TGF—β家族的细胞信号转导

转化生长因子β（ＴＧＦ－β）家族成员与各自的膜受体结合后,使通路限制性（ｐａｔｈｗａｙ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ＳＭＡＤｓ磷酸化,后者再与Ｓｍａｄ４形成杂聚体并转位至细胞核,调节一些基因的转录而产生生物学效应。抑制性ＳＭＡＤｓ可阻断通路限制性ＳＭＡＤｓ的磷酸化。     

汉坦病毒陈株S基因编码区的克隆,序列分析及表达

从汉坦病毒陈株感染的ＶｅｒｏＥ６细胞裂解液中提取病毒ＲＮＡ,经逆转录ＰＣＲ获得病毒Ｓ基因编码区约１．３ｋｂｃＤＮＡ片段,克隆该片段后进行核苷酸序列测定,并与汉坦病毒７６１１８株进行同源性比较,结果二者核苷酸序列同源性为８６％,推导的氨基酸序列同源性为９７％。将该基因片段插入原核表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物为ＧＳＴＮＰ融合蛋白。ＳＤＳＰＡＧＥ检测表达蛋白分子约７２ｋＤ左右。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ和ＥＬＩＳＡ试验结果表明,表达产物可与多株抗汉坦病毒核蛋白的ＭｃＡｂ发生反应,其抗原表位及ＭｃＡｂ反应谱与７６１１８株相比存在某些差异。     

甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物RNA3序列分析及编码25kD蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）内蒙分离物的总ＲＮＡ为模板,通过反转录－ＰＣＲ扩增获得ＢＮＹＶＶＲＮＡ３全长ｃＤＮＡ。将其克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）上,得到重组质粒ｐＧＢＹ５６。序列分析结果表明,内蒙分离物ＲＮＡ３基因组全长为１７７５ｎｔ,其中包含３个开放阅读框架,分别编码２５ｋＤ蛋白、４．６ｋＤ蛋白和一种由５９个氨基酸组成的Ｎ蛋白。与法国Ｆ２分离物、德国Ｇ１分离物和日本Ｓ分离物相比,其核苷酸序列的同源性分别为９６．４％、９６．８％和９７．３％。将２５ｋＤ蛋白编码基因克隆到ｐＪＷ２上,构建了该基因的原核表达载体。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析结果表明,２５ｋＤ蛋白基因在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中经温度（４２℃）诱导后,可特异地表达２５ｋＤ蛋白     

芝田硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ 方法从芝田硫化叶菌中扩增了编码一种新酶,即麦芽寡糖基海藻糖合酶（ ＭＴＳａｓｅ） 的基因,扩增的２－２ｋｂ ＤＮＡ 插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０ 中,构建成重组质粒ｐＳＢＧＴ１ 。ｐＳＢＧＴ１ 中ＭＴＳａｓｅ 基因在大肠杆菌中得到表达。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物ＭＴＳａｓｅ蛋白的分子量约为７４ｋＤａ ,同核苷酸序列测定所推导的值相符。表达产物占细胞总蛋白约４－４ ％ 。ｐＳＢＧＴ１ 产生的重组酶作用于淀粉部分水解物,使ＤＥ 值降低,得到非还原糖或低还原糖。     

人肿瘤坏死因子受体I死亡域融合蛋白基因的克隆与表达

通过设计４个引物进行重叠ＰＣＲ,由此克服了人肿瘤坏死因子受体Ｉ死亡域与氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）的融合蛋白基因（ＤｄＬｃａｔ）。该融合蛋白基因经测序,证明与设计的序列相同。构建成的重组表达质粒ｐＬＴ１０ＤｄＬｃａｔ转化大肠杆菌后发酵,ＩＰＴＧ诱导２ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定ＤｄＬｃａｔ蛋白质的分子量为３９ｋＤ。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验进一步作了鉴定。表达产物大部分为包涵体。ＤｄＬｃａｔ经Ｑ－Ｓｅｐｈａ     

