氟啶虫胺腈对意大利蜜蜂解毒、免疫和记忆相关基因表达的亚致死效应

【目的】新型杀虫剂氟啶虫胺腈广泛用于农业生产中的害虫防治,但其对蜜蜂健康影响的研究较少。本文探究了亚致死剂量的噻虫啉对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica 6种解毒相关基因(CYP9Q1、CYP9Q2、CYP9Q3、CYP9S1、CYP6AS5和CYP4G11)、4种免疫相关基因(Abaecin、Defensin、Hymenoptaeci和Apidaecin)和3种记忆相关基因(PKA、GluRA和NMDAR1)表达的影响。【方法】采用饲喂法确定氟啶虫胺腈对蜜蜂的经口急性毒性;并用1/3 LD_(50)和1/10 LD_(50)氟啶虫胺腈饲喂蜜蜂后48 h,运用荧光定量PCR技术分别检测了蜜蜂脑部解毒、免疫和记忆相关基因的表达变化,并统计各组蜜蜂的死亡率。【结果】氟啶虫胺腈对蜜蜂经口性半数致死剂量LD_(50)为0.099μg/蜂;饲喂1/3 LD_(50)氟啶虫胺腈能够显著抑制蜜蜂Abaecin和Defensin的表达(P 0.05),而PKA、NMDAR1、GluRA、CYP9Q2和CYP9Q3能够被其诱导上调表达(P 0.05);饲喂1/3 LD_(50)和1/10 LD_(50)氟啶虫胺腈均能显著诱导蜜蜂Hymenoptaecin、Apidaecin、CYP6AS5和CYP4G11上调表达(P 0.05)。但饲喂1/3 LD_(50)和1/10 LD_(50)氟啶虫胺腈的处理均不影响蜜蜂CYP9Q1和CYP9S1表达。【结论】氟啶虫胺腈的曝露可能会对意大利蜜蜂的免疫、记忆和解毒系统都有一定的影响,这对深入探究氟啶虫胺腈与蜜蜂之间互作的分子机制有一定生物学意义。     

灰飞虱中IKK相关基因的鉴定及其在水稻条纹病毒侵染中的功能

【目的】本研究旨在鉴定灰飞虱Laodelphax striatellus中的IκB激酶(IκB kinase,IKK)相关基因,并调查其在灰飞虱抗病毒中的作用,以进一步深入理解传毒介体应对植物病毒的先天免疫机制。【方法】通过生物信息学鉴定了灰飞虱基因组中IKK相关基因;以无毒及水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)侵染的灰飞虱为材料,利用RT-PCR方法检测IKK相关基因在无毒灰飞虱各个龄期(卵、1-5龄若虫、雄成虫和雌成虫)及成虫不同组织(肠道、唾液腺、血淋巴、脂肪体、卵巢和精巢)中的表达量;利用qRT-PCR方法检测无毒以及RSV侵染后的灰飞虱IKK相关基因在各个龄期及成虫不同组织中的表达量;通过对3龄若虫注射IKK基因dsRNA进行RNA干扰后,利用qRT-PCR检测带毒灰飞虱中表示病毒含量的RSV外壳蛋白(CP)基因转录水平。【结果】在灰飞虱基因组中鉴定到了两个IKK相关基因即IKKα(GenBank登录号:MK903504)和TANK结合激酶1(TANK-binding kinase1)基因TBK 1(GenBank登录号:MN124506)。IKKα开放阅读框长2379 bp,编码792个氨基酸;TBK 1开放阅读框长1551 bp,编码516个氨基酸。两个基因编码的蛋白都具有1个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和1个泛素折叠结构域。RT-PCR结果表明,IKKα和TBK 1在无毒灰飞虱各个龄期及成虫不同组织中均有表达。qRT-PCR分析结果表明,IKKα和TBK 1在RSV侵染后的灰飞虱各个龄期及成虫不同组织中的表达水平与其在无毒灰飞虱中的表达量之间存在明显差异。进一步将RSV侵染后的灰飞虱3龄若虫中的IKKα和TBK 1干扰后,带毒灰飞虱中的RSV含量显著上升。【结论】本研究结果表明,NF-κB信号途径中的两个重要基因IKKα和TBK 1在灰飞虱中广泛表达,且在灰飞虱抵御RSV的侵入过程中可能具有重要功能。这些结果为今后进一步深入研究NF-κB免疫通路在灰飞虱抗病毒中的功能提供了丰富的基础信息。     

