解脂耶氏酵母TSR1基因的定点诱变*

对解脂耶氏酵母与蛋白质分泌有关的TSR1基因进行寡核苷酸介导的定点诱变 ,限制性内切酶切割和拼接 ,得到了该基因的一系列缺失突变体。这为进一步研究TSR1基因不同结构域的功能奠定了基础。     

解脂耶氏酵母tsr1突变体的构建

将解脂耶氏酵母与蛋白质分泌有关的TSR1基因编码区部分缺失的DNA片段转化一株解脂耶氏酵母,通过体内同源重组,部分缺失的外源tsr1片段取代了酵母染色体上的正常的TSR1基因,从而获得tsr1的转化子。Southern杂交结果表明,用该法成功地构建了tsr1突变体,这为进一步研究解脂耶氏酵母TSR1基因的功能奠定了基础。     

SINPV基因组酶切图谱及多角体基因的序列分析

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＸａｂＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＨｉｄｎⅢ、ＳｍａＩ酶解斜纹夜蛾核多角体病毒广州株基因组ＤＮＡ,分别得到２６、２６、２４、２０、１３、１７、９、１条片段,并算得基因组平均大小为１３６．０ｋｂｐ。以ＡｃＮＰＶ多角体基因的部分读码框为探针,经Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交将ＳＩＮＰＶ多角体基因定位于ＸｂａＩＯ片段上。将此片段克隆并序列分析,结果表明ＳＩ     

非常规酵母天然产物合成

以解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)为代表的非常规酵母凭借较广的底物利用谱、较强的环境耐受性等优势,已成功实现多种天然产物的高效生产。随着合成生物学及基因编辑技术的发展,针对非常规酵母代谢工程改造的工具和策略也逐渐丰富。本文介绍了几类常见的非常规酵母的生理特性、工具开发及应用现状,并总结归纳了天然产物合成优化中常用的代谢工程策略;最后讨论了现阶段非常规酵母作为天然产物合成细胞工厂的优势和不足,并对后续研究和发展趋势进行了展望。     

产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因的克隆

当酵母细胞处于高渗压环境时,甘油被诱导合成以提高其胞内渗透压,这一过程受ＨＯＧ途径的调控。ＧＰＤ１基因为ＨＯＧ途径的重要靶基因,高效表达使胞内３磷酸甘油脱氢酶酶活水平提高可极大地提高甘油的产量。本研究将产甘油假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｇｌｙｃｅｒｏｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡＩ部分酶解后的５～１０ｋｂＤＮＡ片段与经ＢａｍＨＩ线性化及ＣＩＰ处理过的酵母大肠杆菌穿梭质粒ＹＥｐ５１连接,以大肠杆菌ＤＨ５α为受体,构建产甘油假丝酵母的染色体基因文库。通过遗传互补法,在含５０ｇ／Ｌ氯化钠的培养基上筛选出１５个转化子,对转化子０６０１进行了进一步鉴定,转化子０６０１所含质粒ＹＥｐ０６０１带有ＹＥｐ５１的标记并可以消除Ｓａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ６４２菌株由于其ＧＰＤ１,ＧＰＤ２两基因的缺失突变而表现出的渗透压敏感性,表明已克隆到产甘油假丝酵母的编码胞浆３磷酸甘油脱氢酶的基因     

以thyA基因为选择压力非抗性质粒载体的构建*

以干酷乳杆菌Ｌ．Ｃａｓｅｉ３４１０３染色体ＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ技术扩增胸苷酸合成酶（Ｔｈｙｍｉｄｙ－ｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ｔｈｙＡ）基因，回收纯化。选择以红霉素抗性为选择压力的可以在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭表达的质粒ｐＷ４２５ｅ为基本质粒，以ｔｈｙＡ基因取代红霉素基因，获得重组载体并鉴定。此重组载体可以对ｔｈｙＡ基因缺陷的大肠杆菌Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｘ５１和嗜酸乳杆菌ＤＯＭＬａＳ １０７进行功能弥补。进而构建了以ｔｈｙＡ基     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的Lys306为酶活力所必需