一个新的水稻MADS—box基因的克隆及表达分析

根据ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因保守区结构,设计简并性引物,利用３＇ＲＡＣＥ从水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）中克隆了１个新的水稻ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因的ｃＤＮＡ片段,同时利用５＆ＲＡＣＥ获得了全长ｃＤｎＡ命名为ＦＤＲＭＡＤＳＳ。序列分析表明,该ｃＤＮＡ全长１４０６ｂｐ,开放阅读框共编码２３３个到,具有典型的植物ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因的结构。推测的氨基酸序列与拟南芥的ＭＡＤＳ－ｂｏｘ基因,ＡＧＬ１４同     

汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析

在大肠杆菌中对汉滩病毒Ｓ基因４种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达。结果表明表达的４种ＧＳＴ－ＮＰ融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于茵体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的２９－３６％,分子量分别约为７２ｋＤ、６６ｋＤ、５４ｋＤ和４４ｋＤＤ。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示５４ｋＤ和７２ｋＤ融合蛋白用酶标记汉滩病毒ＮＰＭｃＡｂｌＡ８和抗ＧＳＴ ＭｃＡｂ ３Ｃ１１染色呈阳反应。６６ｋＤ和４４ｋＤ融合蛋     

汉滩病毒核壳蛋白（NP）在杆状病毒系统的表达及其免疫原性研究

应用杆状病毒表达载体成功地表达了汉滩病毒７６－１１８株（ＨＴＮＶ）核壳蛋白,将ＨＴＮＶＳ基因插入杆状病毒转染质粒ｐＡｃＹＭＩＢ的多角体基因启动子下游附近,与经Ｂｓｕ３６１酶切线性化的杆状病毒（ＡｃＶＥＰＡ）ＤＮＡ共同转染Ｓ１９细胞,经空斑筛选获得了高效表达ＮＰ的重组杆状病毒（ＡｃＶＨａｎＳ）。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实,表达产物与ＨＴＮＶ毒粒ＮＰ分子量均为５０ＫＤ左右,紫外扫     

氧化修饰高密度脂蛋白对培养人动脉平滑肌细胞细胞周期蛋白D_1基因表达的影响

动脉平滑肌细胞（ｓｍ ｏｏｔｈ ｍ ｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ,ＳＭＣ）是动脉粥样硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ,ＡＳ）斑块中的主要细胞,它的增殖在ＡＳ形成过程中极其重要．利用体外培养的人主动脉ＳＭＣ,观察了天然高密度脂蛋白（ｎａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ,Ｎ－ＨＤＬ）及氧化修饰ＨＤＬ（ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＨＤＬ,ＯＸ－ＨＤＬ）对培养人主动脉ＳＭＣ ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１（细胞周期蛋白Ｄ１）基因转录表达的影响．结果表明：（１）Ｎ－ＨＤＬ对ＳＭＣｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因表达无影响（Ｐ＞ ０．０５）;（２）ＯＸ－ＨＤＬ使ＳＭＣｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因表达显著增强（Ｐ＜０．０１）,其表达量随时间（２、１２、２４ ｈ）延长而增加．上述结果表明,ＯＸ－ＨＤＬ的致ＡＳ作用可能与其刺激ＳＭＣｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因表达增加有关．     

人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆和乳酸乳球菌中的表达

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人肝总ＲＮＡ中分离扩增了０．４５ｋｂ的人铜锌超氧化物歧化酶（Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ）基因的ｃＤＮＡ序列,首先克隆至大肠杆菌表达质粒ｐＥＴ２３ｂ,进行了序列测定和超高表达,将Ｃｕ／Ｚｎ,ＳＯＤｃＤＮＡ亚克隆至乳酸乳球菌表达载体ｐＭＧ３６ｅ,用电穿孔法将重组质粒ｐＭＧ３６ｅｓｏｄ转化到乳酸乳球菌,获得Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ的组成型表达,其表达量约占乳酸乳球菌可溶性蛋白的５％以上,活性染色表     

