一株牛源都柏林沙门氏菌的全基因组测序及毒力与耐药性分析

【背景】沙门氏菌(Salmonella spp.)是重要的人畜共患病原菌,其毒力和耐药性的不断增强引起广泛关注。【目的】了解从通辽市一犊牛死亡病例中所分离牛源都柏林沙门氏菌的毒力及耐药性情况。【方法】以病死犊牛肺脏为材料,经细菌分离纯化及16S rRNA基因测序,鉴定病原为沙门氏菌。采用动物试验、药敏试验和PCR方法对分离菌进行毒力、耐药性,以及毒力基因和耐药基因检测,并对其进行全基因组测序分析。【结果】分离菌具有较强毒力,对小鼠半数致死量为2.8×10⁶ CFU/mL。分离菌为多重耐药菌,仅对多粘菌素B和噻孢霉素敏感,对强力霉素和恩诺沙星中度敏感。检测13种沙门氏菌常见毒力基因,检出率为92.3%。对分离菌进行全基因组测序分析,该菌株为都柏林沙门氏菌,基因组大小为4 965 370 bp,GC含量为52.12%,同时携带2个质粒,大小分别为79 524 bp (pTLS-1)和45 301 bp (pTLS-2)。分离菌中共携带996个毒力基因和24个毒力岛;共携带42个耐药基因,其中4个为可水平转移基因,基因组中存在9个可移动遗传元件,包括插入序列和转座子等。【结论】分离牛源都柏林沙门氏菌菌株具有较强毒力且为多重耐药株,携带大量毒力基因及耐药基因。     

鸡源奇异变形杆菌分离鉴定及生物学特性

【背景】奇异变形杆菌(Proteusmirabilis,PM)是人畜共患病原菌,在自然界分布广泛。近年来,随着畜禽奇异变形杆菌病发病率上升和耐药性增强,亟需开展对该菌的防控研究。【目的】分离鉴定鸡源奇异变形杆菌,鉴定其耐药性、致病性、生物被膜形成能力等生物学特性。【方法】采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法鉴定了从2019-2020年病鸡中分离的52株临床奇异变形杆菌。分别采用药敏试验、PCR、结晶紫染色法对临床菌株的耐药性、毒力基因及生物膜的形成进行研究。【结果】选择14株代表性菌株进行16SrRNA基因测序,结果表明所测分离菌株均为奇异变形杆菌。所有分离菌株均对克林霉素、阿奇霉素、红霉素、四环素和利福平耐药,对氯霉素和头孢曲松外的抗生素耐药性均高于50%。对分离的奇异变形杆菌的13个毒力基因检测表明,所有菌株均能检测到hpmA、hpmB、rpoA、mrpA、fliL、zapA、ureC、atfC、atfA、pmfA,而ucaA和rsbA检出率分别为19.23%(10/52)和48.08%(25/52),hlyA未检出。对分离株生物被膜形成能力检测结果表明,所有菌株均能形成生物被膜,19.23%(10/52)的分离菌株形成生物被膜能力强,而且25℃条件下成膜能力比37℃更强。【结论】鸡源奇异变形杆菌携带多种毒力基因,具有较强生物被膜形成能力,耐药模式多样且日趋严重,应进一步加强对奇异变形杆菌在动物致病性和耐药性方面的监控,以降低其感染风险。     

