侵染万寿菊的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析

应用ELISA的方法检测到感染了黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的万寿菊。根据已报道的CMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列设计并合成引物,提取万寿菊叶片总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,得到约875bp的片断,与预期片断大小相符。序列分析显示:该分离物CMV-WSJ CP基因全长657bp,编码218个氨基酸,其核苷酸和氨基酸序列与CMV亚组Ⅱ的分离物有很高的同源率,分别达到98.33%～99.24%和98.63%～100%;与CMV亚组I分离物的同源率分别仅为74.43%～76.26%和77.17%～78.99%。因此,从万寿菊叶片上检测出的黄瓜花叶病毒分离物CMV-WSJ应归属于亚组Ⅱ。     

CMV甜瓜分离物外壳蛋白基因的克隆及植物表达载体的构建

从河南省临颖县采集的病毒感染的甜瓜样本经ELISA检测和接种分离获得黄瓜花叶病毒(Cucunbermosaicvirus,CMV)分离物。把该分离物接种西葫芦,从发病的叶片中提取总RNA,并以此为模板经RTPCR扩增获得CMV的外壳蛋白(cp)基因,将其克隆到pUCmT质粒上。经序列测定和分析,结果表明该cp基因由657个核苷酸组成,编码218个氨基酸。其核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组I的分离物有较高的同源性,达92.2%～93.9%,与亚组II的同源性仅为76.8%～77.8%,与我国报道的CMV分离物的cp基因序列比较,除香蕉株系XB外核苷酸序列的同源性达91.8%～93.4%。根据这些分析,该CMV分离物属于亚组I。将cp基因通过中间载体pJIT163定向克隆到植物表达载体pBINPLUS中(重组双元载体质粒命名为pBCP),并经冻融法导入农杆菌中,经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入。利用该植物表达载体对西瓜的遗传转化工作目前正在进行中。     

CMV甜瓜分离物外壳蛋白基因的克隆及植物表达载体的构建

从河南省临颖县采集的病毒感染的甜瓜样本经ELISA检测和接种分离获得黄瓜花叶病毒(Cucunber mosaic virus ,CMV) 分离物.把该分离物接种西葫芦, 从发病的叶片中提取总RNA,并以此为模板经RT-PCR扩增获得CMV的外壳蛋白(cp)基因,将其克隆到pUCm-T质粒上.经序列测定和分析,结果表明该cp基因由657个核苷酸组成,编码218个氨基酸.其核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组I的分离物有较高的同源性,达92.2%～93.9%,与亚组II的同源性仅为76.8%～77.8%,与我国报道的CMV分离物的cp基因序列比较,除香蕉株系XB外核苷酸序列的同源性达91.8%～93.4%.根据这些分析,该CMV分离物属于亚组I.将cp基因通过中间载体pJIT163定向克隆到植物表达载体pBINPLUS中(重组双元载体质粒命名为pBCP),并经冻融法导入农杆菌中,经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入.利用该植物表达载体对西瓜的遗传转化工作目前正在进行中.     

药用植物柴胡病毒病病原物的分子鉴定

利用非序列依赖性扩增(Sequence-independent amplification,SIA)方法对所采柴胡病样进行分子鉴定。序列测定及分析发现,伴有花叶症状的柴胡受到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)的复合侵染。为明确柴胡CMV分离物(CMV-SXCH)和柴胡BBWV2分离物(BBWV2-CH)的分类地位,进一步克隆CMV-SXCH的CP、MP和BBWV2-CH的LCP、SCP;序列比对发现,CMV-SXCH与CMV亚组ⅠB中株系XJ2相似性最高,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.1%、99.5%;BBWV2-CH与BBWV2中的K株系相似性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.4%、99.2%。系统进化树分析表明,CMV-SXCH与大多数CMV中国分离物聚类为一簇,同属于CMV亚组ⅠB;BBWV2-CH与BBWV2韩国K株系聚类为一簇,亲缘关系最近。     

侵染辣椒的黄瓜花叶病毒CP基因的序列分析、原核表达及抗血清制备

从吉林长春感病辣椒上获得一黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)分离物(CMV-CC),根据GenBank中已登录的CMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因核苷酸序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法克隆到了长度为657 bp的目的片段。序列分析表明,CMV-CC与CMVI组各分离物核苷酸同源性为93.2%-97.9%。根据完整CP基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:38个CMV分离物可分为3个组,CMV-CC属于CMV的IB亚组。将CMV-CC CP基因与原核表达载体pET-22b(+)连接,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达出分子量约27 kD的融合蛋白。表达的融合蛋白经树脂纯化后免疫家兔制备了抗血清。用间接ELISA测定抗血清效价为1/4 096。Western blotting分析表明制备的抗血清对CP有高度特异性,为准确、快速地检测CMV奠定了基础。     

