应用小鼠杂交瘤细胞检测支原体

一般支原体都有胸苷磷酸化酶,此酶可将胸苷（Thd）分解为胸腺嘧啶（Thy）和戊糖-1-磷酸酯。培养于HAT培养液的小鼠杂交瘤细胞,利用Thd合成DNA而生长;当HAT培养液中的Thd被支原体的胸苷磷酸化酶分解为Thy后,杂交瘤细胞因不能利用Thy合成DNA而死亡。可根据HAT培养液中杂交瘤细胞的死亡与否来推断检测样品“有”、“无”产胸苷磷酸化酶的支原体存在。     

链霉菌YIM 245次生代谢产物的研究

利用多种柱色谱层析方法从来自非洲特有动物之一长颈鹿(Giraffa camelopardalisc)的粪便链霉菌YIM245的发酵产物中分离得到7个化合物,通过理化性质及波谱数据分析,分别鉴定为2'-脱氧胞嘧啶核苷(1)、2’-脱氧胸苷(2)、2’-脱氧尿苷(3)、2’-脱氧腺苷(4)、菜油甾醇(5)、大豆素(6)和邻氨基苯甲酸(7)。应用96孔板法测定了化合物对5种病原指示菌的最低抑制浓度(MIC),结果表明该7个化合物均显示较弱的抗菌活性。     

整细胞酶促合成抗HIV新药 D-D4FC

D-D4FC(β-D-2′,3′-双脱氢双脱氧-5-氟胞嘧啶核苷)是一种新型抗HIV病毒的核苷类药物,目前正在美国、法国和德国进行Ⅱ期临床。利用乳酸杆菌提取的粗制N-脱氧核糖转移酶实现了由D4T(β-D-2′,3′-双脱氢双脱氧-胸苷,司他夫定)和5-FC(5-氟胞嘧啶)合成D-D4FC,转化率达到25%。现在,发现利用乳酸杆菌整细胞也可实现此反应,其转化率经过12.5h可达到50%,更有利于可能的工业化连续生产。研究了整细胞催化合成D-D4FC反应中,pH值、缓冲液类型、底物浓度、加菌量、反应时间等条件的影响并进行了优化,探讨了反应中乳酸杆菌整细胞催化的可能机理。     

产气肠杆菌菌体内核苷磷酸化酶的诱导表达

目的:阿糖腺苷(Ara-A)是一种广谱抗病毒药物,临床上用于治疗多种病毒性疾病.同时也是合成阿糖腺苷单磷酸(Ara-AMP)的重要原料.本课题旨在寻找一种高效酶法生产嘌呤类阿糖核苷的方法.方法:以产气肠杆菌完整细胞为酶源,研究产气肠杆菌菌体培养条件对核苷磷酸化酶的影响及其诱导性.结果:胸苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶均可被多种核苷、核苷酸甚至碱基诱导.胞苷或胞苷酸的添加量为15-20mmol/L,诱导时间在0-8小时均可.经胞苷和胞苷酸诱导的菌体可使酶反应时间缩短6倍,大大提高了反应效率.经诱导的菌体,在反应后仍保持较高的核苷磷酸化酶活力;而未经诱导的菌体,一次反应后即丧失大量的酶活力.结论:核苷磷酸化酶的活性可以通过诱导而提高,以此优化阿糖腺苷的生产.     

聚酰胺色谱结合高速逆流色谱分离制备萹蓄黄酮类化合物

采用聚酰胺色谱结合高速逆流色谱法分离纯化了萹蓄中3种黄酮类化合物,建立了快速分离制备萹蓄中3种黄酮类化合物的方法。通过聚酰胺柱色谱富集黄酮类成分,再经过高速逆流色谱分离,以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(体积比为4∶1∶5∶0.1)组成的二相系统作为固定相与流动相,在主机转速为850 rpm,流速为2.0m L/min,检测波长为254 nm的条件下制备样品。从150 mg富集黄酮成分的馏分中,一次性分离制备得到纯度为94.86%的杨梅树皮苷(myricitrin)7.5 mg,94.28%的黄芪苷(astragalin)13.8 mg,91.86%的合欢草素1(desmanthin-1)20.6 mg。所得馏分经高效液相色谱法(HPLC)检测纯度,并经MS和NMR鉴定化合物的结构。该方法简便、快速,所得产物纯度高,适合于黄酮类化合物的制备分离。     