一株猪葡萄球菌的分离鉴定、生物学特性研究及全基因组测序分析

【背景】2021年6月,广东省茂名市某散养户送检了一头发病仔猪,猪身上长有脓疱,四肢关节肿大,关节内可见脓液。【目的】确定引起仔猪发病的病原菌,分析其药物敏感性,为临床用药提供指导;对分离菌株进行全基因组序列分析,挖掘其毒力因子和耐药基因,揭示该菌致病和耐药的分子机制。【方法】取关节脓液分离细菌;通过革兰氏染色、16S rRNA基因和全基因组测序分析,鉴定细菌种类;通过溶血试验、血浆凝固酶试验和生长曲线测定,确定分离菌株的溶血活性、血浆凝固酶活性和生长特性;用小鼠感染模型评估分离菌株的致病性;用纸片扩散法测定分离菌株的药物敏感性;通过全基因组序列分析挖掘分离菌株的毒力因子和耐药基因。【结果】分离菌株被鉴定为猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus);该菌不溶血,无血浆凝固酶活性,在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中于37℃、120r/min条件下生长良好;小鼠感染试验结果显示,该菌具有高致病性;药敏试验结果显示,该菌对苯唑西林、大观霉素等7种药物敏感,对青霉素G、红霉素等9种药物耐药;全基因组序列分析结果显示,该菌携带多个毒力因子和耐药基因。【结论】从发病仔猪的关节脓液中分离到一株猪葡萄球菌,可用苯唑西林、大观霉素等药物防控该菌感染;解析了该菌的基因组信息,为后续深入研究该菌致病和耐药的分子机制奠定了基础。     

云南地区鸭源沙门菌的分离鉴定及耐药性和毒力基因分析

【背景】沙门菌是一种重要的食源性人兽共患病原菌,可引起多种食源性疾病。【目的】了解云南地区鸭源沙门菌病的流行现状、耐药现象及毒力基因携带等基本情况。【方法】无菌采集云南各地区病死鸭肝脏样品169份进行沙门菌分离,对分离株进行血清分型鉴定、药敏及相关耐药基因、毒力基因筛查。【结果】分离到鸭源沙门菌48株,分离率为28.40%,鉴定出3种血清型,其中肠炎沙门菌为优势血清型。分离株对青霉素G、林可霉素、克林霉素和利福平的耐药率达100%,每株菌至少对3类6种及以上的抗生素耐药,单株最高可耐14种,产生了22种耐药谱型。共检出耐药基因5种,bla_TEM和tetB检出率分别为27.08%和22.92%,tetA、sul2和EBC的检出率较低。毒力基因共检出10种,其中,SPI-1(avrA)、SPI-3(mgtC)、SPI-4(siiD)、SPI-5(sopB)和bcfC检出率均高达100%,SPI-2(ssaQ)、spvB、spvC、pefA和stn的检出率均达60%以上,cdtB未检出。【结论】云南地区鸭源沙门菌主要流行血清型为肠炎沙门菌,耐药性及多重耐药情况严重,耐药机制复杂,耐药基因与耐药表型符合率低,毒力基因检出率较高。研究结果可为云南地区鸭群沙门菌病的防控和净化提供参考。     

凹甲陆龟沙门氏菌的分离鉴定及毒力因子基因的PCR检测

从成都动物园因腹泻死亡的凹甲陆龟体内分离到一株病源菌,经选择性分离培养、生化试验、血清型鉴定等,确定该病源菌为D群肠炎沙门氏菌,其抗原结构式为1,9,12∶ g,m∶ -.该菌株对小鼠有较强的致病性,能引起人工感染小鼠大量死亡,且从其体内分离到相同特性的菌株;药物敏感性试验证实该分离菌对头孢曲松、氧氟沙星、卡拉霉素、多粘菌素、复方新诺明、呋喃唑酮等敏感,对链霉素、四环素、氯霉素等耐药;同时根据GenBank中已报道的沙门氏菌毒力因子ivnA和ivnE的基因序列,设计两对特异性引物对该菌进行PCR检测,结果在该菌中成功扩增并检测出ivnA和ivnE基因.本试验尝试了沙门氏菌的PCR检测方法,为该分子诊断技术的全面推广奠定了良好基础,也为今后该疾病的预防、诊断和治疗提供了科学的实验数据.     

