大口黑鲈MyoD cDNA的克隆和序列分析

MyoD基因是生肌调节因子MRFs家族的主要成员之一,是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因之一,对骨骼肌的形成和分化起主要作用。采用RT-PCR和RACE方法获得大口黑鲈MyoD基因的cDNA序列长为1 157bp,其中3'非编码区为314bp,开放阅读框长843bp,编码280个氨基酸。结构分析表明该肽链无信号肽,第1～110个氨基酸为MyoD基因的Basic区(碱性氨基酸区),第124～167个氨基酸为MyoD基因的HLH结构(螺旋环螺旋结构)。通过对比分析已知GenBank中其它脊椎动物MyoD基因发现,该基因编码的氨基酸肽链随动物由低等向高等进化有加长的趋势,且核苷酸以及推测的氨基酸同源性和动物之间的亲缘关系相一致;大口黑鲈MyoD基因的克隆为研究该基因打靶和鱼类肌肉发育调控机理奠定基础。     

奥利亚罗非鱼DMO蛋白结构和功能预测的研究

目的:对奥利亚罗非鱼DNO蛋白的结构和功能进行预测研究.方法:利用生物信息学的方法对DMO基因推导的氨基酸序列进行结构特征和功能域预测分析,探讨了DMO的信号肽、亲/疏水性、跨膜拓扑结构、卷曲螺旋结构、基序、功能域及高级结构.结果:DMO在第1～17,39～113,153～301.372～410区段为高亲水性区域,属亲水性基团,具有两个螺旋卷曲区域,97～112,155～168氨基酸区域,没有信号肽,含有两个跨膜结构域,发生跨膜运动;DMO包含两个保守的DM-domain和DNA锌指结构等功能结构域;DNO含有1个亮氨酸拉链结构(21～42),7个蛋白激酶C磷酸化位点(49～51,184～186,191～193,235～237,270～272,294～296,333～335),5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(189～192,225～228,227～230,231～234,233～236).1个cAMP-andcGMP-依赖蛋白激酶磷酸化位点(296～299)10个肉豆蔻酰化位点(59～64,121～126,125～130,129～134,135～140,301～306,304～309,307～312,310～315,350～355);DMO蛋白含有27.38%的α-螺旋,8.8%的β-转角和53.79%的无规卷曲;DMO的高级结构中含有两个α-螺旋区域.结论:DMO蛋白与性别调控有关,并在细胞信号传导中发挥作用,且其生物活性可能接受信号途径中多种信号的调控,这为进一步研究奥利亚罗非鱼DMO基因编码蛋白的功能,明确DMO基因与性别调控的关系奠定了基础.     

关岭牛MyoD基因原核表达载体的构建及生物信息学分析

本实验采用RT-PCR方法克隆关岭牛MyoD基因的CDS区,利用Eco RⅠ、XhoⅠ酶对目的片段与pET32a(+)原核表达载体进行酶切,T4连接酶连接过夜,通过转化,测序,构建重组表达载体,并对该基因进行相关生物信息学分析。实验结果获得了关岭牛Myo D基因CDS区,成功构建了p ET-32a(+)-MyoD重组表达载体。MyoD基因编码区为954 bp,编码318个氨基酸,共有31个稀有密码子,表达蛋白大小为34.2 kD。该蛋白为水溶性蛋白,等电点p I=5.8,在体内带负电,二级结构中α-螺旋、无规则卷曲较多。蛋白没有信号肽和明显的跨膜区,为胞内蛋白,主要存在于细胞核中。重组载体表达的Myo D蛋白带有His等标签,蛋白大小为53.6 kD,共497个氨基酸。实验对关岭牛Myo D蛋白的理化性质、结构特点进行了初步分析,以期为研究牛MyoD蛋白特性及其作用机制奠定理论基础。     

红笛鲷p38β MAPK基因的克隆及原核表达

鱼类p38 MAPK基因在宿主免疫调控及抵御病原侵染的过程中具有重要作用。利用RACE技术克隆了红笛鲷p38βMAPK基因(Ls-p38β,Gen Bank登录号为KJ502277)。序列分析结果显示,Ls-p38βc DNA全长1 628 bp,开放阅读框1 086 bp,可编码361个氨基酸,预测其编码蛋白的分子量为41.6 k D,理论等电点为5.74。该基因推导的氨基酸序列含有p38 MAPK家族保守的双磷酸化激活环(TGY),与尼罗罗非鱼的p38β有97%的相似性。将此基因定向插入原核表达载体构建重组表达质粒p ET32-p38β后导入BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE与Western blot分析显示约在60 k D出现特异蛋白条带,与预期分子量大小相符,说明Ls-p38β融合蛋白表达成功。     