代谢工程方法改造大肠杆菌生产胸苷

胸苷是抗艾滋病药物司他夫定(3′-脱氧-2′,3′-双脱氢胸苷)和叠氮胸苷的重要前体物质。应用代谢工程方法对大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)生物合成胸苷进行了研究。通过敲除E.coli BL21嘧啶回补途径的deo A、tdk和udp三个基因,BS03工程菌株能够积累21.6 mg/L胸苷。为了增加合成胸苷前体物核糖-5-磷酸和NADPH的供给,进一步敲除pgi和pyr L使工程菌BS05胸苷的产量提高到90.5 mg/L。而通过过表达胸苷合成途径的ush A、thy A、dut、ndk、nrd A和nrd B六个基因,菌株BS08胸苷的产量能达到272 mg/L。通过分批补料发酵,BS08最终可以积累1 248.8 mg/L的胸苷。本研究结果表明经过代谢工程改造的E.coli BL21具有良好的胸苷合成能力和应用潜力。     

应用乙酰短杆菌酶法合成2''''-脱氧腺苷

胸苷和腺嘌呤在乙酰短杆菌作用下转化成胸腺嘧啶和目标产物2’-脱氧腺苷。50mL的三角瓶装液10mL,40mmol/L的底物,50mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH7)进行反应,5%游离乙酰短杆菌在55℃下,经1h转化率就可达到65.6%。     

快速制备液相色谱分离库拉索芦荟中10-羟基芦荟大黄素苷(英文)

采用快速制备液相色谱从库拉索芦荟中高效分离制备10-羟基芦荟大黄素苷A和B。以库拉索芦荟药材粉甲醇提取物为原料,采用快速制备液相色谱,EYELA柱(300 mm×20 mm i.d.,20~45μm),甲醇-水为流动相(35∶65,v/v)等度洗脱,流速10 mL/min,检测波长356 nm,对芦荟样品进行分离制备,得到2种化合物单体,经UV、旋光度、HRMS和NMR鉴定,HPLC测定纯度,2个化合物分别为10-羟基芦荟大黄素苷B(98.9%)和10-羟基芦荟大黄素苷A(98.2%)。该方法简便、快速,所得产物纯度较高,可用于对照品的制备和药理毒理活性研究。     

高效液相色谱法在脱氧核糖核酸酶解动力学

为了更好地对脱氧核糖核酸酶解动力学过程进行研究,建立脱氧核糖核酸(DNA)酶解液中4种脱氧核苷酸(腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)、胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP))的高效液相测定方法,能将酶解液中4种脱氧核苷酸完全分离并准确定量.在此基础上,对DNA酶解的动力学进行初步研究,其反应机理为不存在底物和产物抑制的双底物顺序反应,动力学方程为x=1/bln(1+abt)(其中a=0.372 3ρ0-0.974;b=-0.049 3ρ20+1.115 3ρ0 - 1.110 3),该方程可以很好地描述DNA酶解过程,误差仅为3.31%.     

嗜麦芽黄单胞菌游离细胞催化合成α-熊果苷

研究了利用嗜麦芽黄单胞菌BT-112(Xanthomonas maltophilia BT-112)游离细胞生物催化合成α-熊果苷,系统探讨了温度、对苯二酚浓度、对苯二酚与蔗糖摩尔比、反应时间、转速、细胞浓度、磷酸缓冲溶液pH值和浓度对反应转化率的影响。最佳反应条件为:反应温度为25℃,菌体对对苯二酚的最大耐受度为30mmol/L,蔗糖和对苯二酚的摩尔比为20∶1,反应时间为45h,摇床转速为160r/min,细胞浓度为85g/L,磷酸缓冲溶液浓度为25mmol/L、pH值为8.0。在此条件下α-熊果苷转化率高达86.7%(以对苯二酚计算)。     

碳源对K.fragilis LFS-8611β-D-半乳糖苷酶合成的影响

探讨了碳源对脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)LFS-8611生长、β-D-半乳糖苷酶合成的影响及碳源对该酶合成的诱导作用。脆壁克鲁维酵母(K,fragilis)LFS-8611生长与β-D-半乳糖苷酶合成同步。该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖,乳糖次之。菌体生物量和酶活力随着培养基中乳糖浓度的增加而增加,乳糖浓度为12mg／mL,菌体生物量和酶活力达到峰值,分别为5．84g／L、19,12U／mL。半乳糖和乳糖对β-D-半乳糖苷酶合成具有诱导作用。诱导物浓度对β-D-半乳糖苷酶的诱导合成有较大影响。半乳糖诱导以山梨醇为碳源预培养的K．fragilis LFS-8611细胞合成β-D-半乳糖苷酶的最适浓度为10mg／mL。     