鹅源奇异变形杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

【背景】奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)是一种人兽共患机会致病菌,革兰氏阴性,兼性厌氧,呈多形性。【目的】探明内蒙古自治区通辽市某养殖场雏鹅发生死亡的病因,研究致病菌的分类地位和毒力基因携带情况。【方法】通过病原菌的筛查和感染试验确定发病原因,对其16S rRNA基因测序,建立病原菌系统进化树,结合BD PhoenixTM 100全自动微生物鉴定仪对病原菌进行分析鉴定,综合判定致病菌的种类及其分类地位;根据已报道的基因序列合成奇异变形杆菌的ure C、zapA、mrp A、ucaA、rsbA、pmfA、atfA、atfC8个毒力基因引物,通过PCR扩增研究病原菌毒力基因携带情况。【结果】致病茵的16Sr RNA基因与已报道的奇异变形杆菌(P.mirabilis)相似性在99%以上,通过构建系统进化树和BDPhoenixTM100全自动微生物鉴定仪鉴定,确定该菌株为P.mirabilis并编号为AYQ-1;8种毒力基因在该致病菌中均被检测到;雏鹅腹腔注射感染可导致雏鹅死亡,半致死浓度(LD_(50))为1.51×10~7 CFU/mL;药敏试验结果显示,该菌对链霉素、氨曲南和氧氟沙星等19种药物敏感,对万古霉素、青霉素和四环素等15种药物耐药。【结论】AYQ-1经鉴定为鹅奇异变形杆菌,毒力基因型为ureC(+)、zapA(+)、mrpA(+)、ucaA(+)、rsbA(+)、pmfA(+)、atfA(+)、atfC(+)型。     

鹌鹑源鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定与耐药性分析

【背景】在鹌鹑养殖过程中,抗菌药物和消毒剂的不规范使用加剧了耐药菌株在动物、场所和食品之间的相互传播,因此,掌握致病菌株在养殖动物中的耐药状况至关重要。【目的】检测北京周边地区鹌鹑蛋源致病菌株的耐药特征和耐药基因的流行情况。【方法】在天津市武清区部分鹌鹑养殖场采集鹌鹑泄殖腔粪便、鹌鹑蛋表、养殖环境和鹌鹑饮水的样品,通过细菌分离培养、菌落形态观察、染色镜检、生化鉴定、血清分型、沙门氏菌inv A基因序列测定等方法对分离菌株进行鉴定。同时进行小鼠攻毒试验,测定小鼠半数致死量(median lethal dose, LD50)。再通过药敏试验和PCR方法对分离菌的耐药表型、耐药基因及毒力基因进行检测。【结果】分离菌株菌落颜色、镜检形态和生化试验结果符合沙门氏菌特性,沙门氏菌inv A基因序列测定与鼠伤寒沙门氏菌参考株相似度为99.44%,鉴定为鼠伤寒沙门氏菌,血清型为1,4,[5],[12]:i:l,2。该菌株对小鼠有致病作用,小鼠LD50为2.10×107 CFU/mL;药敏试验结果显示该菌株对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻呋、链霉素、磺胺甲啞唑、磺胺异啞唑、诺氟沙星、环丙沙星表现耐...     

重庆市北碚区宠物源沙门氏菌耐药性监测及ESBL和PMQR基因检测

【背景】沙门氏菌是一种常见的人兽共患病病原菌。随着饲养宠物的人越来越多,宠物肠道内沙门氏菌对公共卫生的威胁逐渐显现,但鲜见宠物携带沙门氏菌的流行病学及宠物源沙门氏菌耐药性的报道。【目的】了解重庆市北碚区宠物源沙门氏菌的流行情况,以及其对常用抗菌药物的敏感性及超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrumβ-Lactamases,ESBL)基因和质粒介导的喹诺酮耐药(Plasmid-Mediated Quinolone Resistance,PMQR)基因的携带情况。【方法】共采集北碚区宠物粪便样品1 038份,通过样品前增菌、选择性增菌、选择性平板筛选和PCR鉴定沙门氏菌特异性invA基因分离鉴定沙门氏菌;接着测定了分离菌株对28种抗菌药物的敏感性,检测了10种ESBL基因和10种PMQR基因。【结果】共分离到沙门氏菌41株,分离率为3.95%。这些菌株对磺胺异噁唑、氨苄西林、四环素、多西环素的耐药率都超过50%,而且82.92%为多重耐药菌株,对阿米卡星、氧氟沙星、依诺沙星、加替沙星完全敏感;85.37%的分离菌携带ESBL基因,以blaTEM基因最为流行;46.34%携带PMQR基因,以qnrS最为流行;48.57%的ESBL阳性菌株携带至少一种PMQR基因。【结论】北碚区宠物体内的沙门氏菌对一些抗菌药物存在不同程度的耐药性,而且耐药性可能是通过耐药质粒介导的。     