灰飞虱雌激素相关受体基因的克隆、序列分析及在氟啶虫胺腈胁迫下的表达模式

【目的】雌激素相关受体(estrogen-related receptor,ERR)是一类依赖配体激活的转录因子,能感受外源物质胁迫调控靶基因的转录,参与外源物质的代谢过程。本研究旨在通过克隆灰飞虱Laodelphax striatellus ERR基因,分析其序列和在氟啶虫胺腈胁迫下表达谱,探析其生理功能及在杀虫剂代谢中的作用。【方法】根据灰飞虱转录组数据信息,利用RT-PCR克隆灰飞虱ERR基因,并进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR,分析暴露于氟啶虫胺腈(0.76 ng/头)后,灰飞虱4龄若虫ERR基因在不同时间点和不同组织中的表达量。【结果】从灰飞虱中克隆到ERR基因,命名为Ls ERR(Gen Bank登录号:KY210878),其c DNA序列全长1 854 bp,开放阅读框长1 260 bp,编码419个氨基酸,预测编码蛋白的分子量为47.70 k D。序列分析显示,Ls ERR具有核受体(nuclear receptors,NRs)家族成员的共同特征性结构:DNA结合区(DNA-binding domain,DBD)(第75-168位氨基酸)和配体结合区(ligand-binding domain,LBD)(第194-416位氨基酸)。采用APSSP2法预测Ls ERR蛋白二级结构,其中α螺旋占43.53%,β折叠占5.49%,无规则卷曲占50.98%。其中,在DBD区,有6个β折叠和3个α螺旋;在LBD区,有3个β折叠和11个α螺旋。系统发育分析表明,Ls ERR与褐飞虱Nilaparvata lugens ERR亲缘关系最近。灰飞虱4龄若虫暴露于氟啶虫胺腈后,12 h时其体内Ls ERR基因上调表达,24 h时达到表达高峰,48 h时表达量下调;Ls ERR在头部微弱表达,在腹部特异性高表达。【结论】Ls ERR是参与灰飞虱代谢氟啶虫胺腈的候选基因。本研究为解毒酶基因的调控和新分子靶标农药的研制提供分子基础。     

草鱼MyoD基因内含子和启动子的克隆与分析

本研究采用PCR和染色体步移法克隆了草鱼Myo D基因311 bp的内含子1、125 bp的内含子2及长1 066 bp的部分上游启动子序列。同源性比对分析表明,草鱼Myo D的内含子1与鲤科鱼类的同源性相对较高(87%~97.1%)。生物信息学方法预测草鱼Myo D的启动子序列中发现含有1个核心启动子序列,存在CREB、SP1、ATF等多种与转录诱导调控有关的转录因子结合位点,未发现Cp G岛。草鱼Myo D基因内含子及启动子克隆与特征分析,将为进一步研究鱼类Myo D基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

茶树CsbHLH71基因克隆及转录活性分析

bHLH转录因子在植物类黄酮代谢过程中具有重要调控作用。该研究采用PCR方法,从‘碧香早’茶树中获得了与儿茶素含量高度负相关的CsbHLH71基因,并对其进行生物信息学分析、亚细胞定位及转录活性分析,为探究CsbHLH71基因在调控茶树儿茶素生物合成的分子机制奠定基础。结果表明：(1)通过RNA-seq测序筛选成功获得一个茶树CsbHLH71基因,该基因CDS序列全长912 bp,编码303个氨基酸;氨基酸序列第101-160位含有一个碱性螺旋-环-螺旋保守结构域,属于bHLH家族转录因子;序列对比和系统进化树结果显示,其与杜鹃花、河滨葡萄等物种的bHLH氨基酸序列有较高的相似性。(2)qRT-PCR结果显示,不同浓度微生物肥处理下茶树CsbHLH71基因的表达水平显著上调,且在1000倍处理下效果最显著,说明高浓度的微生物肥能促进茶树CsbHLH71基因的表达。(3)亚细胞定位分析表明CsbHLH71蛋白定位在细胞核。(4)转录活性分析发现,茶树CsbHLH71蛋白在酵母和烟草中均具有转录抑制活性,为转录抑制子,证实了CsbHLH71蛋白具有转录抑制剂的功能。研究推测,CsbHLH7...     