将大肠杆菌精氨酰ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）上Ｌｙｓ３０６用基因点突变的方法分别变为Ａｌａ和Ａｒｇ的密码子;得到变种基因ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ａｒｇｓ３０６ＫＲ。变种基因重组在ｐＵＣ１８上,转化到大肠杆菌ＴＧ１中,转化子中ＡｒｇＲＳ及其变种ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ和ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ所表达的蛋白量至少为ＴＧ１表达ＡｒｇＲＳ蛋白量的１００倍。细胞粗抽提液中ＡｒｇＲＳ的比活ＴＧ１、转化子ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ、ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ｐＵＣ１８－ａｒｇｓ３０６ＫＲ分别为１．６５、２１０、１．８和３８单位／毫克。结果表明ＡｒｓＲＳ的Ｌｙｓ３０６为Ａｌａ取代使活力完全丧失;若被Ａｒｇ取代,则活力丧失８０％以上。Ｌｙｓ３０６为ＡｒｇＲＳ活力所必需。     

黑曲霉中内切菊粉酶基因及其全合成基因在解脂耶氏酵母中表达的比较

利用酵母密码子偏爱性将黑曲霉(Aspergillus niger)中的内切菊粉酶(Endoinu linase)基因通过基因全合成的方式合成为酵母密码子偏爱性的内切菊粉酶基因。然后将原始和全合成的内切菊粉酶基因克隆到解脂耶氏酵母表达载体PINA1296上,得重组解脂耶氏酵母表达载体pHBM2020、pHBM2021,将两种质粒分别转化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)CLIB725,筛选得到重组解脂耶氏酵母CLIB725(pHBM2020)、CLIB725(pHBM2021),将两种重组酵母摇瓶培养,经SDS-PAGE、测酶活检测表明两种基因在解脂耶氏酵母中都有表达,全合成菊粉酶比原始菊粉酶酶活要高。     

新疆地区盐湖的中度嗜盐菌的16S rDNA PCR-RFLP分析*

对来自新疆地区艾丁湖、艾比湖和玛那斯盐湖等盐湖的２８株中度嗜盐菌与９株相关的参比菌株, 进行了１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析,这些菌株是革兰氏阴性杆菌,能在０～２５％ＮａＣｌ中生长。在实验中, 选用４种限制性内切酶ＡｌｕＩ、ＨｉｎｆＩ、ＲｓａＩ和ＨａｅⅢ,将供试菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ产物进行酶切,用３％ 的琼脂糖电泳分析酶切产物。结果表明,在７４％的相似性水平上分为３群。群Ⅰ包括新分离的菌株ＣＩ和　　参比菌株死海色盐杆菌（Ｃｈｒ     

wbnH2基因对北京欧文氏菌生物学特性及致病力的影响

【背景】北京欧文氏菌(Erwinia beijingensis)引起的刺芹侧耳细菌性软腐病(bacterial soft rot)给企业带来了严重的经济损失。wbnH2糖基转移酶基因在北京欧文氏菌中的生物学功能尚不明确。【目的】构建wbnH2基因的缺失株Δ-wbnH2和回补株C-wbnH2,探究wbnH2基因对北京欧文氏菌致病性的影响。【方法】采用同源重组方法构建北京欧文氏菌LMG 27579^TwbnH2基因缺失突变株Δ-wbnH2,并对基因缺失菌株的致病性、生长速度、运动能力、生物膜形成能力、黏附能力等生物学特性与野生型菌株进行比较分析;采用广宿主质粒pBBR1MCS2构建回补株C-wbnH2,排除了极性效应引起的突变株表型变化。【结果】与野生型菌株相比,基因缺失株Δ-wbnH2的生长速度无明显差别。但是wbnH2基因的缺失导致多糖分泌、生物膜形成能力、黏附能力、致病能力明显下降。【结论】wbnH2基因影响北京欧文氏菌多糖分泌、生物膜的形成能力、黏附能力及致病力,表明该基因在北京欧文氏菌致病过程中起重要作用,本研究为软腐病的防控提供了理论基础。     