小鼠Smad3基因的克隆及其在小鼠组织中的表达

采用PCR获得的Smad3cDNA片段作为探针筛选小鼠脑cDNA文库 .克隆了小鼠全长的Smad3基因 .对小鼠Smad3基因的全编码区进行了序列测定 .结果表明 ,小鼠SMAD3与人SMAD3氨基酸同源性高达 99% .与小鼠Smad2基因相比 ,碱基同源性高达 91 8% .Northern杂交显示 ,Smad3基因在小鼠胚胎发育和各成体器官中普遍表达 .原位杂交显示 ,Smad3基因表达在小鼠胚胎期E16 5d的软骨、骨髓和皮肤角质细胞中     

Premature luteinization and cumulus cell defects in ovarian-specific Smad4 knockout mice

SMAD4 is a central component of the TGFbeta superfamily signaling pathway. Within the ovary, TGFbeta-related proteins play crucial roles in controlling granulosa cell growth, differentiation, and steroidogenesis. To study the in vivo roles of SMAD4 during follicle development, we generated an ovarian conditional knockout of Smad4 using the cre/loxP recombination system. Smad4 ovarian-specific knockout mice are subfertile with decreasing fertility over time and multiple defects in folliculogenesis. Regulation of steroidogenesis is disrupted in the Smad4 conditional knockout, leading to increased levels of serum progesterone. In addition, severe cumulus cell defects are present both in vivo and when assayed in vitro. These findings demonstrate that disrupting signaling through SMAD4 in the ovarian granulosa cells leads to premature luteinization of granulosa cells and eventually premature ovarian failure, thereby demonstrating key in vivo roles of TGFbeta superfamily signaling in the timing of granulosa cell differentiation.     

SMAD3介导TGF-β1抑制MMP9在COS7细胞中的表达

用明胶酶谱的方法检查了野生型和Smad3ex8 ex8纯合突变小鼠血清中基质金属蛋白酶(MMP9)的活性 .发现突变小鼠血清中MMP9的含量较正常小鼠的明显增高 ,提示SMAD3有抑制MMP9表达的功能 .通过细胞转染实验证实 ,TGF β1和野生型的SMAD3可以抑制COS7细胞分泌MMP9,而C端缺失的突变型Smad3基因过表达可以解除这种抑制作用 ,说明SMAD3介导TGF β1信号抑制MMP9在COS7细胞中的表达 .     

Glypican-3 modulates inhibitory Bmp2-Smad signaling to control renal development in vivo

Renal branching morphogenesis, defined as growth and branching of the ureteric bud (UB), is a tightly regulated process controlled by growth factor-dependent tissue interactions. Previously, using in vitro models of branching morphogenesis, we demonstrated that BMP2 signals via its intracellular effectors, SMAD1 and SMAD4, to control UB cell proliferation and branching in a manner modulated by Glypican-3 (GPC3), a cell surface heparan sulfate proteoglycan. Here, we used loss-of-function genetic mouse models to investigate the functions of Bmp2 and Gpc3-Bmp2 interactions in vivo. Progressively greater increases in UB cell proliferation were observed in Bmp2+/-, Smad4+/-, and Bmp2+/-; Smad4+/- mice compared to Wt. This increased cell proliferation was accompanied by a significant increase in UB branching in Smad4+/- and Bmp2+/-;Smad4+/- mice compared to Wt. Reduction of Gpc3 gene dosage also increased UB cell proliferation, an effect that was enhanced in Gpc3+/-;Bmp2+/- mice to an extent greater than the sum of that observed in Gpc3+/- and Bmp2+/- mice. Reduction of both Gpc3 and Bmp2 gene dosage enhanced cell proliferation in the metanephric mesenchyme compared to Wt, an effect not observed in either Bmp2+/- or Gpc3+/- mice. Phosphorylation of SMAD1, a measure of SMAD1 activation, was progressively decreased in Gpc3+/- and Gpc3+/-;Bmp2+/- mice compared to Wt, suggesting that Gpc3 stimulates Bmp2-dependent SMAD signaling in vivo. These results demonstrate that BMP2-SMAD signaling, modulated by GPC3, inhibits renal branching morphogenesis in vivo.