豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转化芥菜及抗虫鉴定

用农杆菌介导将豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)基因导入芥菜 ,获得了Kan抗性植株 .经PCR扩增、PCR Southern印迹和Northern印迹分析 ,转化再生植株大部分呈阳性 ,而非转化的再生植株均为阴性 ,证明CpTI基因已存在于芥菜基因组中 .在室内进行了喂虫试验 ,结果表明转基因芥菜抗虫性明显高于对照 ,转基因植株之间存在抗虫性差异     

获得高抗虫转双基因烟草

利用DNA合成仪人工合成了豇豆胰蛋白酶抑制剂(cpTl)的cDNA编码全序列。合成的基因经过克隆和序列分析后．克隆到植物高效表达载体上,并转化农杆菌,通过共转化的方法,将cpTI基因和经人工改造的苏云金芽孢杆菌(B．T)δ－内毒素基因共转化烟草,得到经PCR扩增并Southern－blotting验证的分别含有CpTI和B．T基因的植株以及同时含有CpTI和B．T基因的植株。利用棉铃虫幼虫进行的杀虫测试表明．转基因烟草和对照烟草相比具有明显的杀虫活性-同时转双基因的烟草和转单一基因的烟草相比具有增强的杀虫活性。     

通过根瘤农杆菌介导法获得菊花转基因植株

以带叶茎段为外植体,通过根癌农杆菌介导法,将兔防御素NP－1基因导入菊花品种“001”中。经梯度卡那霉素（kanamycin,Km）筛选,获得了大量Km抗性植株,其中部分Km抗性植株经Southem杂交鉴定为转基因植株。从而成功地建立了菊花遗传转化系统,为菊花分子育种奠定了基础。     

转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因抗虫甘蓝植株的获得

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)栽培品种“京丰”和“迎春”,并分别获得了转基因再生植株。对NPTⅡ的ELISA检测表明,标记基因NPTⅡ已在再生植株中得到有效表达。对转化植株进行Southern blot分子杂交实验进一步证明CpTI基因已整合到甘蓝的基因组。实验室内的叶片离体饲虫及盆栽饲虫试验表明,转基因甘蓝对菜青虫具有一定抗性。实验中还观察到,采用愈伤组织分化途径可以获得较高的转化频率,但嵌合体较多;而直接分芽的途径转化率低,但嵌合体较少。     

基因枪轰击成熟花粉粒转化玉米的研究

利用基因枪轰击花粉粒再授粉的基因转化途径,将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（CpTI）成功导入玉米受体中。经卡那霉素筛选结果表明,非转化植株经1000ppm卡那霉素溶液处理后白化、死亡,余下大量健壮、可育的抗性植株,转化率约1．59％。通过对抗性植株进行PCR和PCR—Southern检测,初步确定CpTI基因已导入玉米基因组。饲虫实验结果表明转化植株具有较强的抗虫性。     

农杆菌介导抗储粮害虫转基因小麦(Triticum aestivum L.)的获得及分析

以本实验室选育的小麦优良品系的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导将抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI转入小麦培养细胞,经筛选获得抗卡那霉素的愈伤组织并再生植株。经PCR和实时PCR检测、PCR-Southern和Southernblot验证,确定了3株独立再生植株为含有CpTI的转基因植株。农杆菌菌浓度、侵染时间及转化处理方式对小麦转化率均有明显影响。3株转基因植株正常可育并结籽,形成转基因株系。外源基因在转基因植株T1代中的分离呈多样性,部分株系(转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅲ)表现出孟德尔遗传规律。抗虫试验表明,3株转基因植株T2代籽粒对储粮害虫麦蛾具有一定的抗性,转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅱ、T-Ⅲ及非转基因植株的T2代籽粒虫蛀率分别为19·8%、21·9%、32·9%和58·3%。转基因植株T1代群体农艺性状调查显示,3个株系具有良好的农艺性状,为小麦的遗传改良提供了新的种质抗虫材料。     

高效烟草遗传转化体系的建立及甜蛋白基因的导入

以烟草无菌茁叶片为外植体,通过根癌农杆菌LBA4404介导法,将Thamnatin基因导人烟草中,经梯度卡那霉素(Kana-mycin,Km)筛选,获得可在含75mg／L、100mg／L Km选择生根培养基上再生的抗性植株,其中部分Km抗性植株经PCR检测为阳性,转化率为31．3％,初步鉴定已成功地建立了烟草遗传转化系统,为进一步探讨甜蛋白在植物中的转化和表达情况奠定基础。     