褐飞虱基因BphMIF1克隆及表达分析

【目的】克隆水稻重要害虫褐飞虱Nilaparvatalugens唾液蛋白基因BphMIF1,探析BphMIF1在响应褐飞虱取食过程中的表达谱。【方法】采用RT-PCR法克隆了褐飞虱唾液蛋白基因BphMIF1,测序后对序列进行生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR(qPCR)对褐飞虱1-5龄若虫及成虫以及不同成虫虫体部位BphMIF1的表达量进行分析,同时对BphMIF1进行了原核表达分析。【结果】克隆得到BphMIF1基因,编码119个氨基酸。qPCR结果表明BphMIF1基因在若虫4龄期表达会迅速上调,在成虫的头、胸、腹均有表达,以腹部表达量最高。原核表达结果显示褐飞虱BphMIF1基因以0.5mmol?L-1的IPTG作为诱导浓度,诱导时间为4h表达效果较好。【结论】BphMIF1基因在褐飞虱成虫头、胸、腹部均有表达,在若虫不同发育历期其表达量有所差异且在4龄若虫时期表达量有显著上调。该结果可为BphMIF1在褐飞虱取食过程中的功能研究奠定基础。     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4的克隆及表达模式分析

【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;通过qRT-PCR技术检测其在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体)中的时空表达谱,以及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式。【结果】克隆获得褐飞虱Nlserpin4基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MN822802),其开放阅读框长1 227 bp,编码408个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为45.91 kD和6.23。氨基酸序列分析表明,Nlserpin4蛋白无糖基化位点,N端包含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽,C端具有serpin蛋白家族典型的RCL区,且含有能被靶标蛋白酶识别的活性裂解位点。系统发育分析表明,Nlserpin4与半翅目其他昆虫的serpin亲缘关系较近,其中与蔗黄伪毛蚜Sipha flava serpin4的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin4基因表达具有明显的时空特异性,其在成虫中的表达量显著高于在其他龄期的,且在雄成虫中表达量最高;Nlserpin4基因在褐飞虱5龄若虫脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体中均有表达,且在剩余虫体组织中表达量最高;病原真菌金龟子绿僵菌诱导48 h内Nlserpin4表达量均显著下调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin4表达量呈回升趋势。【结论】褐飞虱Nlserpin4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及病原真菌金龟子绿僵菌诱导不同时间下差异表达。研究结果为深入研究Nlserpin4在褐飞虱生长发育和免疫调节中的功能奠定了基础。     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4的克隆及表达模式分析

摘要: 【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;通过qRT-PCR技术检测其在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体)中的时空表达谱,以及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式。【结果】克隆获得褐飞虱Nlserpin4基因全长cDNA序列(GenBank登录号: MN822802),其开放阅读框长1 227 bp,编码408个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为45.91 kD和6.23。氨基酸序列分析表明,Nlserpin4蛋白无糖基化位点,N端包含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽,C端具有serpin蛋白家族典型的RCL区,且含有能被靶标蛋白酶识别的活性裂解位点。系统发育分析表明,Nlserpin4与半翅目其他昆虫的serpin亲缘关系较近,其中与蔗黄伪毛蚜Sipha flava serpin4的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin4基因表达具有明显的时空特异性,其在成虫中的表达量显著高于在其他龄期的,且在雄成虫中表达量最高;Nlserpin4基因在褐飞虱5龄若虫脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体中均有表达,且在剩余虫体组织中表达量最高;病原真菌金龟子绿僵菌诱导48 h内Nlserpin4表达量均显著下调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin4表达量呈回升趋势。【结论】褐飞虱Nlserpin4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及病原真菌金龟子绿僵菌诱导不同时间下差异表达。研究结果为深入研究Nlserpin4在褐飞虱生长发育和免疫调节中的功能奠定了基础。     