香樟GGPPS基因的克隆及生物信息学分析

本研究目的是克隆香樟牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranyl-geranyl pyrophosphate synthetase,GGPPS)的c DNA序列,并进行生物信息学分析,为香樟萜类物质的生物合成及调控机制研究提供基础。根据香樟叶的转录组测序数据,设计特异性PCR引物,应用反转录RT-PCR方法,克隆获得香樟GGPPS基因,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析。结果显示,GGPPS基因包含全长1 152 bp的开放读码框(ORF),编码383个氨基酸,蛋白分子量为41.41 k D,等电点p I为5.84,是一个定位于叶绿体,不含跨膜结构域,不含信号肽的不稳定疏水蛋白。GGPPS氨基酸序列的主要二级结构为α-螺旋并含有一个类异戊二烯类化合物合酶的特征结构域。通过氨基酸序列的同源性分析发现,香樟的GGPPS氨基酸序列与苹果、陆地棉和紫苜蓿等植物的GGPPS氨基酸序列有较高的同源性。分子进化树分析结果表明,香樟树GGPPS蛋白与无油樟GGPPS蛋白的亲缘关系相对较近。本研究成功克隆、分析并表达了香樟GGPPS,为进一步研究香樟GGPPS基因的功能,萜类合成调控机制等奠定了分子基础。     

甘肃马鹿myogenin基因克隆、序列结构特征预测及其分子系统进化分析

根据GenBank中公布的绵羊、水牛、猪、小鼠及人的肌细胞生成素基因(myogenin)DNA序列,设计了3对引物,采用PCR扩增和克隆技术,首次从甘肃马鹿血液基因组中获得了myogenin基因序列,并利用生物信息学方法对甘肃马鹿该基因核苷酸及其编码氨基酸序列的结构特征进行初步预测和分析,进一步基于该基因氨基酸序列构建了15个物种的分子系统进化树。结果表明,获得的甘肃马鹿myogenin基因序列大小为3168bp(GenBank登录号:FJ746497),包括3个外显子、2个内含子、部分5'UTR和3'UTR,其序列包括1个684bp的开放阅读框,编码227个氨基酸,myogenin蛋白理论分子质量为25.2493kDa,PI为5.68,不稳定系数是66.22,属于酸性不稳定蛋白质。进一步分析发现,该序列不含有信号肽和跨膜区域,含有11个广泛磷酸化位点,第1～136个氨基酸为甘肃马鹿myogenin基因bHLH保守结构功能域,二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。序列相似性及分子系统进化分析显示,甘肃马鹿myogenin基因与反刍动物山羊、绵羊和水牛的亲缘关系最近。甘肃马鹿myogenin基因的克隆及序列结构特征的生物信息学预测为进一步探讨鹿科动物肌肉生长发育的分子调控机理奠定了理论基础。     

宁夏云雾山典型草原灌丛化过程中植被和土壤演变特征

bHLH转录因子在植物类黄酮代谢过程中具有重要调控作用。该研究采用PCR方法，从‘碧香早’茶树中获得了与儿茶素含量高度负相关的CsbHLH71基因，并对其进行生物信息学分析、亚细胞定位及转录活性分析，为探究CsbHLH71基因在调控茶树儿茶素生物合成的分子机制奠定基础。结果表明：(1)通过RNA-seq测序筛选成功获得一个茶树CsbHLH71基因，该基因CDS序列全长912 bp，编码303个氨基酸；氨基酸序列第101-160位含有一个碱性螺旋-环-螺旋保守结构域，属于bHLH家族转录因子；序列对比和系统进化树结果显示，其与杜鹃花、河滨葡萄等物种的bHLH氨基酸序列有较高的相似性。(2)qRT-PCR结果显示，不同浓度微生物肥处理下茶树CsbHLH71基因的表达水平显著上调，且在1000倍处理下效果最显著，说明高浓度的微生物肥能促进茶树CsbHLH71基因的表达。(3)亚细胞定位分析表明CsbHLH71蛋白定位在细胞核。(4)转录活性分析发现，茶树CsbHLH71蛋白在酵母和烟草中均具有转录抑制活性，为转录抑制子，证实了CsbHLH71蛋白具有转录抑制剂的功能。研究推测， CsbHLH71蛋白可能负调控茶树中儿茶素积累。     

生肌螺旋-环-螺旋蛋白

HLH 蛋白是近几年来发现的一类 DNA 结合蛋白,其分子中含有一螺旋-环-螺旋(HLH)结构.至今,其家族成员已超过20个,它们参与转录调节、细胞癌变以及细胞分化等过程.骨骼肌发育成熟的各个阶段均受到特异生肌转录调节蛋白因子的控制.这些因子包括 Myo D1,myogenin 以及 Myf-5等,它们均系 HLH 家族成员,在生肌过程中起非常重要作用.     