根癌农杆菌介导B.t.基因和CpTI基因对花椰菜的转化

用根癌农杆菌介导的方法 ,将B .t.基因和Cp TI基因分别导入花椰菜“杂交 75天”的父本和母本的无菌苗下胚轴切段细胞 ,都获得了转基因植株。经过预培养的下胚轴切段用根癌农杆菌 (LBA44 0 4/ pG BI4A2B ,含B .t .基因 ;LBA44 0 4/pBRLC ,含CpTI基因 )进行感染后 ,共培养 48h ,继续培养 30d后 ,将分化芽转移至筛选培养基上。 10d后 ,大多数分化芽的顶端变成紫色 ,2 0d后紫色芽逐渐变白死亡 ,而转化芽在选择培养基上长成小植株。小植株移至大田能正常生长、开花、结籽。PCR和Southernblot分析表明B .t和CpTI基因已整合在植物基因组中     

光敏启动子控制的酵母Hem1基因在烟草中表达

拟南芥hemA1基因启动子是一种光响应型启动子,它控制着植物体内5-氨基乙酰丙酸(ALA)昼夜节律型合成.将该启动子与酿酒酵母Hem1基因构建的二价载体转入烟草中,获得转基因植株.以转二价基因的烟草T0代种子为材料,用不同浓度卡那霉素(Km)溶液浸种,结果显示,种子发芽率和子叶绿化率随着Km浓度升高而降低.将1 000 mg·L-1Km溶液中长出的162株抗性植株移植至盆钵中培养,GUS检测出的阳性比率为92%.用特异引物PCR法检测Km抗性-GUS阳性植株,发现含有拟南芥HemA1基因启动子的比率为92.5%,含有酿酒酵母Hem1基因的比率为88%,含有二价重组基因的比率为84.2%.RT-PCR检测表明,Hem1基因在黑暗中的表达量明显低于光照下,证明光敏启动子有效地控制了结构基因Hem1的表达.生理指标分析表明,与野生型相比,转基因植株ALA合成速率、叶绿素含量明显增加,叶绿素b/a比值提高.野生型植株基部叶片SPAD值显著降低,而转基因植株基部叶片SPAD值保持较高水平.以上结果说明,外源二价基因已经成功整合到烟草基因组中,并且能够在光照条件下过量表达,合成过量ALA.     

几种白菜类蔬菜卡那霉素抗性的研究

标记基因的利用是筛选和鉴定基因转化的细胞、组织和转基因植株的有效方法。针对目前遗传转化中常用的卡那霉素(Km)抗性基因,对几种白菜类蔬菜的卡那霉素抗性作了较系统的探索,发现5.0 mg/L Km可完全抑制大白菜、小白菜及菜心子叶的再生;幼苗Km抗性测验表明各品种均表现出随着Km浓度的提高,子叶黄化率升高、根茎变短、鲜重减轻的趋势。白菜类蔬菜的卡那霉素抗性检测为遗传转化和阳性后代筛选奠定了基础。     

Transformation of Populus tomentosa with Insecticidal Cowpea Proteinase Inhibitor Gene

Cowpea trypsin inhibitor (CpTI) gene, an insecticidal gene, was introduced into poplar ( Populus tomentosa Carr. ) by gene transformation mediated by Agrobacterium tumefac/ens (Smith et Townsend) Conn. The influences on regeneration and transformation frequency of poplar by the concentration and addition of kanamycin were compared. Kanamycin resistant (Kmr) plantlets were obtained by 3 -4 cycles screening in selective condition. The ability of leaf regeneration and shoot subculture and rooting from the transformed and non-transformed plants in the presence of 50 mg/L kanamycin was examined. The presence of CpTI gene in the transgenic plants were confirmed by PCR and PCR-Southern blot. Assay on proteinase inhibition activity demonstrated that leaf protein extracts of the transgenic poplar showed higher inhibition activity against trypsin than that of control plants.     