褐飞虱核糖体小亚基蛋白S8基因NlRPS8的克隆及其表达分析

【目的】核糖体蛋白在生物体内具有重要作用,本研究旨在探明核糖体蛋白S8在褐飞虱Nilaparvata lugens生长发育过程中的表达规律和功能。【方法】本文根据褐飞虱基因表达谱提供的差异表达基因信息及转录组提供的基因核心序列,结合褐飞虱基因组比对分析,对褐飞虱核糖体S8基因进行了预测,并通过RT-PCR获得了褐飞虱核糖体小亚基蛋白S8的全长c DNA序列,命名为NlRPS8(Gen Bank登录号:KU341337)。【结果】NlRPS8基因全长627 bp,编码208个氨基酸。进化分析表明,褐飞虱与桑粉介壳虫Maconellicoccus hirsutus亲缘关系最为接近。应用荧光定量PCR分析了基因NlRPS8的表达规律,结果表明,NlRPS8基因在褐飞虱怀卵雌虫中表达量最高,而在雄成虫、初羽化雌成虫与1~5龄若虫表达量相对较低;在褐飞虱体内,NlRPS8基因在卵巢中表达量最高,中肠次之,在其他部位表达量较低。在抗性品种ASD7和RHT上,NlRPS8基因表达量分别为感性品种TN1上的1.99倍和2.14倍。NlRPS8基因在经过饥饿处理1 d的褐飞虱组中表达量为正常组的1.6倍。【结论】研究结果显示NlRPS8基因在褐飞虱生长、繁殖中发挥作用,为进一步研究NlRPS8基因在褐飞虱生长发育和对抗性品种适应中的功能提供了线索。     

褐飞虱Nl15基因的克隆及功能分析

【目的】植食性刺吸式口器昆虫的唾液蛋白参与调控植物抗虫防御反应,影响其对寄主植物的适应性。本研究旨在通过克隆褐飞虱Nilaparvata lugens重要唾液蛋白基因Nl15,调查其时空表达模式,明确其在褐飞虱致害性中的作用。【方法】基于褐飞虱IR56种群转录组数据,用RT-PCR克隆褐飞虱基因Nl15 cDNA序列,并进行生物信息学分析。利用qPCR检测其在褐飞虱TN1和IR56种群不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和雌雄成虫)和雌成虫不同组织(头、胸、腹和足)中的表达模式。通过显微注射dsRNA对褐飞虱TN1和IR56种群的4龄若虫进行Nl15的RNAi,利用qPCR检测Nl15 RNAi后褐飞虱若虫中Nl15的相对表达量以及Nl15 RNAi后褐飞虱若虫取食3 d时水稻植株中防御相关基因(OsLecRK4, OsMPK10, OsWRKY24, OsLox, OsNPR1和OsGns5)的相对表达量,并生物测定Nl15 RNAi后褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量。【结果】克隆了褐飞虱Nl15 cDNA序列(GenBank登录号：OK181113),其开放阅读框长1 008 bp;预测编码335个氨基酸,理论等电点为7.54,分子量为38.7 kD,含有23个氨基酸的信号肽序列和一个糖基化修饰位点,不存在跨膜结构域和其他已知的功能域;Nl15与灰飞虱Laodelphax striatellus同源蛋白氨基酸序列一致性为45%。发育表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱各个发育阶段均表达,在3-4龄若虫中的表达量最高;组织表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱雌成虫头部中的表达量最高,且在IR56种群头部中的表达量高于在TN1种群头部中的。RNAi实验结果表明,与注射dsGFP的对照组相比,注射dsNl15的处理组中Nl15的表达量显著降低了89.5%,褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量均显著降低,上述6个水稻防御相关基因的表达量显著上调。【结论】褐飞虱IR56种群中的Nl15参与褐飞虱与水稻的防御与反防御分子互作。本研究为进一步阐述褐飞虱克服抗虫基因的机制及揭示昆虫与植物互作的分子网络提供了思路。     

硫激肽及其受体调控褐飞虱取食行为

【目的】明确硫激肽(sulfakinin, SK)及硫激肽受体(sulfakinin receptor, SKR)在褐飞虱Nilaparvata lugens取食行为中的作用。【方法】PCR克隆褐飞虱硫激肽基因Nlsk及其受体基因Nlskr cDNA全长序列并进行生物信息学分析；利用qRT-PCR检测Nlsk及Nlskr在褐飞虱不同发育阶段(卵、1-5龄若虫、雄成虫和雌成虫)和雌成虫不同组织(头、触角、翅、口针、足、肠道和马氏管)中的表达量；褐飞虱3龄若虫注射dsNlskr进行基因沉默，qRT-PCR检测4龄若虫中Nlskr的表达量，测定4龄若虫的取食量；基于已构建的Nlskr RNAi后的4龄若虫转录组数据库进行差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)的GO和KEGG分析以及取食相关基因的qRT-PCR验证。【结果】PCR克隆得到了褐飞虱Nlsk(GenBank登录号：AB817281)及Nlskr(GenBank登录号：BAO01059.1)的cDNA全长序列。序列比对结果显示，褐飞虱NlSK成熟肽具有与其他物种保守的C端FMRFam...     