球孢白僵菌固定化生物转化合成D-HPPA

[目的]利用球孢白僵菌进行固定化生物转化,将底物R-(+)-2-苯氧基丙酸(D-PPA)转化合成产物R-(+)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸(D-HPPA)。[方法]利用海藻酸钠和聚乙烯醇对球孢白僵菌进行包埋处理,并对包埋条件进行累积优化。[结果]4%海藻酸钠和4. 5%聚乙烯醇混合后,再加入2. 5%的氯化钙作为交联剂交联8 h。在此包埋条件下制备的白僵菌凝胶珠,置于30 g/L的D-PPA进行固定化生物转化。反应5 d后,产物浓度最终为29. 9 g/L,平均生产强度为5. 98 g/(L·d),底物转化率为99. 7%。[结论]海藻酸钠和聚乙烯醇可用于白僵菌的固定化,且较游离菌体的生物转化的反应周期缩短28. 6%,平均生产强度增加64. 7%,底物转化率提高17. 7%。     

高效液相色谱法同时测定楠竹叶提取物中的4种黄酮

采用高效液相色谱法同时测定楠竹叶提取物中的4种主要黄酮成分：荭草苷、牡荆苷、牡荆苷-4′-O-葡萄糖苷、牡荆苷-2′-O-鼠李糖苷。通过实验,得到了同时测定4种主要黄酮成分的最佳条件。采用Kromasil-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm,Akzol Nobel,Sweden)进行测定,最佳检测条件为：以四氢呋喃∶乙腈∶甲醇∶0.5%醋酸水溶液=10.3∶1∶0.7∶88为色谱流动相等度洗脱;检测波长360 nm;柱温25℃,流速：1.0 mL·min^-1。荭草苷、牡荆苷、牡荆苷-4′-O-葡萄糖苷和牡荆苷-2′-O-鼠李糖苷的平均回收率分别为98.5%、98.1%、99.1%和98.7%,相对标准偏差分别为0.8%、0.7%、0.8%和0.6%(n=5)。该方法分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高、重复性好,可用于楠竹叶成分的检测分析。     

变铅青链霉菌体内游离胞嘧啶的发现及检测

【背景】胞嘧啶(cytosine,C)是核酸分子4种基本碱基之一。胞嘧啶首先是以胞苷三磷酸 (cytosine triphosphate,CTP)的形式合成,在核酸基础代谢中没有形成游离胞嘧啶的特定途径。杀稻瘟菌素(blasticidin S,BS)和谷氏菌素生物合成途径均以游离的胞嘧啶为前体,前者的生物合成基因簇中包含一个能水解胞苷单磷酸(cytidine monophosphate,CMP)生成胞嘧啶的水解酶BlsM,后者的生物合成基因簇及其产生菌的基因组中均没有这个水解酶对应的同源蛋白。【目的】检测不同细菌中是否普遍存在游离的胞嘧啶,探究是否存在能产生游离胞嘧啶的同工酶或新途径。【方法】在BS异源表达菌株Streptomyces lividans WJ2中敲除blsM,高效液相色谱(HPLC)检测突变株和WJ2发酵产物;液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测10个经过分级纯化的微生物细胞裂解液上清中是否存在游离的胞嘧啶。【结果】突变株WJ2?blsM菌株仍能合成杀稻瘟菌素,但各组分产量与WJ2菌株相比均明显降低;除了变铅青链霉菌,在10株被检测的菌株中,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)也检测到了含量较高的游离胞嘧啶。【结论】WJ2?blsM菌株仍具有产生BS的能力,说明野生型Streptomyces lividans菌株内存在一种未曾发现的游离胞嘧啶的产生方式,可以满足次级代谢的需求。另外,不同微生物中游离胞嘧啶的含量不同。     

5—氟尿苷的微生物转化

5 氟尿苷 (简称ＦＵＲ)是抗肿瘤核苷药物脱氧氟尿苷 (Ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ ,简称ＤＦＵＲ)的合成中间体。脱氧氟尿苷是一种抗代谢类抗肿瘤药 ,在体内可以部分转化为氟尿嘧啶 (简称ＦＵ) ,二者具有相似的作用途径和抗肿瘤谱。与ＦＵ相比 ,由于ＤＦＵＲ的抗肿瘤活性高且毒副反应小 ,主要用于治疗晚期结直肠癌和各种类型肝癌。在国内 ,采用化学法合成的ＤＦＵＲ业已进入临床研究阶段[1]采用化学合成法生产ＤＦＵＲ时 ,由于反应过程中需将碱基或核糖残基的部分基团进行保护 ,而且产物为多种核苷异构体和其它副产品的混合物 ,需要进一步分离 ,…     