9株鱼源鰤诺卡氏菌生物学特征和致病性比较

【背景】鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是一种革兰氏阳性好氧菌,易引起鲈形目鱼类结节病发生,近几年对大口黑鲈、杂交鳢等名优鱼类的危害越来越大。【目的】比较分析9株不同年份、不同地区患结节病的不同淡水鱼品种分离的鰤诺卡氏菌的种间同源关系、生长特性、致病性以及药物敏感性差异,为进一步研究制定相应的防控与治疗措施提供基础数据和科学依据。【方法】在9株试验菌生理生化实验鉴定结果基础上,采用16SrRNA基因序列比对、限制性片段长度多样性比较菌株间的同源性;扩增看家基因secA1基因序列进行不同来源菌株种内相似度比对;通过体外培养比较不同菌株的生长情况;人工注射感染分析9株试验菌对大口黑鲈的致病性差异;采用微量肉汤二倍稀释法测试9株试验菌对13种抗菌药物的最小抑菌浓度;运用PCR技术检测菌株携带毒力基因和耐药基因的情况。【结果】生理生化结果显示9株试验菌与鰤诺卡氏菌的基本理化特征相符;9株试验菌聚类分析聚为一类,种内相似度高,限制性片段长度多样性酶切图谱相同,生长特性无明显差异;9株试验菌对大口黑鲈致病性无显著差异,但毒力基因携带情况略有不同,其均携带mce1A、mig和pup基因,而dop和whiB3只在部分菌株检出;9株试验菌均对氟甲喹和氨苄西林耐药,除NS1外,都对磺胺间甲氧嘧啶耐药,对大部分抗菌药物敏感,主要携带blaTEM和sul1耐药基因。【结论】不同时间、不同地区及不同宿主分离的9株鰤诺卡氏菌在生物学特性、致病性和药物敏感性等方面无明显差异;同源性相近,提示华南地区感染淡水鱼的鰤诺卡氏菌可能为同一流行株型。研究结果为鰤诺卡氏菌的发病机制及防控技术的进一步研究奠定了基础。     

禽大肠杆菌、肠炎、鼠伤寒、鸡白痢及鸡伤寒沙门菌多重PCR方法的建立及应用

【背景】大肠杆菌病和沙门菌病是最常见的家禽细菌性疾病,给养禽业造成严重经济损失。另外,禽大肠杆菌和沙门菌也是重要的人畜共患病原菌,可通过禽类及其产品传播给人类,对人类健康造成严重威胁。加强禽大肠杆菌和沙门菌的快速鉴别检测,对养禽业和公共卫生都具有重要意义。【目的】建立禽大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的多重PCR检测方法。【方法】通过比较分析确定禽致病性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的特异靶标基因,设计5对特异性引物,通过条件优化建立多重PCR方法,分析该多重PCR方法的特异性、敏感性及可靠性。【结果】该方法能特异性地鉴定禽致病性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌,每个PCR反应的最低检出限分别为103 CFU细菌和100 pg基因组DNA。临床分离菌株检测显示,多重PCR与传统血清学方法结果一致。【结论】建立的多重PCR方法能够快速鉴别禽致病性大肠杆菌和不同血清型沙门菌,对禽大肠杆菌病和沙门菌病的流行病学调查及临床检测具有重要意义。     