不同药剂对褐飞虱作用特性的比较

为高效和合理利用化学药剂防治褐飞虱Nilaparvta lugens( St(a)l),采用浸苗法和喷雾法测定了噻虫嗪、烯啶虫胺、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氯噻啉和乙虫腈5种药剂对褐飞虱的作用活性和速度,同时还比较了噻虫嗪和烯啶虫胺对褐飞虱不同龄期若虫的作用活性.结果表明,在5种供试药剂中,从作用活性来看,无论是用浸苗法...     

Met和Kr-h1基因在褐飞虱变态发育中的功能分析

【目的】保幼激素受体Methoprene-tolerant(Met)控制保幼激素信号传导途径中重要下游转录因子Krüppelhomolog 1(Kr-h1)的表达,调控昆虫的变态发育。本研究旨在探究褐飞虱Nilaparvata lugens Met基因与Kr-h1在褐飞虱变态发育中的功能。【方法】利用PCR技术扩增Nl Met基因的ORF序列。通过RNA干扰技术分别或同时沉默褐飞虱若虫的Nl Met和Nl Kr-h1基因,进一步研究其功能。【结果】克隆得到Nl Met,其开放阅读框包含1 185 bp,编码395个氨基酸,包括b HLH,PAS-A,PAS-B和PAC 4个结构域;其中PAS-B和PAC保守性较高,而b HLH和PAS-A保守性相对较低。采用RNA干扰技术沉默Nl Met和Nl Kr-h1基因后发现,单独对4龄若虫Nl Kr-h1基因干扰后,若虫阶段及初羽化雌虫和雄虫死亡率均显著上升(P0.05);对5龄若虫Nl Kr-h1基因干扰后只有若虫死亡率上升(P0.05),单独对Nl Met基因干扰后死亡率没有显著变化(P0.05);二者共同沉默后的死亡率同单独对Nl Kr-h1沉默时类似。此外,我们还发现单独对4龄若虫Nl Kr-h1干扰后在雌虫中出现了生殖器畸形,虽然Nl Met干扰并未出现生殖器发育畸形现象,但二者共同干扰后,在若虫、初羽化雌雄成虫中畸形比例均显著增加(P0.05)。【结论】Nl Met与下游转录因子Nl Kr-h1对褐飞虱变态发育起到重要作用,影响若虫到成虫的变态和外生殖器的发育。本研究有助于揭示Nl Met和Nl Kr-h1在昆虫变态发育中的重要作用。     

种子丸粒化包衣处理后氟啶虫胺腈的消解动态及对黄曲条跳甲的防控效果

【目的】明确丸粒化包衣处理后氟啶虫胺腈在菜薹体内的消解动态和对黄曲条跳甲Phyllotreta striolata (Fabricius)的防控效果,为十字花科蔬菜种子丸粒化包衣的科学应用提供参考。【方法】应用高效液相色谱法分析了氟啶虫胺腈在菜薹各营养器官和根系周边土壤中的消解动态。【结果】氟啶虫胺腈在土壤中的浓度呈现先增加后降低的发展趋势,播种后第1天氟啶虫胺腈在土壤中的浓度为17.03mg/kg,第10天升高至33.87 mg/kg,随后缓慢下降,在第31天时下降到0.17 mg/kg。氟啶虫胺腈在菜薹根和叶中的浓度也呈现先增加后降低的发展趋势,播种后第4天根、叶中的浓度分别为82.14 mg/kg和279.67 mg/kg,随后逐渐升高,在第7天达到56.85 mg/kg和325.27 mg/kg,此后缓慢下降,第31天时氟啶虫胺腈在根和叶中的浓度均低于检测限。氟啶虫胺腈在菜薹茎中的浓度呈现下降趋势,播种后第4天茎中氟啶虫胺腈的浓度为81.47 mg/kg,然后一直下降,直至第31天时低于检测限。田间试验结果显示菜薹种子应用氟啶虫胺腈丸粒化包衣技术处理后黄曲条跳甲的田间种群数量和受害株数均显著低于对照组。【结论】本研究证明了氟啶虫胺腈丸粒化包衣在菜薹生产中安全可行,并且对黄曲条跳甲防控效果显著,为黄曲条跳甲的防治和十字花科作物的安全生产提供了一个有效的解决方案。     