侵染花生的黄瓜花叶病毒CA株核酸全序列分析

对侵染花生的黄瓜花叶病毒CA(CMV-CA)株系进行克隆和序列分析.CMV-CA RNA1全长3 356个核苷酸(nt),编码分子量为111kDa 的1a 蛋白;RNA2全长3045nt,编码分子量为96.7kDa 的2a蛋白和13.1kDa的2b蛋白;RNA3全长2219nt,编码分子量为30.5kDa的3a蛋白和分子量为24kDa的外壳蛋白(CP).序列同源性比较表明,CMV-CA RNA1、2、3与CMV亚组IA CMV-Fny、亚组IB CMV-SD、亚组II CMV-Q 株系序列同源性,RNA1分别为91.3%、91.1%和76.5%,RNA2分别为92.1%、90%和71.2%,RNA3分别为96.1%、92.6%和74.5%;与同属花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV) RNA1、2、3序列同源性分别为67.1%、58.2%和55.7%.上述研究未发现CMV-CA基因组与PSV RNA链的重组,CMV-CA对花生的侵染应是该株系适应于花生的遗传变异、长期进化的结果;对RNA3 5′NTR结构分析以及RNA3 5′NTR和 CP 系统进化树分析表明,CMV-CA属CMV IB亚组.     

豇豆病毒病病原的分子鉴定

为澄清浙江省豇豆病毒病病原及其分类,采用马铃薯Y病毒属通用引物Sprimer扩增了浙江豇豆线状病毒基因组3′－末端序列。同时又根据已知CMV RNA3序列设计引物pCMV-44-63/1200-1181,扩增了混合的CMV－ZJ运动蛋白基因全序列。外壳蛋白氨基酸序列分析表明,产中仅存在一种线状病毒（CV－ZJ）,该病毒与一泰国豇豆蚜传花叶病毒（CABMV）具有最高的同源性（98.6%）,与花生条纹病毒（PStV）、石斛花叶病毒（DeMV0．）、赤豆花叶病毒（AZMV）、黑眼豆豆花叶病毒（BICMV）和菜豆普通花叶病毒（BCMV）分离物间的同源性为88.5%－94.4%,而与其它CABMV分离物的同源性均低于70％。进化树分析表明,PStV、AZMV、DeMV、BlCMV和BCMV为同种异名,应统称为BCMV,而CABMV为另一种病毒;CV－ZJ和泰国CABMV分离物应分类为BCMV豇豆株系。CMV－ZJ的运动蛋白序列分析表明,该分离物属于CMV亚组Ⅰ,与其它分离物氨基酸序列同源性为93.1%－97.8%。     

侵染花生的黄瓜花叶病毒CA株核酸全序列分析

对侵染花生的黄瓜花叶病毒CA(CMVCA)株系进行克隆和序列分析。CMVCARNA1全长3356个核苷酸(nt),编码分子量为111kDa的1a蛋白;RNA2全长3045nt,编码分子量为96.7kDa的2a蛋白和13.1kDa的2b蛋白;RNA3全长2219nt,编码分子量为30.5kDa的3a蛋白和分子量为24kDa的外壳蛋白(CP)。序列同源性比较表明,CMVCARNA1、2、3与CMV亚组IACMVFny、亚组IBCMVSD、亚组IICMVQ株系序列同源性,RNA1分别为91.3%、91.1%和76.5%,RNA2分别为92.1%、90%和71.2%,RNA3分别为96.1%、92.6%和74.5%;与同属花生矮化病毒(Peanutstuntvirus,PSV)RNA1、2、3序列同源性分别为67.1%、58.2%和55.7%。上述研究未发现CMVCA基因组与PSVRNA链的重组,CMVCA对花生的侵染应是该株系适应于花生的遗传变异、长期进化的结果;对RNA35′NTR结构分析以及RNA35′NTR和CP系统进化树分析表明,CMVCA属CMVIB亚组。     