‘欧美杨107’组培苗瓶外生根

‘欧美杨107’是近年来重点推广的杨树品种之一,但其组培苗存在移栽成活率不高的问题。本试验研究了‘欧美杨107’组培苗的直接瓶外生根和瓶内复壮后瓶外生根两种生根方式,结果表明,两种方式蘸取IBA的最佳浓度分别为10mg·L-1和100mg·L-1,生根率分别达73.33%和81.67%,移栽成活率分别为62.5%和93.33%。进一步研究发现生根的过程中外源补加0.5mg·L-1IBA溶液能加速生根,使生根周期缩短2周左右。添加1/2MS营养液可促进生根苗茎的生长和根的伸长,有利于移栽成活。瓶内生根苗的生根率高达到95%,但是移栽难以成活,显微镜观察发现瓶外生根苗比瓶内生根苗的根毛发达,验证了瓶外生根苗的根吸收功能更好。该研究对促进‘欧美杨107’组培苗及其转基因苗的推广应用具有重要的现实意义。     

Influence of poplar clones on fertility life-table parameters of Chaitophorus leucomelas (Hemiptera: Aphididae)

The aphid Chaitophorus leucomelas Koch (Hemiptera: Aphididae) is one of the most important pests of poplar (Populus spp.) plantations in Iran. In this study, development, reproduction, and life history of the aphid were assessed on 11 poplar clones; belong to three species, Populus nigra L., Populus deltoides Bartram ex Marshall, and Populus. euramericana Guinier. The experiments were carried out under controlled conditions at 24 +/- 1 degrees C, 50-60% RH, and a photoperiod of 12:12 (L:D) h. The developmental time at immature stage ranged from 10 to 12 d. Nymphs reproduced per female were ranged from 49 to 98 nymphs on Populus deltoides var. missoriensis and P. deltoides 72/51, respectively. The intrinsic rate of natural increase (r(m)) varied from 0.176 to 0.264 d(-1) among poplar clones. The r(m) values of the aphids were adversely affected in P. euramericana 242 in comparison with P. nigra 56/72 and P. nigra 63/135. In addition, the jackknife estimates of net reproductive rate (R0) indicated the presence of resistance among poplar clones. R0 ranged from 16.48 on P. nigra var. betulifoli to 47.53 on P. nigra 63/135. Mean generation times (T) was last 17.56 d on P. euramericana 242 to 14.51 d on P. deltoides 69/55. However, doubling time (DT) was 3.87 d on P. euramericana var. grandis to 2.63 d on P. nigra 63/135. The finite rate of increase (lambda) was 1.192 on resistant clone (P. euramericana 242) and 1.302 on susceptible clone (P. nigra 63/135). These results indicate that variation in life-table parameters could be an important component of variation in resistance to C. leucomelas in poplar.     

一种高效提取杨树发病树皮总RNA的方法及应用

对杨树发病树皮总RNA的高效提取是开展杨树抗溃疡病基因表达调控的基础,为了探讨杨树发病树皮RNA的高效提取方法,本研究以欧美杨细菌性溃疡病菌侵染后的‘中林46’杨为材料,比较了包括本研究提出的RNA提取新方法（RNA试剂盒改良法）在内的6种方法提取的总RNA的质量和浓度。结果显示,通过RNA试剂盒改良法提取的总RNA 28S rRNA条带亮度约为18S rRNA条带亮度的2倍且浓度高,表明该方法更适合感染欧美杨细菌性溃疡病的‘中林46’杨发病树皮总RNA的提取。为了验证RNA试剂盒改良法对健康杨树树皮及不同胁迫处理、组织RNA提取的适用性,进一步用该方法提取了‘中林46’杨、‘107’杨、‘北京’杨健康树皮,低氮、低磷处理的毛白杨组培苗以及白玉兰花的总RNA。结果表明,用RNA试剂盒改良法均能获取高质量的总RNA。所提取的总RNA已成功用于感染欧美杨细菌性溃疡病的杨树树皮转录组测序,以及低氮处理的毛白杨组培苗RT-PCR和荧光定量PCR实验,表明用RNA试剂盒改良法提取的总RNA可以用于后续分子实验。     