六种新烟碱类杀虫剂对凹唇壁蜂的毒性及风险评估

【目的】为评价新烟碱类杀虫剂对凹唇壁蜂Osmia excavata的毒性和风险性。【方法】分别采用饲喂法和接触法测定了啶虫脒、噻虫嗪、氟啶虫胺腈、吡虫啉、噻虫胺、呋虫胺6种新烟碱类杀虫剂对凹唇壁蜂雌成蜂的24 h和48 h的急性经口和接触毒性。并依据农药对蜜蜂生态风险的危害熵值(hazard quotient,HQ)评估其对凹唇壁蜂的风险性。【结果】经口毒性测定中,氟啶虫胺腈对凹唇壁蜂雌蜂毒性最高,噻虫嗪毒性最低;接触毒性测定中,噻虫胺对凹唇壁蜂雌蜂毒性最高,氟啶虫胺腈毒性最低。啶虫脒、噻虫嗪、吡虫啉对凹唇壁蜂表现为中等风险;噻虫胺经对凹唇壁蜂表现为高风险。氟啶虫胺腈和呋虫胺经接触途径表现为中等风险,而经口途径表现为高风险。【结论】本研究所选的6种新烟碱类杀虫剂对凹唇壁蜂雌成蜂的毒性均为高毒。在果园中应尽量避免使用噻虫胺、氟啶虫胺腈及呋虫胺,在植物花期谨慎使用啶虫脒、噻虫嗪、吡虫啉等新烟碱类杀虫剂。     

氟啶虫胺腈、乙基多杀菌素及其混剂对地熊蜂的毒性及风险评估

【目的】明确氟啶虫胺腈、乙基多杀菌素及其混剂对地熊蜂Bombus terrestris的毒性。【方法】分别采用饲喂法和接触法测定了氟啶虫胺腈、乙基多杀菌素及其混剂(1∶1)对地熊蜂1日龄工蜂成虫的急性经口毒性和急性接触毒性,同时测定药剂对地熊蜂乙酰胆碱酯酶(ACh E)活性的影响。依据农药对蜜蜂生态风险的危害熵(hazard quotient,HQ)值评估杀虫剂对熊蜂的风险。【结果】氟啶虫胺腈、乙基多杀菌素及其混剂(1∶1)对地熊蜂成年工蜂急性经口毒性测定48 h时LD50值分别为2.50,4.97和4.07μg a.i./蜂,均表现为中毒。氟啶虫胺腈急性触杀毒性测定48 h时LD50值为8.72μg a.i./蜂,表现为中毒,而乙基多杀菌素及其与氟啶虫胺腈的混剂(1∶1)最高剂量120μg a.i./蜂触杀处理未见地熊蜂死亡,表现为低毒。同时,3种药剂对地熊蜂成年工蜂的HQ值均低于50,表现为低风险。氟啶虫胺腈经口处理抑制了ACh E的活性,且抑制作用随剂量增加而增强,乙基多杀菌素及其与氟啶虫胺腈的混剂(1∶1)的LD60剂量对ACh E的活性具有先激活后抑制作用。【结论】氟啶虫胺腈、乙基多杀菌素及其混剂(1∶1)对地熊蜂的HQ评估均表现为低风险,其中乙基多杀菌素及其与氟啶虫胺腈的混剂(1∶1)对地熊蜂的致毒作用慢于氟啶虫胺腈,且室内安全性评价表明它们的安全性高于氟啶虫胺腈。     

