人轮状病毒感染昆明小鼠乳鼠模型的建立

目的建立人轮状病毒G3型709株感染4d龄昆明小鼠乳鼠模型。方法通过灌胃病毒的方式造模,观察乳鼠被病毒攻击后不同时间其临床表现、小肠组织病理改变、小肠组织上皮细胞超微结构改变。酶联免疫吸附法检测轮状病毒抗原在乳鼠粪便中的表达,免疫荧光法检测轮状病毒在乳鼠小肠组织中的表达。结果4d龄昆明小鼠乳鼠被轮状病毒攻击24h后出现腹泻表现和小肠组织病理改变,72h最严重,之后腹泻率下降,病理改变减轻,第7天腹泻停止,病理改变消失。乳鼠小肠上皮细胞出现糖、脂肪代谢紊乱,其粪便和小肠组织中都可以检测出轮状病毒抗原表达。结论4d龄昆明小鼠乳鼠被人轮状病毒A组G3型709株经口攻击后病毒能够在其体内复制,出现腹泻表现。该病毒感染腹泻过程具有自愈特点。     

肠致病性大肠杆菌O45基因缺失疫苗菌株的构建及其免疫原性分析

为得到肠致病性大肠杆菌O45弱毒疫苗候选菌株,以肠致病性大肠杆菌O45为出发菌株, 利用自杀性载体pCVD442和同源重组的原理构建了O45的ler基因缺失突变菌株PEPEC O45(Δler), 并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠和乳猪的被动免疫保护作用进行了研究。结果表明, O45(Δler)基因缺失突变菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用, 并丧失了对实验小鼠的致病性, 具有良好的安全性。乳鼠和乳猪被动免疫保护性实验表明, 用该菌株分别免疫母鼠和母猪后, 乳鼠和乳猪均可通过吸吮母乳可以获得良好的被动免疫保护作用。因此本研究所构建的O45(Δler)基因缺失突变弱毒菌株可作为预防PEPEC O45感染的疫苗候选株, 为最终研制出O45的基因工程菌苗奠定基础。     

免疫荧光法检测原核和真核细胞中表达的轮状病毒外壳蛋白VP4

目的：用免疫荧光法快速检测原核和真核细胞中表达的轮状病毒（RV）外壳蛋白VP4。方法：以抗VP4的抗体为一抗、FITC标记的羊抗豚鼠IgG为二抗,用免疫荧光方法检测在大肠杆菌BL21（DE3）中重组表达的同源RVVP4;检测SA11或Wa株RV感染MA104细胞后不同时间段病毒VP4的合成及其在感染细胞中的分布情况。结果：用免疫荧光法可直接检测到原核细胞中表达的外源蛋白,也可检测到病毒蛋白在真核细胞中的分布情况。结论：免疫荧光法可特异、方便、快速地检测RV VP4在原核和真核细胞中的表达;来源于RV TB—Chen株的VP4抗体可特异性识别同源病毒VP4,交叉识别SA11或Wa株的VP4。     

轮状病毒致乳鼠肠道外感染Th1/Th2细胞因子变化的研究

目的通过复制轮状病毒（RV）肠道外感染乳鼠的动物模型,检测接种后乳鼠体内Th1/Th2平衡改变,对RV肠道外感染后机体免疫状态进行初步研究。方法48只乳鼠随机均分为3组：肠道外组、肠道内组和正常对照组。肠道外组通过腹腔注射猴RVSA11株,肠道内组灌胃等量RV悬液,对照组无特殊处理。分别在接种后第4天、第8天处死乳鼠,收集标本,观察心、肝、肾、肺等脏器病理变化,用ELISA法检测血清中IL-10和IFN-γ的表达。结果光镜下肠道外组乳鼠肾、肝、肺和脾脏出现病理改变。感染后第4天,肠道内、外组乳鼠血清IFN-γ水平均高于正常组,到第8天明显下降,基本达到基线水平;IL-10在肠道外组第4天增高,到第8天小幅下降,但仍然高于正常组;而肠道内组IL-10无明显改变。结论RV肠道外感染早期呈现Th1-Th2混合反应,而后期则以IL-10的表达为主,T细胞向Th2型免疫应答方向偏离,Th1/Th2细胞因子失衡机制可能是RV肠道外感染的重要因素。     

我国人轮状病毒不同基因型NSP4的致病性研究

对我国轮状病毒流行株NSP4基因变异特点的分析表明,NSP4基因主要可分为Wa组和Kun组,在Wa组内可形成三个亚组,形成了4种NSP4基因型。为了进一步阐明人轮状病毒流行株NSP4基因变异与其致病性变化是否存在联系,我们首先利用杆状病毒载体对NSP4蛋白进行表达,获得了对应4种不同NSP4基因型的重组杆状病毒rvBac97B6,rvBac97S34,rvBac97S36和rvBac97SZ8。用这些病毒感染Sf9细胞后,检测细胞内Ca2 浓度的变化,发现与野生型杆状病毒感染细胞相比,重组病毒感染细胞内的Ca2 浓度显著升高,但各个重组病毒之间无显著性差异。在此基础上,我们进一步在E.coli中分别表达纯化了代表Wa和Kun基因分组的97S34和97SZ8流行株的NSP4。分别用纯化的重组NSP4蛋白攻击乳鼠后,发现不同基因型的NSP4蛋白的致腹泻活性没有明显差异,这种作用可被NSP4抗体拮抗,但这种拮抗作用存在基因型特异性。上述结果表明人轮状病毒流行株NSP4氨基酸序列间的变异并没有使其钙调节及致腹泻能力产生改变,在致腹泻作用中发挥关键作用(或决定性作用)的氨基酸位点在不同NSP4基因型间可能是相对保守的。针对NSP4抗体的有效性也为新型轮状病毒疫苗和药物研究提供了线索。     

