉属真菌XGH2321及其抑菌活性

本研究根据形态学和ITS序列分析结果,将一株分离自海南东寨港红树林保护区红海榄根际土壤的菌株XGH2321鉴定为青霉属的一种真菌.通过对培养基中的碳源、氮源和盐度的优化,确定了适合该真菌菌株分泌抑菌活性物质的改良查氏培养基(4%玉米浆,0.3%NaNO3,0.05%KC1,0.1%K2HPO4,0.05%MgSO4,pH 7.4,9%盐度).将活化后的菌株XGH2321接种到该培养基中,按28℃、160r/min振荡培养7d,获得的发酵液水萃取物对金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌和枯草芽孢杆菌的生长具有明显的抑制作用(MIC为400μg/mL),而发酵液的乙酸乙酯萃取物对上述微生物的生长也具有一定的抑制作用(MIC为800μg/mL);同时,上述2种萃取物对植物病原菌立枯丝核菌的生长也具有明显的抑制作用,MIC分别为200μg/mL和400μg/mL.     

高产紫杉醇内生真菌J11的鉴定

从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)的幼茎中分离出一株产紫杉醇内生真菌J11.菌株J11的发酵提取物经高分辨质谱分析,证实J11菌株可产紫杉醇.提取该菌株的基因组DNA,扩增核糖体internal transcribed spacer(ITS)和28S核糖体large subunit rRNA gene(LSU)序列,经测序获得该菌的ITS序列和LSU序列.序列比对和检索结果表明,J11菌株为葡萄座腔菌(Botryosphaeria ssp.)属中的一个新菌株.形态学鉴定符合葡萄座腔菌属特征,高效液相色谱分析表明,J11菌株的紫杉醇含量约为615.1μg/L.本研究首次证实葡萄座腔菌J11是一株高产紫杉醇野生型菌株,具有潜在的应用前景.     

阴道分离因肯毛孢子菌的分子鉴定和种内分型

分别采用rRNA基因内转录间隔区(ITS)和基因间隔区(IGS1)测序,ITS和IGS1区PCR限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和基因组DNA的随机扩增多态性DNA(RAPD)等方法,对三株因肯毛孢子菌Trichosporon inkin进行分子特征及种内分型研究。结果显示,不同菌株的rRNA基因ITS区和IGS1区的序列相似性均高达100%,RFLP酶切图谱具有较理想的种内一致性,而不同菌株的RAPD图谱不尽相同。研究表明:rRNA基因IGS1区测序及RFLP酶切可考虑用于因肯毛孢子菌的菌种分子鉴定,而基因组DNA的RAPD则较适合于菌种的种内分型。     

肝移植后播散性隐球菌病1例及其实验研究

目的播散性隐球菌病临床及实验研究。方法患者女,47岁,肝移植术后2 d,面部、肩部、四肢皮肤出现多发溃疡,伴昏迷。通过脑计算机断层扫描、皮损组织病理检查、PAS染色、皮损组织真菌培养及激光俘获显微切割结合PCR扩增序列分析确诊,并对获得菌株进行尿素酶试验、API试验、PCR扩增测序等实验研究。结果皮损组织病理可见大量圆形和椭圆形菌体,PAS染色阳性。血液和脑脊液真菌镜检均为阴性。皮损组织真菌培养可见酵母样菌落生长,菌株尿素酶试验阳性,API试验鉴定为新生隐球菌。ITS区序列分析鉴定为新生隐球菌grub ii变种。激光俘获显微切割结合PCR扩增,序列分析与培养获得的菌株直接PCR扩增后序列分析结果一致。脑脊液特异性隐球菌抗原（＋＋）,血液特异性隐球菌抗原（＋＋＋＋）。脑CT显示为多发结节灶。依据临床及实验室检查确诊为播散性隐球菌病,致病菌为新生隐球菌grubii变种。结论通过对该病例的深入研究,为临床明确诊断播散性隐球菌病奠定基础,确立了显微切割技术在皮肤真菌感染中的应用价值。     

培养条件对克柔念珠菌MALDI-TOF MS鉴定结果的影响分析

目的探究不同的培养时间、培养温度、培养基种类及培养气体环境对克柔念珠菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)鉴定结果的影响。方法收集中国侵袭性真菌耐药监测网(CHIF-NET)2012-2013年中17所医院克柔念珠菌25株,每株菌平行接种在沙堡弱氯霉素琼脂平板(SDA-C)、血琼脂平板等6种培养基,28℃和35℃2种孵育温度,空气和5%CO_2 2种气体环境中孵育,以真菌rDNA ITS测序为金标准,孵育24 h和48 h后,使用Vitek MALDI-TOF质谱仪(简称Vitek MS)和Bruker Autoflex Speed型MALDI-TOF质谱仪(简称Bruker MS)分别进行菌种鉴定,并对其鉴定正确率进行分析。结果克柔念珠菌孵育24 h和48 h时Vitek MS鉴定正确率均为100%,Bruker MS鉴定正确率分别是98.86%和87.43%。28℃SDA-C上生长的克柔念珠菌种水平鉴定准确率较35℃生长的菌株高。比较各种培养基,孵育48 h时SDA-C上生长的克柔念珠菌Bruker MS鉴定正确率(100%)最高。结论克柔念珠菌接种在SDA-C上,28℃空气培养24 h质谱鉴定效果最佳。常规细菌培养基上生长的克柔念珠菌,Bruker MS鉴定分值≥1.700即可认为菌种鉴定可靠。     