褐飞虱自噬相关基因NlATG13的表达与功能分析

【目的】自噬参与多种细胞生理过程,自噬相关蛋白ATG13是ATG1/13复合物的组成部分, 在启动自噬中发挥着重要作用。本研究旨在分析ATG13在褐飞虱Nilaparvata lugens中发挥的功能,评估其作为害虫防治靶标的潜力。【方法】基于褐飞虱转录组数据,利用RACE克隆褐飞虱NlATG13的cDNA全长序列;应用生物信息学技术分析NlATG13的核苷酸和氨基酸序列特征。利用RT-qPCR检测其在褐飞虱不同发育阶段(1-5龄若虫和雌雄成虫)和不同组织(5龄若虫头、胸、中肠和脂肪体以及刚羽化雌成虫的卵巢)中的表达模式。通过显微注射dsNlATG13至3龄若虫进行RNAi敲减NlATG13的表达,探究其对褐飞虱生存和中肠细胞自噬的影响;利用RT-qPCR检测RNAi 4 d时3龄若虫中糖原合成与代谢通路相关基因NlGSK3, NlGS和NlGP的表达量。【结果】克隆得到NlATG13的cDNA全长序列(GenBank登录号: MF805752),其开放阅读框长1 203 bp,编码一个含400个氨基酸的蛋白质(GenBank登录号: AWW05678.1)。系统发育分析表明,在纳入分析的物种中,NlATG13蛋白与半翅目温带臭虫Cimex lectularius和茶翅蝽Halyomorpha halys的ATG13蛋白进化关系较为接近。发育表达谱结果表明NlATG13在褐飞虱3和5龄若虫中的表达量显著高于在1-2龄若虫、雌成虫和雄成虫中的; 组织表达谱结果表明NlATG13在5龄若虫头部和脂肪体中的相对表达量较高,在胸部的表达量最低。RNAi结果显示,与dsGFP对照组相比dsNlATG13处理组中褐飞虱中肠细胞中存在明显的糖原颗粒积累,NlGS, NlGSK3和NlGP的表达量均无显著变化,组织ATP含量显著降低;褐飞虱的存活率显著降低,处理第10天时褐飞虱存活率下降到41.4%,而dsGFP对照组的存活率保持在85.6%的较高水平。【结论】 RNA干扰NlATG13基因对褐飞虱的生存和中肠细胞自噬具有显著的抑制效果,NlATG13基因具有作为褐飞虱防治靶标的潜力。     

黑尾叶蝉卵黄原蛋白受体基因cDNA的克隆、序列分析及表达模式

【目的】卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR)属于低密度脂蛋白受体,通过介导内吞作用为发育中的卵母细胞摄取卵黄原蛋白,为胚胎发育提供营养物质,在昆虫生殖过程中发挥关键作用。为研究黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps VgR(NcVgR)基因的生理功能及其在生殖中的作用,本研究克隆并解析了NcVgR基因的序列,并对其时空表达进行了研究。【方法】根据黑尾叶蝉转录组数据信息,利用RT-PCR克隆了NcVgR基因,并进行了生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR研究了不同发育时期、成虫不同组织NcVgR的表达水平。【结果】NcVgR c DNA序列全长6 676 bp,开放阅读框长度5 568 bp,编码1 855个氨基酸,预测编码蛋白的分子量为206 k D,N端前17个氨基酸为信号肽。序列分析显示,NcVgR具有低密度脂蛋白家族的5个经典保守域,即:配体结合域(ligand-binding domain,LBD)、表皮生长因子前体同源域(EGF-precursor homology domain,EGFP)、O-糖链结构域(O-linked sugar domain,OLSD)、跨膜域(transmembrane domain,TMD)和胞质尾域(cytoplasmic domain)。系统发育分析表明,NcVgR与褐飞虱N.lugens VgR亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,NcVgR转录起始时间为5龄若虫,羽化后转录水平逐渐上升,至羽化后8 d达到峰值,随后下降。有意思的是,随着黑尾叶蝉产卵,NcVgR转录水平再次上升,至羽化后16 d达到最高水平。组织定位结果显示,NcVgR在黑尾叶蝉雌成虫卵巢中特异性高表达,而在雌成虫脂肪体和肠道中微量表达,在雌成虫脑及雄成虫中均未检测到表达。【结论】NcVgR在黑尾叶蝉雌成虫卵巢中特异性表达,并且不同发育时期具有不同的表达量,这为研究黑尾叶蝉的生殖调控机理提供了分子信息。     