广西黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）黄瓜分离物的RT—PCR检测及CP基因序列分析

利用黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber Green Mottle Mosaic Virus,CGMMV）的特异性引物对来自广西一温室栽培的黄瓜病样进行RT—PCR检测,结果扩增得到了与预期大小相符的目的片段（650bp）。序列分析表明,该目的片段包含有CGMMV完整的CP基因序列、部分运动蛋白基因（MP）及3’端非编码区（3＇-UTR）序列,其中CP基因全长486bp,与已报道的CP基因序列同源性为91．2％～99．4％。经系统发育分析,明确该GX-CS分离物与日本、法国、印度等分离物属于CGMMV同一类群,并推测该分离物与广西的葫芦（GX—BG）分离物具有相同的起源关系。     

侵染新疆甜瓜的黄瓜花叶病毒衣壳蛋白的克隆及其序列分析

利用同源克隆的方法,扩增获得了新疆16个地区CMV病毒分离物CP蛋白基因全长序列,16个地区CMV病毒分离物CP蛋白基因全长约1 100 bp,最大开放阅读框介于630~690 bp,编码约210个氨基酸,蛋白质大小约25 k D。序列比对发现16个地区CMV病毒核酸序列的3'末端非编码区保守性较低,编码区及其5'端序列保守性较高,氨基酸序列的两端均存在不同数量的变异位点,根据CMV病毒同源性比对结果,16个地区病毒均属于同一CMV亚组。通过核酸序列构建的分子进化树分析发现,本研究分离获得的新疆16个地区CMV病毒衣壳蛋白基因序列则存在较高同源性且不同地区病毒分离物间相对遗传距离差异较小,16个地区与国内外15个地区病毒分离物相比均存在较大差异,统计分析显示,新疆CMV分离物组内核酸序列相对遗传距离差异不显著,相比参考序列,其差异则极显著,这一结果与聚类分析结果能够得到相互印证。分析认为,不同地区CMV病毒CP蛋白基因虽然与外来地区病毒基因存在较大差异,但由于本研究分离的新疆16个地区CMV病毒衣壳蛋白基因序列存在较高同源性且病毒因受不同理化条件的影响往往存在不同程度的变异率,因此认为,分离获得的新疆16个地区CMV病毒可能受地理位置、气候等因素的影响,其基因组中存在异于其他地区不同程度的变异趋势与类型,导致相应蛋白质稳定性也随之发生变化,从而更好的适应在新疆甜瓜植株上的侵染和定殖。     

从云南烟草上检测到的黄瓜花叶病毒亚组Ⅱ分离物*

在对云南省烟草病毒病的研究中,分离到一种直径约２６￣３０ｎｍ的球形病毒。提纯病毒进行的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ发现一条５５ｋＤ蛋白带。５５ｋＤ蛋白Ｎ－端１０个氨基酸与ＣＭＶ亚组Ⅱ的Ｑ株系外壳蛋白Ｎ－氨基酸同源性为１００％。以ＣＭＶ－Ｑ抗血清对５５ｋＤ蛋白进行了Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测,发现５５ｋＤ蛋白与ＣＭＶ Ｑ株系抗血清有血清学反应。根据已报道的ＣＭＶ亚组Ⅱ外壳蛋白基因序列合成引物,采用ＲＴ－ＰＣＲ     

杏褪绿卷叶植原体新疆分离物核糖体蛋白基因的克隆与序列分析

【目的】了解杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的系统发育关系及遗传分化,确定其分类地位。【方法】利用植原体核糖体蛋白(rp)基因的特异性引物rpF1/rpR1对新疆轮台县托克逊县杏褪绿卷叶病植株总DNA进行PCR扩增,并对部分扩增片段克隆、测序及序列分析。【结果】获得杏褪绿卷叶植原体新疆分离物rp基因片段大小为1196 bp,该片段包含部分rpS19以及rpL22和rpS3基因的全部序列。序列相似性和系统进化分析表明,杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与16SrⅤ-rp亚组中的各代表性植原体的rp基因核苷酸序列相似性达到95.7%~99.3%,其中与rpⅤ-C亚组的甜樱桃绿化植原体和枣疯病植原体的相似性最高,核苷酸及氨基酸相似性分别达到99.2%~99.3%和98.3%~98.4%。进一步虚拟RFLP分析,发现杏褪绿卷叶植原新疆分离物rp基因的酶切图谱与rpⅤ-C亚组成员相似性最高,但在MseⅠ、SspⅠ和TaqⅠ的酶切位点上存在差异。综上初步判断其可能属于16SrⅤ组(榆树黄化组)中的一个新rp亚组。【结论】本研究首次报道了杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的rp基因序列,确定了其分类地位,为杏褪绿卷叶病的早期诊断和检测提供了基础。     

Characterization, Genetic Diversity, and Evolutionary Link of Cucumber mosaic virus Strain New Delhi from India