染色体外DNA在酵母细胞衰老中的作用

细胞衰老的影响因素甚多,机制复杂。近年来已发现酵母染色体外ＤＮＡ在细胞衰老中具有重要作用,并认为细胞的衰老受控于一种特定的染色体外ＤＮＡ复制的次数,具有精确的时间控制机制［１、２］。１．染色体外ＤＮＡ与衰老的关系酵母染色体外存在大小不等的ｒＤＮＡ环,称为染色体外ｒＤＮＡ环（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏ－ｓｏｍａｌｒＤＮＡｃｉｒｃｌｅ,ＥＲＣ）。已发现衰老的酵母细胞中含有丰富的ＥＲＣ,而年轻酵母细胞中的ＥＲＣ则很少。芽殖酵母中含有人类Ｗｅｒｎｅｒ氏综合征（一种早老症）ＷＲＮ基因的同源序列——ＳＧＳ１基因…     

发酵产泡性能降低的解脂耶氏酵母菌株的获得及其评价

微生物发酵过程中泡沫的产生是发酵领域遇到的共性问题。在不影响发酵性能的前提下抑制菌株的产泡,对简化操作以及降低发酵成本具有较为重要的意义。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica,之前称为Candida lipolytica)是一种常用的合成生物学底盘,也是合成赤藓糖醇等功能糖醇的生产菌株。但在发酵合成赤藓糖醇的过程中会产生大量的泡沫,需要添加消泡剂以消除泡沫。【目的】本研究旨在开发一种产泡能力显著降低的解脂耶氏酵母新菌株,以减少赤藓糖醇发酵过程中消泡剂的添加。【方法】本研究利用解脂耶氏酵母中非同源靶向重组占支配地位的原理,采用一段外源DNA随机插入基因组的手段,随机突变基因组,改变菌株的发酵产泡性能,使突变株在发酵过程中不产泡或者降低其产泡的能力。【结果】通过筛选,获得一株在发酵过程中产泡性能显著降低的工程菌株,该菌株在保留高效合成赤藓糖醇性能的同时,显著降低了泡沫的产生。【结论】所获得的菌株对工业发酵合成赤藓糖醇具有较为重要的意义,也为控制其他微生物发酵过程中泡沫的生成提供了思路。     

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因．以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B．anthracis AP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌．然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行了系统的鉴定．最终建立了Cre-LoxP系统在B．anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因.     

酵母PMT1和TED1基因在细胞壁应激反应中的作用

实验室前期研究表明,蛋白质O-甘露糖转移酶1 (Protein O-mannosyltransferase 1,Pmt1p) 和Ted1p（Traffcking of Emp24p/Erv25p-dependent cargo disrupted）在细胞寿命和内质网应激反应方面存在相互调控关系。进一步研究酵母Pmt1p和Ted1p在细胞壁应激反应中（诱导剂为荧光增白剂或刚果红）的作用。观察PMT1基因缺失（pmt1Δ）酵母菌株和TED1基因缺失（ted1Δ）酵母菌株,以及PMT1和TED1双基因缺失（pmt1Δ ted1Δ）酵母菌株在细胞壁应激反应条件下的克隆形成能力和细胞分裂增殖活性;qRT-PCR检测细胞壁应激反应通路中Slt2p、Ssd1p和Mpt5p等效应蛋白的转录水平。结果表明,在细胞壁应激反应条件下,与对照菌株的生长状态比较,pmt1Δ菌株生长缓慢,ted1Δ菌株生长较快;进一步缺失PMT1基因使得ted1Δ菌株生长缓慢。与对照菌株中效应蛋白的转录水平比较,pmt1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株中SLT2、SSD1和MPT5基因的转录水平明显上调,ted1Δ菌株中的无明显变化;与pmt1Δ菌株比较,pmt1Δted1Δ菌株中SLT2和MPT5表达明显下调,SSD1表达无明显变化。缺失TED1基因增强酵母细胞对细胞壁应激反应的抵抗性;进一步缺失PMT1基因增强ted1Δ菌株对应激反应的敏感性,上调细胞壁应激反应通路中效应蛋白的转录表达水平。     