贵州稻区褐飞虱种群对六种杀虫剂的抗性动态

【目的】为明确贵州褐飞虱Nilaparvata lugens种群对常用杀虫剂的抗性水平。【方法】在室内采用浸渍法测定了2013-2015年采自贵州黄平、桐梓和开阳3地的褐飞虱种群对6种杀虫剂(吡虫啉、噻虫嗪、异丙威、噻虫胺、啶虫脒和醚菊酯)的抗性。【结果】贵州褐飞虱种群对不同的杀虫剂存在着抗性差异。与敏感品系相比,2013-2015年间3地田间褐飞虱种群对吡虫啉、噻虫嗪、异丙威、噻虫胺的抗性均达到中等水平抗性,抗性倍数(resistance ratio,RR)分别为21.88~95.38,10.91~69.36,13.00~57.23和23.11~39.54倍;而对啶虫脒和醚菊酯仍处于敏感阶段,RR分别为0.47~0.75和0.41~0.85倍。【结论】褐飞虱对吡虫啉和噻虫嗪的抗性较高,可能与近年来广泛地大量使用有关。本研究的抗性动态监测结果对贵州稻区褐飞虱的杀虫剂种类调整及施药策略等具有重要指导作用。     

褐飞虱核受体基因NlE75的分子特性和功能分析

【目的】蜕皮激素通过信号级联反应调节昆虫的蜕皮和变态过程，而核受体基因E75是信号通路的早期响应基因。本研究旨在分析褐飞虱Nilaparvata lugens NlE75的分子特性及生物学功能，为褐飞虱的防治和新农药的开发提供新分子靶标。【方法】本研究基于序列比对和同源检索以及褐飞虱转录组数据获得NlE75的cDNA序列，并利用RT-PCR和RACE技术对其进行cDNA克隆；利用生物信息学软件预测分析NlE75编码蛋白的结构特性；利用MEGA5.0邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统进化树。利用RT-qPCR检测NlE75及其转录本在褐飞虱不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和成虫)、5龄若虫不同组织(头、胸、腹、表皮、翅芽、脂肪体、中肠和足)中和3龄若虫被注射0.2μg/头20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)后的表达谱。通过注射法进行RNAi敲降褐飞虱3龄若虫20E合成关键基因NlCYP314A1后，利用RT-qPCR检测3龄若虫中NlE75的表达量；通过注射法进行RNAi下调3和5龄若虫NlE75及3龄若虫中其转录本的表达后，利用RT...     

褐飞虱过氧化物酶基因NlPOD1的克隆、鉴定及功能分析

【目的】探明褐飞虱Nilaparvata lugens过氧化物酶基因NlPOD1的分子特性、表达模式和生物学功能。【方法】基于褐飞虱转录组数据,利用PCR技术克隆获得NlPOD1基因全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其序列特征;通过qRT-PCR技术检测NlPOD1在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(头部、脂肪体、血淋巴和肠道)中的表达水平,以及不同微生物(大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae)（1×10⁷/mL）注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式;利用RNAi技术沉默褐飞虱 5 龄若虫NlPOD1基因,并通过生物测定分析NlPOD1基因沉默和接种金龟子绿僵菌(1×108/mL)后褐飞虱的存活率及致死中时(LT₅₀)。【结果】获得褐飞虱NlPOD1全长 cDNA 序列(GenBank登录号: MZ682107),其开放阅读框长2 049 bp,编码682个氨基酸,含有一个典型的动物亚铁血红素过氧化物酶结构域(An_peroxidasedomain),且N端包含一段由29个氨基酸残基组成的信号肽。系统发育分析表明,NlPOD1与半翅目其他昆虫的POD亲缘关系较近,其中与茶翅蝽Halyomorpha halys POD亲缘关系最近。发育表达谱结果表明,NlPOD1在褐飞虱不同发育阶段均有表达,其中卵期表达量最低,5龄若虫中表达量最高;组织表达谱结果表明,NlPOD1在褐飞虱5龄若虫不同组织中均有表达,且肠道和血淋巴中的表达量显著高于头部和脂肪体中的;微生物诱导表达模式表明,与注射PBS的对照组相比,大肠杆菌诱导48 h内各时间点NlPOD1在褐飞虱5龄若虫中的表达量显著上调,而在金黄色葡萄球菌和金龟子绿僵菌诱导下,NlPOD1表达量均呈现先上调后回稳的态势。RNAi分析结果显示,显微注射dsNlPOD1可显著抑制NlPOD1的表达水平。通过RNAi抑制NlPOD1表达后褐飞虱5龄若虫存活率不变,但注射dsNlPOD1联合金龟子绿僵菌感染对褐飞虱5龄若虫的LT₅₀(4.5 d)显著低于注射dsGFP联合金龟子绿僵菌感染的对照组的LT₅₀(5.4 d),说明沉默NlPOD1后褐飞虱对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力显著降低。【结论】NlPOD1在褐飞虱病原防御过程中发挥重要作用,可作为开发RNAi和病原真菌联合介导的褐飞虱防治技术中的一个潜在靶标。     