石斛兰转ACS反义基因抗性原球茎及转化植株的筛选与鉴定

该试验就石斛兰转化ACS(1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶)反义基因的不同筛选方法和筛选处理对抗性原球茎筛选的影响,以及石斛兰转基因植株的再生与鉴定进行研究.结果表明:(1)石斛兰原球茎经带有gus报告基因和ACS反义基因的农杆菌LBA4404侵染共培养5d后除菌,采用逐渐提高选择压浓度的延迟筛选,并在低选择压浓度下切割而高选择压浓度下不切割的处理方式为抗性原球茎的最佳筛选途径,抗性原球茎获得率可达14.97％.(2)抗性原球茎繁殖时应逐渐降低选择压浓度,且在低选择压浓度下进行切割处理,繁殖倍数达到1.15倍,且原球茎生长势好.(3)抗性原球茎在1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA培养基中的分化率达到73.85％;107株无根小苗培养于1/2 MS+1.0 mg/L NAA+50.0 mg/L Km(卡那霉素)+100.0 mg/L Cef(头孢霉素)培养基中进行生根培养,共获得了13株具有卡那霉素抗性的转化植株,转化效率达到12.15％.(4)转化植株经报告基因产物GUS组织化学检测和gus的PCR检测,证实带ACS反义基因的T-DNA已整合进石斛兰基因组中,且转基因植株在形态上与未转基因植株无明显差别,3株转基因植株移栽2个月后均已成活.     

利用离体叶片鉴定杨树耐盐潜力

以受体杨树107和转基因杨树18-1的一年生枝条为材料, 采用Hoagland营养液水培方法, 添加不同浓度的NaCl, 检测二者植株生长以及叶中Na⁺和K⁺含量的变化。结果表明, 在0.6%NaCl处理下18-1生根率明显高于107, 生物量较大, 叶片中Na⁺积累量是107的1.45倍左右。以107和18-1离体叶片为材料, NaCl处理下测定其生理活性指标, 发现18-1叶盘的失绿速度和相对电导率都显著低于107叶盘。把离体叶片接种在改良MS培养基上, 1.2%NaCl处理可使107叶盘几乎停止伸长, 细胞大小不再增加; 而18-1叶盘培养7天后伸长了近50%。以上结果表明利用离体叶片可以鉴定出不同基因型杨树的耐盐潜力。     

青菜的高效再生和农杆菌介导B.t.及CpTI基因的转化

分别对培养基中适宜的激素组成和AgNO3 添加浓度进行研究 ,建立了青菜下胚轴和子叶外植体的高效再生系统 ,青菜品种“矮抗青”的最高芽分化频率下胚轴可达 6 5 % ,子叶为 5 2 %左右。在此基础上 ,对影响转化频率的不同因素进行了探讨 ,共获 94株卡那霉素抗性植株。对转基因植株总DNA的Southernblot ting分析证明 ,B .t .基因和CpTI基因已整合到青菜植株的细胞核基因组中。经过抗虫性筛选试验 ,从转基因植株的T3 代筛选到 7个转B .t.基因的抗虫纯合株系和 5个转CpTI基因的抗虫纯合株系 ,并进入田间小区青菜抗虫新品种试验     

利用离体叶片鉴定杨树耐盐潜力

以受体杨树107和转基因杨树18-1的一年生枝条为材料,采用Hoagland营养液水培方法,添加不同浓度的NaCl,检测二者植株生长以及叶中Na＋和K＋含量的变化。结果表明,在0.6%NaCl处理下18-1生根率明显高于107,生物量较大,叶片中Na＋积累量是107的1.45倍左右。以107和18-1离体叶片为材料,NaCl处理下测定其生理活性指标,发现18-1叶盘的失绿速度和相对电导率都显著低于107叶盘。把离体叶片接种在改良MS培养基上,1.2%NaCl处理可使107叶盘几乎停止伸长,细胞大小不再增加;而18-1叶盘培养7天后伸长了近50%。以上结果表明利用离体叶片可以鉴定出不同基因型杨树的耐盐潜力。     

Cloning and Characterization of Trypsin Inhibitor Gene from Vigna unguiculata

A trypsin inhibitor, member of Bowman-Birk family, was isolated and purified from cowpea (Vigna unguiculata]). Polyclonal antibodies were raised against cowpea trypsin inhibitor (CpTI) protein in rabbits. The gene for CpTI was amplified by polymerase chain reaction and cloned in a bacterial expression vector pVCATFR18416. The expression of CpTI protein in BL21 (DE3) strain of Escherichia coli was confirmed by western blot studies. The CpTI gene was also sequenced and found to exhibit 100% homology with already published sequence of CpTI gene.