产气肠杆菌EAM-Z1尿苷磷酸化酶的分离纯化及性质研究

从产气肠杆菌 (Enterobacteraerogenes)突变株EAM Z1中分离出一种具有较高转移酶活性的尿苷磷酸化酶 (UPase)。经测定这种Upase的分子量为 1 2 .8× 1 0 4,亚基分子量为 4 .3×1 0 4,由 3个同型亚基组成。N端氨基酸序列为 :MRMVDLIATKRDGGE。等电点为 4 .46。对尿苷的Km为 0 .2 9mmol L。酶反应的最适pH为 7.8,最适温度为 50℃。该酶能磷酸化尿苷、胸苷、5 氟尿苷、2′ 脱氧 5 氟尿苷及尿嘧啶 β D 阿拉伯呋喃糖 ,且具有较高的转移酶活性 ,能将尿苷和 5 氟尿嘧啶转化成 5 氟尿苷 (一种抗癌药物的中间体 ) ,其转化率为 47%。该酶的这些特性对于酶法合成核苷类抗肿瘤药物和抗病毒药物是十分有用的。     

胸腺嘧啶新的生物合成路径

胸腺嘧啶是由胸苷酸合成酶合成的,这种酶催化“2’-脱氧尿苷-5＇-单磷酸盐”的尿嘧啶部分的甲基化。传统的胸苷酸合成酶,包括人体的这种酶,利用1个活性点氨基酸侧链在该反应的这一阶段激发基质。     

质粒DNA超螺旋构象的激光喇曼光谱研究

将pBR322重组质粒DNA纯化,经琼脂糖凝胶电泳鉴定其主要具共价闭合环状空间构象。对此制备物进行激光喇曼散射光谱分析,发现在表征其二级结构为B型的特征模之外,还有另外二个表征磷酸脱氧核糖主链骨架振动状态的特征模854和1083cm~(-1)。本文对此进行探讨,认为这二个特征模与闭合环状DNA分子的超螺旋状态有关,可作为质粒DNA三级结构的特征模。碱基堆积状态分析表明,超螺旋的存在使分子中脱氧胸苷的堆积反应活性增强,并使AT碱基间Hoogsteen型氢键有相当数量的破坏,导致反映脱氧胸苷参与氢键组成的二个基团振动状态的特征模1378cm~(-1)产生相对于线性DNA分子的明显减色及脱氧胸苷羰基双键振动模向高波数偏移。     

生物催化法合成6-氰基-（3R，5R）-二羟基己酸叔丁酯

利用E.coli BL21／pCDFDuet-gdh—cr-X共表达全细胞催化6-氰基-（5R）-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原合成6-氰基-（3R,5R）-二羟基已酸叔丁酯。结果表明：在菌体用量4．85g/L、葡萄糖与底物质量浓度比为1：1、温度28℃、pH7．0条件下,80．0g／L6-氰基-（5R）-羟基-3-羰基己酸叔丁酯生物还原2h后,底物转化率可达99．0％,产物d.e．值大于99．5％。在考察范围内,NADP^＋用量对催化效率无显著作用。     

非水溶剂中Rhizopus arrhizus脂肪酶催化合成三种酯的最佳条件(英文)

以少根根霉 (Rhizopusarrhizus)脂肪酶为催化剂 ,有机溶剂为反应介质 ,合成了 3种短链脂肪酸酯 .研究了反应温度、溶剂、底物浓度、底物摩尔比、吸水剂用量等因素对酯化反应的影响 .确定了3种酯的最佳合成条件 :(1)己酸乙酯 :反应温度为 4 0℃ ,环己烷为溶剂 ,0 2 5mol L底物浓度 ,酸醇摩尔比为 1∶1 2 ;(2 )乙酸异丙酯 :5 0℃ ,环己烷为溶剂 ,0 15mol L底物浓度 ,摩尔比为 1∶1;(3)乙酸异戊酯 :5 0℃ ,异辛烷为溶剂 ,0 2 0mol L底物浓度 ,摩尔比为 1∶1.三种酯合成时均需 0 12 5g ml的0 5nm分子筛为吸水剂 ,在 8h后 ,合成酯转化率达到 97%～ 99% .