我国人轮状病毒不同基因型NSP4的致病性研究

对我国轮状病毒流行株NSP4基因变异特点的分析表明,NSP4基因主要可分为Wa组和Kun组,在Wa组内可形成三个亚组,形成了4种NSP4基因型.为了进一步阐明人轮状病毒流行株NSP4基因变异与其致病性变化是否存在联系,我们首先利用杆状病毒载体对NSP4蛋白进行表达,获得了对应4种不同NSP4基因型的重组杆状病毒rvBac97B6,rvBac97S34,rvBac97S36和rvBac97SZ8.用这些病毒感染Sf-9细胞后,检测细胞内Ca2+浓度的变化,发现与野生型杆状病毒感染细胞相比,重组病毒感染细胞内的Ca2+浓度显著升高,但各个重组病毒之间无显著性差异.在此基础上,我们进一步在E.coli中分别表达纯化了代表Wa和Kun基因分组的97S34和97SZ8流行株的NSP4.分别用纯化的重组NSP4蛋白攻击乳鼠后,发现不同基因型的NSP4蛋白的致腹泻活性没有明显差异,这种作用可被NSP4抗体拮抗,但这种拮抗作用存在基因型特异性.上述结果表明人轮状病毒流行株NSP4氨基酸序列间的变异并没有使其钙调节及致腹泻能力产生改变,在致腹泻作用中发挥关键作用(或决定性作用)的氨基酸位点在不同NSP4基因型间可能是相对保守的.针对NSP4抗体的有效性也为新型轮状病毒疫苗和药物研究提供了线索.     

表达轮状病毒G2和G3型vp7基因重组腺病毒的免疫效果

为探索以非复制型腺病毒为表达载体的多价轮状病毒(Rotavirus,RV)基因工程疫苗的可行性,在前期工作的基础上,对表达我国G2和G3型RV流行毒株vp7基因的重组腺病毒的免疫效果进行了研究。分别用表达G2和G3型vp7基因的重组腺病毒rvAdG2VP7、rvAdG3VP7经滴鼻和灌胃两种途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体、黏膜抗体和相关的细胞因子水平进行了检测和比较。结果表明,用表达G2和G3型vp7基因的重组腺病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠后,均可诱导机体产生较强的RV特异性免疫反应,包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫,并能产生中和抗体。但免疫反应以Th2类为主,Th1类反应也占有相当的比例。本研究为新型RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基础。     

杭州地区腹泻儿童轮状病毒与腺病毒感染调查

目的分析不同季节及不同年龄段腹泻患儿感染轮状病毒(RV)与腺病毒(Eads)情况,为临床提供早期、快速、准确、可靠的依据,以便及时采取相应的治疗使患儿早日康复。方法采用杭州艾博医药有限公司提供的轮状病毒(A组)/腺病毒检测试剂盒(乳胶法),对2012年1月至2015年12月浙江省人民医院门诊和住院就诊的3 368例腹泻儿童粪便标本进行轮状病毒和腺病毒抗原检测。结果 3 368例腹泻儿童粪便中,RV阳性578例占17.16%,Eads阳性106例占3.15%。11月至次年1月为轮状病毒感染的高发月份,1~3岁为儿童感染的高发年龄;腺病毒感染阳性率低,呈散发性。结论杭州地区近年1~3岁婴幼儿的腹泻主要是由轮状病毒和腺病毒引起,其中轮状病毒感染率明显高于腺病毒,且有明显的季节性;而腺病毒感染呈散发流行,未表现出明显的季节性及年龄分布。     

A组轮状病毒多个结构蛋白抗原表位的串联表达及其免疫原性的检测

从北京腹泻婴儿粪便提取的轮状病毒(rotavirus,RV)(T114株)的RNA中,克隆到轮状病毒结构蛋白基因vp4,vp6和vp7的全长cDNA,对它们编码的蛋白质序列和可能的抗原表位肽进行了预测,选择了RV主要抗原蛋白VP7、VP6和VP4的4个抗原表位肽,通过人工合成DNA的方式将这些抗原表位肽基因串联融合成一个阅读框RME(rotavirus multipleepitopes,RME)并构建原核表达载体.大肠杆菌表达的RME在ELISA反应中可被RV多克隆抗体识别,纯化的RME蛋白注射免疫小鼠可诱导特异性免疫应答,产生高滴度的同源氨基酸序列特异抗体和人RV抗体,其中针对RME的IgG抗体滴度达到l∶40 000,针对单个抗原表位EV7、EV6和EV4的IgG抗体滴度达l∶10 000～l∶20 000,针对RV Wa株的IgG抗体滴度较低为l∶2 500,但能特异地中和该病毒对MAC145细胞的侵染.上述结果为新型RV基因工程疫苗的研发提供了论据和基础.     

轮状病毒感染成年小鼠的研究

目的研究成年昆明种小鼠对实验感染人轮状病毒(rotavirus,RV)的敏感性。方法在实验条件下,用A组人Wa和恒河猴SA11株RV感染成年昆明种小鼠,观察小鼠的临床反应和排毒情况。结果成年昆明种小鼠感染Wa和SA11RV第二天后出现明显的临床腹泻症状,第四天达到高峰;至少在感染后连续6天的动物大便中可检测到较高滴度的RV抗原。结论成年昆明种小鼠对RV感染有很高的敏感性,可做为动物模型,在RV感染的药物治疗效果评价和疫苗保护性效果评价中具有重要价值。