获得性免疫缺陷综合征患者的新生隐球菌基因多态性研究

本文旨在调查2003 年1 月― 2007 年12 月分离自上海地区获得性免疫缺陷综合征( AIDS) 患者的新生隐球菌临床株的配型及基因型分布特征, 为隐球菌病的诊疗提供科学依据。首先以M13 为单引物对模板DNA 进行聚合酶链反应( PCR) 扩增, 参照标准株指纹图将临床株鉴定至基因型; 同时对12 株来自AIDS 患者的新生隐球菌临床株的内转录间隔区( ITS) 基因进行PCR 扩增、序列分析, 以CLUSTAL W1. 83 软件多重比对分析ITS序列的差别,MEGA3. 1 软件处理数据, NJ 法绘制系统进化树, Bootstrapping 法对系统进化树结果进行统计学检验, 区分新生隐球菌格鲁比变种、新生变种及格特变种菌株; 最后选用特异性引物PCR 特异性扩增相关基因, 鉴定α和a 配型。结果显示, 分离自上海地区的12 株隐球菌临床株中, 9 株( 75% ) 为VNⅠ基因型/ α配型菌株,3 株( 25%) 为VNⅡ基因型/ α配型菌株, 且ITS基因序列分析可将各临床株鉴定至变种水平。本研究提示, 分离自上海地区AIDS患者的新生隐球菌临床株存在一定的遗传多态性, 以VNⅠ基因型/ α配型菌株为主, 有少量VNⅡ基因型/ α配型菌株。     

297例浅部真菌病临床及病原菌菌种分析

目的 探讨皮肤浅部真菌病致病真菌菌种的构成.方法 对297例真菌涂片阳性和培养阳性的浅部真菌病患者,取标本进行分离培养及菌种鉴定,培养阳性标本在形态学上不能准确鉴定的,进行梅里埃API 20C AUX酵母菌鉴定试剂盒或核糖体DNA （rDNA） ITS区序列测定,确切鉴定菌种.使用SPSS 17.0统计软件对于结果进行统计分析.结果 共分离培养出致病菌13种,其中红色毛癣菌86株（29.0％）,须癣毛癣菌68株（22.9％）,念珠菌属59株（19.9％）,暗色真菌属13株（4.4％）,曲霉菌属13株（4.4％）,红酵母菌12株（4.0％）,青霉菌属9株（3.0％）,毛霉菌9株（3.0％）,犬小孢子菌5株（1.7％）,浅白隐球菌3株（1.0％）,毛孢子菌属2株（0.7％）,絮状表皮癣菌1株（0.3％）,混合感染17株（5.7％）.结论 本地区浅部真菌病以甲癣为主,主要致病真菌是红色毛癣菌,但其他种类真菌感染尤其是念珠菌属有明显上升趋势.     

中国首株格特隐球菌VGII基因型分离株XH91的分子和表型特征鉴定

【目的】研究我国首次临床分离的一株格特隐球菌VGII基因型菌株(XH91)的分子和表型特征。【方法】对受试株XH91进行血清型的分子鉴定;选取核基因组和线粒体基因组中共16个基因片段进行多位点序列分型;对受试株进行单倍体繁育、同性交配及异性交配能力评价;观察受试株的黑色素生成、荚膜厚度及37℃生长等表型特征。【结果】我国首株格特隐球菌VGII基因型菌株XH91为血清B型;该菌株在多位点序列分型上与温哥华岛致病基因型VGIIb一致;XH91能与a交配型发生交配,产生担孢子,而不能与α交配型发生交配且不具备单倍体繁育能力;XH91的黑色素生成、荚膜厚度及37℃生长等表型特征与参考株无明显差异。【结论】我国首株格特隐球菌VGII基因型菌株XH91在基因型、表型特征上均与温哥华岛VGIIb基因亚型一致,该结果将为我国格特隐球菌VGII基因型的分子流行病学和疾病监控提供重要资料。     

一株深海真菌FS86的分离鉴定及其生物活性研究

采用平板涂布法从南海深海沉积物中分离出一株真菌FS86,根据培养特征、形态学特征和ITS序列分析,该菌株被鉴定为球孢枝孢(Cladosporium sphaerospermum)。生物活性测试结果表明,其发酵提取物对8种病原真菌和4种肿瘤细胞株都具有明显的抑制作用,其MIC值和IC50值分别为0.1-4 mg/m L和0.86-2.13μg/m L。