解脂耶氏酵母TSR1基因的定点诱变

对解脂耶氏酵母与蛋白质分泌有关的TSR1基因进行寡核苷酸介导的定点诱变,限制性内切酶切割的拼接,得到了该基因的一系列缺失突变体。这为进一步研究TSR1基因不同结构域的功能奠定了基础。     

苏云金芽孢杆菌(Bt)晶体毒蛋白基因在烟草叶绿体中的表达

将全长３．５ｋｂ的Ｂｔ基因３’端缺失,得到长为２．１ｋｂ、１．８ｋｂ的基因。分别将这３个长度（１．８ｋｂ、２．１ｋｂ、３．５ｋｂ）的基因置于水稻叶绿体ｐｓｂＡ基因的启动子和终止子调控之下,并与选择标记基因ａａｄＡ（编码氨基糖苷－３’－腺苷酸转移酶,具壮观霉素抗性）表达盒相连;以烟草叶绿体基因ｔｒｎＨ－ｐｓｂＡ－ｔｒｎＫ为同源片段,构建成叶绿体转化载体ｐＢＴ３、ｐＢＴ８和ｐＢＴ２２。用基因枪把Ｂｔ基     

拟诺卡氏菌16S rRNA,gyrB,sod和rpoB基因的系统发育分析

为了更好地了解拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)各物种间的系统发育关系,该属现有有效描述种的gyrB,sod和rpoB基因的部分序列被测定,结合16S rRNA基因,对拟诺卡氏菌属进行了系统发育重建。研究发现拟诺卡氏菌属gyrB,sod和rpoB基因的平均相似性分别为87.7%、87.3%和94.1%,而16S rRNA基因的平均相似性则达到96.65%,3个看家基因均比16S rRNA具有更高的分歧度。比较基于不同基因的系统树发现,由gyrB基因得到的系统树拓扑结构与16S rRNA得到的结构在亚群上基本一致。因此,gyrB基因在拟诺卡氏菌属的系统分类上比16S rRNA基因更具优越性。     

黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究*

从黑曲霉N25(A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1.4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体(命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母。经G418抗性筛选、酶活性测定、Southern印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP-NP-1(23869.4u/ml)、PP-NP-2(20533.0u/ml)、PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活(513.4u/ml)的46.46倍、39.99倍和69.46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。     

里氏木霉α-半乳糖苷酶基因agl2在毕氏酵母中高效表达

通过反转录PCR从里氏木霉RutC-30 基因中克隆到α-半乳糖苷酶基因agl2,将其构建到具有AOX1强启动子的表达载体pPIC9K中,线性化后转化到毕氏酵母GS115中进行表达。结果表明agl2基因在毕氏酵母GS115中得到了高效表达,在50 L发酵罐中高密度发酵168 h,酶活达最高值1 106 U/mL。经PCR产物鉴定,结果表明agl2基因已整合到毕氏酵母GS115基因组中。     

Bt叶绿体转基因植株的抗虫性及后代表型分析

将Ｂｔ ＣｒｙＩＡ（ｃ） 基因与水稻（ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） 叶绿体ｐｓｂＡ 基因的启动子和终止子构建成表达盒,连同烟草（ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ Ｌ．） 叶绿体基因组同源片段ｒｐｌ２＿ｔｒｎＨ＿ｐｓｂＡ和ｔｒｎＫ＿ＯＲＦ５０９Ａ 以及选择标记基因ａａｄＡ一起构建成烟草叶绿体转化载体ｐＴＲＳ８。基因枪法转化烟草叶片,经壮观霉素筛选获得转化再生植株。有些转基因植株对３龄棉铃虫（ Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ） 具有较强的毒杀作用,并能显著抑制昆虫蜕皮和生长发育。对高抗虫性植株的子一代（Ｔ１） 和子二代（Ｔ２） 进行的遗传学和分子生物学分析表明,Ｂｔ 基因已稳定地遗传给子代叶绿体,且抗生素抗性遗传遵循非孟德尔的母系遗传规律