葛仙米血红素氧合酶基因Ns-HO1异源表达及其蛋白结构模拟

为明确葛仙米(Nostoc sphaeroides)中血红素氧合酶(Heme oxygenase, HO)基因编码蛋白的分子进化地位和高级结构, 克隆该基因并进行原核细胞表达, 氨基酸序列比对与分子进化分析和Swiss-model高级结构模拟。结果显示: 葛仙米血红素氧合酶基因Ns-HO1密码区全长为678 bp, 预编码一含225个氨基酸的蛋白质; Ns-HO1与同源蛋白氨基酸相似性达90.3%, 存在少部分位点替换突变, 但底物血红素的预结合位点(如Arg10和Tyr125)及金属离子结合位点(His17)等关键位点的氨基酸保持稳定。 构建表达载体, 葛仙米Ns-HO1在大肠杆菌中成功诱导表达, SDS-PAGE检测目的蛋白大小近26.0 kD; 分子进化树分析显示Ns-HO1与普通念珠藻、发状念珠藻中同源蛋白聚类于同一分支, 并与点状念珠藻中同源蛋白具有共同祖先。Ns-HO1蛋白多肽链形成8个主要α-螺旋,其中N和C末端的两个α-螺旋与第四螺旋共同为Ns-HO1高级结构提供底面支撑, 其他螺旋围绕该底面进一步延展并充填其中, 形成Ns-HO1分子的类夹心式结构。在高级结构中, 含血红素预结合位点氨基酸的几个螺旋(第一、 五和七螺旋)位于Ns-HO1分子外围, 这些分支螺旋为形成Ns-HO1夹心空间以利于底物血红素锚定和产物及时释放提供了条件。总之, 研究为深入了解与运用葛仙米血红素氧合酶基因的生物学功能和资源提供了基础。     

甘蔗液泡ATP酶C亚基基因克隆及序列分析

根据筛选文库时获得的EST序列信息,利用RACE技术分离了一个甘蔗ATP酶C亚基基因,命名为ShVHA-C。该基因cDNA全长1 312 bp,含有1 056 bp的完整阅读框架,编码351个氨基酸。序列比对及结构预测分析表明,ShVHA-C编码的氨基酸序列与水稻、小麦、苜蓿、绿豆和蓖麻中相应基因氨基酸序列的一致性分别达到94.10%、93.22%、91.15%、91.15%和91.74%,与水稻一致性最高。在整个二级结构中,含有233个α-螺旋(alpha helix),占66.38%;含有5个延伸链(extended strand),占1.42%;含有113个无规则卷曲(random coil),占32.19%。此蛋白不具有导肽。整个多肽链表现为亲水性,没有明显的疏水区域,初步认为甘蔗ShVHA-C编码蛋白是亲水性蛋白。     

大花杓兰亲环素基因(CmCyP)的克隆及生物信息学分析

亲环素是一个多基因家族,在植物生命活动中发挥着重要的作用。该研究以大花杓兰(Cypripedium macranthum)为材料,采用RT-PCR技术克隆到1个亲环素基因(CyP),并对其进行生物信息学分析。结果表明:大花杓兰CyP基因的开放阅读框序列为525 bp,命名为CmCyP(GenBank登录号为MH411125),编码174个氨基酸。预测CmCyP蛋白是一个位于细胞质、相对分子量约为18 kD、理论pI为8.73、无信号肽、跨膜结构域的亲水性蛋白质。磷酸化和糖基化位点预测分析发现,CmCyP蛋白存在18个潜在的磷酸化位点和2个潜在的糖基化位点。蛋白保守结构域预测分析发现,CmCyP蛋白包含一个高度保守的肽脯氨酰顺反异构酶结构域,属于单结构域亲环素。对二级结构进行预测分析发现,CmCyP蛋白中存在无规卷曲70个、延伸链56个、α-螺旋23个、β-折叠25个,这4种结构元件在三级结构中也有体现。系统进化树结果显示,大花杓兰CmCyP蛋白与铁皮石斛(Dendrobium catenatum)和万带兰(Vanda hybrid cultivar)的CyP蛋白的亲缘关系较近。该研究首次克隆了大花杓兰亲环素基因(CmCyP),为进一步探讨CmCyP基因的生物学功能奠定了基础。     