Virulent strains of Salmonella enteritidis disrupt the epithelial barrier of Caco-2 and HEp-2 cells

To confirm the existence in nature of Salmonella enteritidis strains of different degrees of virulence and to elucidate the mechanisms underlying the effects of such strains on the epithelial barrier function, the consequences of infection of Caco-2 cells and HEp-2 cells with 15 S. enteritidis strains in a chicken infection model were examined. The more virulent strains of S. enteritidis, which are biofilm producers in adherence test medium, were able to disrupt HEp-2 and Caco-2 monolayers, as shown by transmonolayer electrical resistance and lactate dehydrogenase activity. In contrast, the low-virulence strains of S. enteritidis, which do not produce biofilms in adherence test medium, had no effect on the same cells. An avirulent rough mutant of Salmonella minnesota exhibited a pattern of behaviour similar to that of the low virulence strains of S. enteritidis, whilst a clinical Salmonella typhi strain caused rapid injury to the monolayers. The effect of supernatants of Salmonella cultures in adherence test medium on the integrity of Caco-2 cell monolayers indicated that the high-virulence S. enteritidis strains, but not the low-virulence strains, release a soluble factor when incubated under optimum biofilm-forming conditions, which enables the disruption of the integrity of Caco-2 monolayers.     

长春地区鸡源奇异变形杆菌的分离鉴定及毒力分析

【背景】奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)是一种机会致病菌,广泛存在于周围环境中,常导致动物和人类感染。【目的】探究吉林省长春地区某养鸡场病鸡死亡原因,为疾病防控提供参考。【方法】从病死青年鸡脏器分离到病原菌TSA-1,通过革兰氏染色、生化试验和16S rRNA基因序列鉴定,并进行药敏试验、毒力基因检测、细胞毒性和黏附性试验、大蜡螟攻毒试验研究。【结果】分离株TSA-1在镜下呈短杆状、球状的革兰氏阴性菌,生化特性与奇异变形杆菌相一致,16S rRNA基因序列比对显示与奇异变形杆菌相似度为100%;药敏试验结果显示分离株TSA-1对氨苄西林、四环素、卡那霉素、头孢唑林等14种药物耐药,对环丙沙星、恩诺沙星等7种药物敏感;分离株还具有较强的生物被膜形成能力,携带ireA、ucaA、pmfA、atfA、ptA、zapA、hpmA和flhC这8种毒力基因,并对巨噬细胞RAW264.7表现出细胞毒性,而且对Caco-2细胞具有很强的黏附作用;同时对大蜡螟幼虫表现出比禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coliO78,APEC-O78)更强的致死作用。【结论】从病死鸡脏器分离得到的奇异变形杆菌TSA-1具有多重耐药性,并携带多种毒力基因,对细胞和大蜡螟幼虫表现出强毒性作用,说明该菌是引起病鸡死亡的主要致病菌之一,应引起重视。     

肠炎沙门氏菌鸡源株ompR 基因缺失株的构建及生物学特性与亲本株的比较

【目的】为了探讨ompR基因在肠炎沙门氏菌生物被膜形成及毒力中的作用。【方法】以肠炎沙门氏菌作为母本,运用自杀性载体pGMB151构建了ompR基因缺失株,结晶紫染色法和扫描电镜观察测定缺失株的生物被膜形成能力,细胞的吸附和侵入及小鼠攻毒试验测定缺失株的毒力。【结果】RT-PCR和蛋白表达证明了ompR基因缺失株构建成功;该缺失株不表达纤维素和菌毛,不形成生物被膜;上皮细胞吸附和侵入试验表明缺失株与野生株具有相同的吸附和侵入率;BALB/c鼠腹腔感染性试验表明,缺失株的半数致死量为106.67CFU,而野生株的半数致死量小于2 CFU。【结论】ompR基因既是肠炎沙门氏菌生物膜形成的调控基因,又是重要的毒力基因。     