灰飞虱内生病毒HiPV外壳蛋白VP1多克隆抗体的制备及在病毒检测中的应用

【目的】前期发现水稻条纹病毒(rice stripe virus, RSV)可与介体灰飞虱Laodelphax striatellus体内的HiPV病毒(Himetobi P virus, HiPV)互作。本研究旨在制备HiPV外壳蛋白VP1的多克隆抗体,并评估其在HiPV病毒检测中的可用性,以为深入研究HiPV-RSV和HiPV-灰飞虱的互作机制提供技术支持。【方法】以RT-PCR方法从灰飞虱成虫体内扩增HiPV主要外壳蛋白基因VP1,然后将VP1基因亚克隆至原核表达载体pET-32a中,构建表达载体pET-VP1。将重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3),经IPTG诱导、Ni²⁺-NTA亲和层析纯化,获得重组蛋白,免疫新西兰大白兔,制备抗体。【结果】从灰飞虱体内克隆到774 bp的HiPV外壳蛋白基因VP1,经原核表达、纯化,获得分子量约47.5 kD的融合蛋白,免疫新西兰大白兔后获得VP1多克隆抗体。该抗体间接ELISA效价达1∶819 200,与HiPV外壳蛋白VP1有特异性反应,而与灰飞虱蛋白无交叉反应。利用该多克隆抗体建立了检测单头灰飞虱成虫体内HiPV的Western blot和免疫捕获RT-PCR方法,检测结果显示HiPV在携带和不携带RSV的灰飞虱高亲和性群体内均广泛存在。【结论】利用制备的HiPV的VP1多克隆抗体可特异性检测灰飞虱体内HiPV。本研究为HiPV病毒的快速检测以及HiPV-RSV互作、HiPV-灰飞虱互作研究提供了技术支持。     

纳米粒子载体对灰飞虱RNAi效率的影响

【目的】筛选针对灰飞虱Laodelphax striatellus RNAi的dsRNA高效纳米递送载体。【方法】使用壳聚糖、碳量子点(carbon quantum dot, CQD)和lipofectamine 2000作为代表性纳米粒子,分别与dsRNA进行混合,形成稳定的3种不同复合颗粒,利用光谱法检测其dsRNA装载率。以灰飞虱膜结合型海藻糖酶基因LsStre为靶标基因来测试3种纳米粒子的RNAi效率。用不同纳米粒子包裹的dsLsStre喂食后,通过荧光实时定量PCR(qPCR)检测喂食后2 d灰飞虱2龄若虫中LsStre mRNA表达水平,并检测和计算灰飞虱2龄若虫在6 d内的校正死亡率,以裸dsLsStre引起的2龄若虫死亡率为对照,评价3种纳米载体对LsStre的RNAi增效作用。【结果】3种纳米载体均能负载dsEgfp,且这3种纳米载体复合dsEgfp的效率均在95%以上。3种纳米材料对灰飞虱2龄若虫的毒性均较弱。同未用纳米粒子包裹的裸dsLsStre喂食组(对LsStre表达量的抑制率为46%)相比,壳聚糖和CQD能够显著提高LsStre的RNAi效率(对LsStre表达量的抑制率分别为78%和84%),而lipofectamine 2000不能显著提高LsStre的RNAi效率(抑制率为52%)。壳聚糖和CQD可以有效提高喂食dsLsStre对灰飞虱2龄若虫的致死效应,在连续喂食6 d后,灰飞虱2龄若虫的校正死亡率分别达到76%和82%,与直接用裸dsLsStre处理的对照组校正死亡率(35%)相比,增效系数分别达到2.17和2.34,lipofectamine 2000的增效能力最弱,其与dsLsStre的复合颗粒处理引起灰飞虱2龄若虫死亡率为38%,增效系数为1.09。【结论】壳聚糖和CQD纳米载体能够显著提高灰飞虱对于喂食dsRNA的敏感性,而lipofectamine 2000的RNAi增效作用较弱。研究结果有助于评价纳米载体在灰飞虱RNAi中的增效作用,为进一步开发和筛选有效的RNAi纳米载体,实现害虫绿色防控,提供了理论依据和应用策略。