盐胁迫对橙色莫桑比克罗非鱼AQP1基因表达的影响

水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一类细胞膜通道蛋白,能够选择性地高效转运水分子。为研究橙色莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)AQP1基因在渗透压调控中的作用,该实验克隆了橙色莫桑比克罗非鱼的AQP1基因,并利用实时荧光定量方法(q PCR)分析了该基因在各个组织中的表达分布及其在盐度梯度胁迫(低盐胁迫(22‰)和高盐胁迫(35‰))条件下鳃、肾和肌肉的表达特征。结果显示AQP1基因c DNA全长2 612 bp,开放阅读框(ORF)774 bp,编码258个氨基酸;其DNA序列全长3 215 bp,包含2个内含子,3个外显子。组织分布结果表明,AQP1基因在各组织都有表达,在肾、皮肤和肌肉中表达量相对较高;盐胁迫结果显示,在盐度为22时鳃和肾中表达量在6 h达到峰值,肌肉中在24 h达到峰值;当盐度升至35时,鳃、肾和肌肉表达量均升高。实验结果表明,AQP1基因的表达与盐度密切相关,并参与橙色莫桑比克罗非鱼的渗透压调控。     

三角梅cDOPA 5GT基因的克隆和光照对其表达的影响

为了解光照对三角梅(Bougainvillea glabra)葡糖基转移酶基因表达的影响,从其苞片中克隆了环多巴5-糖基转移酶基因(cDOPA 5GT)。结果表明,三角梅cDOPA 5GT基因的cDNA全长为1 446 bp,编码482个氨基酸,生物信息学分析表明cDOPA 5GT蛋白的等电点(PI)为5.77,具有糖基转移酶的特征基序,为酸性亲水跨膜蛋白,不含信号肽,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,氨基酸序列保守性较差。qRT-PCR分析表明,遮光处理cDOPA 5GT基因表达量和植株的甜菜红素含量均显著下降。这表明三角梅的色素合成受糖基转移酶基因调控,并与光照呈正相关关系。     

大豆GmC4H基因的克隆及同源基因的生物信息学分析

本研究分别在大豆品种中豆27和九农20中克隆大豆肉桂酸-4-羟化酶基因(Glyma.20G114200),得到长度为1 797 bp的C4H基因c DNA序列。比对两者c DNA序列发现4个碱基差异位点。通过对二者氨基酸序列进行理化性质及结构与功能分析发现,C4H基因编码蛋白的5~24位氨基酸之间和32~55位氨基酸之间存在跨膜区域;C4H蛋白含有细胞色素P450结构域。大豆C4H基因的四个拷贝分别分布于第2、第10、第14和第20号染色体上,Glyma.20G114200与Glyma.10G275600的蛋白质同源性高,而另外两个同源基因Glyma.02G236500和Glyma.14G205200的蛋白质同源性高。结果表明,可能大豆4个C4H同源基因在进化过程中发生了功能的较大分化。     

饥饿对尼罗罗非鱼肌肉和肝KLF15基因节律性表达的影响

Krüppel样转录因子15 (Krüppel-like factors,KLF15)是Krüppel样转录因子家族的一员。Krüppel样转录因子家族的特征是含有3个高度保守的Cys2His2锌指结构,与DNA的CACCC元件和富含GC区连接,从而调控转录激活或抑制。KLF15在糖、脂肪酸、氨基酸代谢过程中发挥重要的调控作用。本研究克隆了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus) KLF15基因全长cDNA序列,根据推测的氨基酸序列分析,发现其具有KLF15的两个典型结构域zf-H2C2-2和zf-C2H2。系统进化树的比较分析表明,尼罗罗非鱼KLF15与雪鲷(Maylandia zebra) KLF15亲缘关系最为接近。尼罗罗非鱼短期饥饿实验结果显示:正常进食状态时尼罗罗非鱼肌肉、肝中KLF15基因都呈现明显的昼夜节律性,均为昼低夜高;饥饿7 d后KLF15基因依然有显著昼夜节律性,但振幅降低,且在肝中表现出昼高夜低现象。以上结果说明尼罗罗非鱼的营养变化在一定程度上直接或间接影响KLF15基因节律性表达。     

牦牛AQP4基因CDS序列的克隆及其生物信息学特征分析

为了研究高原动物对青藏高原高寒、低氧等极端生境的适应机理,进一步探讨高原动物对高原反应——高原脑水肿抗性的分子机理,运用基因克隆与生物信息学相关技术和方法,对牦牛脑AQP4(水通道蛋白4,AQP4)基因CDS全长序列进行克隆、基因序列比对及其生物信息学特征分析。结果表明,牦牛AQP4的CDS含有一个966 bp的开放阅读框,编码322个氨基酸;牦牛AQP4基因编码蛋白分子量34.69 k D,理论等电点(p I)7.59,其编码蛋白含有6次跨膜结构,属于疏水性蛋白;二级结构主要由α-螺旋、延伸及无规则卷曲构成;AQP4基因编码产物氨基酸同源性及系统进化分析发现,牦牛AQP4基因编码氨基酸序列与黄牛、绵羊等物种间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。