The genome of Cucumber mosaic virus New Delhi strain (CMV-ND) from India, obtained from tomato, was completely sequenced and compared with full genome sequences of 14 known CMV strains from subgroups I and II, for their genetic diversity. Sequence analysis suggests CMV-ND shares maximum sequence identity at the nucleotide level with a CMV strain from Taiwan. Among all 15 strains of CMV, the encoded protein 2b is least conserved, whereas the coat protein (CP) is most conserved. Sequence identity values and phylogram results indicate that CMV-ND belongs to subgroup I. Based on the recombination detection program result, it appears that CMV is prone to recombination, and different RNA components of CMV-ND have evolved differently. Recombinational analysis of all 15 CMV strains detected maximum recombination breakpoints in RNA2; CP showed the least recombination sites.     

Sequencing of Coat Protein Gene of an isolate of Cucumber mosaic virus Infecting Black Pepper (Piper nigrum L) in India

The coat protein gene of an isolate of Cucumber mosaic virus (CMV) associated with stunted disease affecting black pepper plant was cloned and sequenced. The coat protein gene comprised of 657 nucleotides encoding a protein of 218 amino acids. Sequence analysis showed that the gene was most closely related to CMV infecting Egyptian henbane plant in India, the member of subgroup I of CMV. The amino acid sequence identity with members of subgroup I was 92-99% while that with members of subgroup II was 77–79%. On the basis of sequence homology, it is concluded that CMV infecting black pepper in India is a strain of CMV belonging to subgroup I.     

香蕉束顶病毒基因克隆和序列分析

对香蕉束顶病毒（ＢＢＴＶ）中国分离株ＤＮＡ组份Ｉ（ＤＮＡ－１）、外壳蛋白（ＣＰ）和运转蛋白（ＭＰ）基因进行了克隆和序列分析。ＢＢＴＶＤＮＡ－１含有１１０３个核苷酸,与南太平洋和亚洲分离株分别有８７％－８８％ ９６．９－９８％的核苷酸序列同源性。由ＤＮＡ－１编码的复制酶含有１８６个在酸残基。与南太平洋和亚洲分离株分别有８４．４％－９５．８％和９７．６％、９８．０％的氨基酸序列同源性。外壳蛋白基因由５     

First Report of Cucumber mosaic virus Infecting Chinese Mallow in China

The virus in naturally infected, stunted Chinese mallow plants and mosaic leaves was identified as Cucumber mosaic virus (CMV). Six symptomatic plants and one symptomless plant were collected in Chongqing, China. DAS‐ELISA suggested CMV was likely associated with the diseased Chinese mallow. Double‐stranded RNA was extracted from the samples, analysed by RT‐PCR, and the coding sequences of their coat proteins (CPs) were sequenced. The results further confirmed CMV was the pathogen causing Chinese mallow stunted, mosaic disease. The isolate was named CMV‐DXC. The full sequence of CMV‐DXC CP was determined, and it had the highest nucleotide identity (99.4%) of those of CMV‐lily, CMV‐WSJ and CMV‐Hnt, respectively. Phylogenetic analysis shows that CMV‐DXC belongs to CMV subgroup II. To our knowledge, this is the first report of CMV infecting Chinese mallow in China.     

韭葱黄条病毒、洋葱黄矮病毒和胡葱黄条病毒六安分离物CP基因克隆及同源性分析

设计特异性引物PCR扩增了六安大蒜病样中的韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV)、洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)和胡葱黄条病毒(Shallot yellow stripe virus,SYSV)的全长CP基因,插入到pGEM-T载体并测序。分别比较3种病毒CP基因种内变异性和种间亲缘关系。结果表明LYSV六安分离物CP基因由864个碱基组成,与Genbank上已报道的68个LYSV不同分离物CP基因的核苷酸序列同源性为76.12%～84.31%;OYDV的CP基因由771个碱基组成,与Genbank上已报道的86个OYDV不同分离物同源性为81.06%～90.40%;SYSV的CP基因由774个碱基组成,与Genbank上已报道的11个SYSV不同分离物CP基因同源性为88.63%～94.32%;从分析结果来看,LYSV的CP基因不同分离物之间变异性较大,OYDV CP变异性不大,SYSV变异性很小;3种病毒都有1个以上的宿主,病毒种内不同宿主分离物之间CP序列差异很小。进化分析显示OYDV和SYSV的CP基因亲缘性较近并成簇,LYSV的CP基因与OYDV和LYSV的CP基因亲缘性较远。