扬子鳄FoxO1基因CDS序列的克隆及其在初孵鳄性腺组织的时空表达规律

研究以初孵扬子鳄(Alligator sinensis)性腺组织为实验材料, 开展Forkhead box家族蛋白-1(FoxO1)基因CDS区克隆和序列特征分析。利用免疫组织化学检测其在胃、肠和肺脏等组织中的表达谱, 结合免疫荧光(IF)、RT-PCR和Western Blot探讨其在不同出壳后日龄(17日龄、63日龄和96日龄)雌性扬子鳄性腺组织中的时空表达规律, 探讨其在雌性扬子鳄性腺发育过程中的生物学功能。研究成功克隆获得FoxO1基因长度为1941 bp的完整编码区及646个预测编码氨基酸序列。与其他物种间进行同源性比对和构建进化树分析发现, 扬子鳄FoxO1基因与鸟类的亲缘关系相较中华鳖(Pelodiscus sinensis)和原矛头蝮(Protobothrops mucrosquamatus)等爬行动物更近。在其他脊椎动物中, 哺乳动物、硬骨鱼和两栖物种也各自聚类称为子群, 表明FoxO1兼具功能保守性和种间特异性; 免疫组织化学结果表明FoxO1在初孵鳄性腺复合体、肺、胃和肠中均有表达, 免疫荧光结果表明17日龄性腺组织中的FoxO1主要表达于肾上腺和中肾区但在皮质部呈微弱表达, 在63日龄性腺皮质部表达逐渐上调且呈无规则随机分布, 在96日龄性腺皮质部中卵母细胞发育程度更高的位置呈强表达; RT-PCR结果表明不同时期扬子鳄性腺组织FoxO1基因mRNA表达量差异不显著, Western Blot结果显示性腺组织中的FoxO1表达量呈先上升后下降的变化模式, 表现为63日龄FoxO1基因表达量显著高于17日龄和96日龄, 相关结果对于丰富扬子鳄卵子发生调控机制提供了重要的研究参考。     

Nodal蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育,为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制,需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体.采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA,通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板,PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达.经酶切及测序鉴定后,转化Rosseta细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体.获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体,为Nodal功能的进一步研究奠定了基础.     

斑马鱼心脏发育候选基因Pygo1多克隆抗体的制备及检测

Pygo1是心脏发育候选基因,可能在斑马鱼心脏发育过程中起着重要的调控作用.利用生物信息学选择斑马鱼Pygo1基因抗原亲水区,将扩增出的PCR片段克隆到原核表达pGEMT-4T-1载体中,转入E.coli中后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)分别诱导表达GST融合蛋白.蛋白经纯化分离后用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.用Western Blot检测抗体的效价和特异性.     

脊椎动物FoxO基因亚族的进化

本研究以脊椎动物FoxO作为研究对象,选取NCBI上公布的多个FoxO基因编码蛋白的核苷酸序列,重点分析Fox O蛋白质结构和功能的相似性与差异性,重建FoxO基因的系统发育树并进行选择压力分析,对FoxO基因亚族的起源和进化进行研究分析。结果显示:脊椎动物FoxO蛋白间Forhead结构域十分保守但核定位信号区结构差异较明显,尤其是FoxO6蛋白,并且多个磷酸化位点在哺乳动物FoxO6中缺失,削弱核输出信号,但在斑马鱼和原鸡的FoxO6中未缺失这些位点,推测其胞质定位调控作用仍十分重要。FoxO3中多个磷酸化位点可能与寿命延长作用相关。系统发育树表明FoxO1是FoxO基因的祖先基因,不同FoxO基因进化速率不同。选择压力分析结果显示FoxO基因过程每个位点经历不同的选择压,并且获得25个正选择位点,这些正选择位点可能对FoxO不同基因的形成和新功能的产生中具有十分重要的作用。     

利用Tol2转座子介导的增强子诱捕技术获得血管相关转基因斑马鱼系

心血管系统形成于胚胎发育极早期并为其他器官的发育、维持、修复所必需,血管生长异常可造成多种疾病.然而,由于研究对象所限,胚胎血管的发育机制尚未完全阐明,调控血管发育的基因也所知有限.通过Tol2转座子介导的大规模增强子诱捕筛选到26个血管特异表达绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的转基因斑马鱼系,其中有一些品系在胚胎的某些特异血管结构中表达绿色荧光.通过linker-mediated PCR克隆到22个鱼系中Tol2插入位点附近的斑马鱼基因组序列,其中有17个鱼系的Tol2插入可定位到现有的斑马鱼基因组中的单一位点.通过整体胚胎原位杂交对插入位点附近的基因进行表达谱分析,得到8个表达谱与转基因鱼系一致的基因,涵盖了9个鱼系,其中dusp5基因对应于2个不同的鱼系.这8个基因中包括hhex、ets1a和dusp5等3个功能已知的基因,但是大部分(5个)基因在斑马鱼中尚无功能研究,分别为zvsg1、micall2a、arl8b(1of2)、zgc:73355以及hecw2(1of2).hhex和ets1a基因对血管与血细胞前体的发育具有重要作用,所获得的EGFP报告基因受hhex或ets1a基因增强子控制的转基因斑马鱼(mp378b和mp430c-2)为国际首例,为深入研究这两个基因在血管与血液发育中的作用机制提供了新的机遇.筛选到的功能未知基因可以用来进一步研究其在血管发育中的功能;同时,利用所获得的转基因鱼系,可以实现实时、动态观察成血管细胞的起源、分化与基因表达调控,并可用于高通量小分子药物筛选等重要研究.     