Characterization of antimicrobial susceptibility and virulence genes of Salmonella serovars collected at a commercial turkey processing plant

Aims:  To determine the antimicrobial susceptibility profiles, distribution of class 1 integrons, virulence genes and genes encoding resistance to tetracycline ( tetA , tetC , tetD and tetE ) and streptomycin ( strA , strB and aadA1 ) in Salmonella recovered from turkeys.
Methods and Results:  The antimicrobial susceptibility of 80 isolates was determined using National Antimicrobial Resistance Monitoring System. The distribution of resistance genes, class 1 integrons and virulence genes was determined using PCR. Resistances to tetracycline (76·3%) and streptomycin (40%) were common. Sixty-two (77·5%) isolates displayed resistance against one or more antimicrobials and 33 were multi-drug resistant. tetA was detected in 72·5% of the isolates, while tetC , tetD and tetE were not detected. The strA and strB genes were detected in 73·8% of the isolates. Two isolates possessed class 1 integrons of 1 kb in size, containing the aadA1 gene conferring resistance to streptomycin and spectinomycin. Fourteen of the virulence genes were detected in over 80% of the isolates.
Conclusions:  This study shows that continuous use of tetracycline and streptomycin in poultry production selects for resistant strains. The Salmonella isolates recovered possess significant ability to cause human illness.
Significance and Impact of the Study:  Information from this study can be employed in guiding future strategies for the use of antimicrobials in poultry production.     

3株禽滑液囊支原体分离株致病性的比较和评价

【背景】禽滑液囊支原体是感染鸡的一种重要病原体,给我国的家禽养殖业带来了严重的经济损失。【目的】评价从病鸡中分离到的3株禽滑液囊支原体的致病性,以期丰富不同区域来源的分离株对鸡致病性的认识。【方法】分别用分离株CHN-WF224-2016、CHN-BZJ2-2015、CHN-JNB19-2016感染商品肉鸡,并在攻毒后第10天和21天进行实验室解剖,通过气囊和足垫的临床病变、血清学检测结果及气管粘膜病理形态学改变来比较评价分离株的致病力。【结果】CHN-BZJ2-2015和CHN-WF224-2016分离株能引起明显足垫肿胀和关节滑膜炎,其中CHN-BZJ2-2015分离株致病力最强,感染21 d后的血清学检测和气管粘膜厚度与CHN-JNB19-2016分离株和MS-H疫苗株比较差异显著(P<0.05)。【结论】本研究表明我国目前流行的禽滑液囊支原体菌株其致病力存在明显差异,强调养殖场要积极控制和预防禽滑液囊支原体感染的重要性,同时为今后该疫苗的研发积累了实验数据。     

转座子随机插入鉴定肠炎沙门氏菌生物膜形成相关基因

[目的]生物膜在沙门氏菌的致病性和引起沙门氏菌食物中毒等方面起着重要作用,本研究为了鉴定影响沙门氏菌生物膜形成的基因.[方法]利用结晶紫染色定量法对74株鸡源的肠炎、鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌进行生物膜测定,选择生物膜生长较好的肠炎沙门氏菌C050041,采用转座子随机插入法构建突变株库.[结果]84%的鸡源沙门氏菌菌株可在塑料表面形成生物膜;通过转座子插入获得1924个突变株,筛选的生物膜降低突变株经生长曲线测定、测序和序列比对及Southern blot分析鉴定出15个插入基因,它们分别为metE、ompR、rpoS、,和G、rfaJ、rfaK、rfaP、rfbH、rhlE、spiA、steB、tpx、ybdN和2个未知功能的基因.[结论]我们鉴定出了多个影响生物膜形成的新基因,这些基因的发现为进一步研究沙门氏菌生物膜形成的调控机制,研制减毒沙门氏菌疫苗奠定了基础.