FoxO1抑制猪骨骼肌MyHC Ⅰ的表达

为研究FoxO1与骨骼肌纤维类型之间的关系,本试验以大白猪为实验材料,利用RT-PCR和Western印迹技术,检测了FoxO1与肌纤维类型标志基因MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx在特定骨骼肌中的表达规律,以及调控肌纤维类型关键基因Mef2c和NFAT的表达,并用Wortmannin处理原代培养的猪骨骼肌成肌细胞,检测了FoxO1与肌纤维类型相关基因的表达.结果显示,FoxO1在不同骨骼肌类型中mRNA表达差异不显著(P0.05),其蛋白表达与MyHC各亚型显著相关.Wortmannin处理结果显示,在处理的第3和5d,FoxO1蛋白与MyHCⅡb,MyHCⅡx和NFAT表达显著正相关,而与MyHCⅠ,MyHCⅡa和Mef2c表达显著负相关.结果表明,FoxO1通过抑制MyHCⅠ的表达调控肌纤维类型.     

青鳉(Oryzias latipes)smad3的克隆与表达分析

鱼类性染色体的原始性导致性别决定基因的多样性.高等动物中的单个基因,在鱼类中因为基因组复制而产生多个同源基因,呈遗传多样性.TGF-β家族在硬骨鱼性别决定和性别分化的过程中发挥关键作用.smad3是性腺体细胞衍生因子(gsdf)的下游基因,可将TGF-β信号从细胞表面传递至细胞核.本研究从青鳉精巢和卵巢组织cDNA中克隆了smad3a、smad3b基因的CDS全长序列.蛋白序列的同源性比对和系统发生分析显示,smad3在高等脊椎动物中只有一种,而在鱼类却有两种.RT和定量PCR分析结果显示,smad3在多组织中普遍表达,在精巢中表达高于卵巢.青鳉smad3a和smad3b的表达同性腺分化紧密关联,提示其在性腺雌雄性分化和发育中可能具有重要作用.     

desmoplakin基因在斑马鱼早期胚胎表达的研究

斑马鱼足现今研究脊椎动物发育的重要模式动物.目前桥粒斑蛋门(desmoplakin,DSP)的时空表达模式还没有详尽的描述,为了研究桥粒斑蛋白在发育过程中的时空表达,我们从斑马鱼胚胎提取了总RNA,制备cDNA,并以其为模板克隆得到desmoplakin基因.利用整体原位杂交技术研究了该基因在斑马鱼胚胎的时空表达图谱.结果 显示,该基因在胚层分化前没有表达,在胚盾期后主要在表皮、耳和原肾管表达,并暗示DSP在这些器官发育过程中发挥重要作用.     

中华鳖Dmrt1基因的克隆、表达及在性逆转中的变化分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文从m RNA和蛋白水平分析Dmrt1基因的组织差异性表达、在不同发育阶段性腺中的细胞定位及在性逆转中的表达变化,研究Dmrt1基因在中华鳖性别分化中的调控作用.Rapid-amplification of c DNA ends(RACE)结果显示,Dmrt1基因c DNA序列全长2409 bp,其中5′非编码区为230 bp,3′非编码区为1072 bp,开放阅读框为1107 bp,编码368个氨基酸,具有一个高度保守的DM结构域.荧光定量PCR和免疫组化结果显示,Dmrt1在性腺分化之前的第16期雄性性腺中开始表达,先于Amh和Sox9基因表达.随着性腺的发育,Dmrt1蛋白主要定位于性腺Sertoli细胞的细胞核上,在雌性性腺发育过程中并未见其表达.此外,在雌二醇诱导的雄性转雌性性逆转胚胎性腺中,Dmrt1表达显著下调;在芳香化酶抑制剂诱导的雌性转雄性性腺中,Dmrt1表达则显著上升.上述研究表明,Dmrt1基因是中华鳖雄性特异性基因,参与雄性性腺的发育过程,可能在中华鳖早期性别决定中起重要的调控作用.     

斑马鱼整体原位杂交法研究MMP15a的发育相关表达的初步观察

克隆斑马鱼基质金属蛋白酶15a（MMP15a）基因,并研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的时空表达状况。收集不同发育时期的斑马鱼胚胎,制备DIG标记的MMP15a RNA探针,采用全胚胎原位杂交方法研究MMP15a基因在胚胎斑马鱼的表达。结果MMP15a基因在胚胎受精后一个细胞时期就开始表达,从受精后24h起,在眼睛处表达明显,从受精后48h MMP15a在胸鳍和耳囊有特异性表达至到受精后96h。MMP15a在斑马鱼胚胎发育不同时期表达明显,且在胸鳍和耳囊处有持续表达。