大口黑鲈IGFBP1基因SNPs的筛选及与生长性状的关联分析

本研究使用PCR技术扩增得到2 743 bp长度的大口黑鲈IGFBP1基因序列,序列含4个外显子和3个内含子,编码263个氨基酸。采用直接测序法在IGFBP1基因上筛选到4个SNPs位点,分别位于该基因核苷酸序列中的第147个、第791个、第2 436个和第2 676个碱基,其中2个位点位于外显子上,A-141C位点发生了同义突变,C-791T发生了错义突变,随机检测同批430尾实验个体中4个位点的基因型,均符合Hardy-Weinberg定律。其中A-2436G和C-2676T位点完全连锁,组成单倍型标记H1。分析H1标记中的AB和AA基因型实验群体,显示两者在尾柄长、全长指标上存在显著差异(p0.05)。综合分析表明,H1标记可用于大口黑鲈分子辅助育种研究。     

禁食和复投喂对大口黑鲈胆囊收缩素及其受体基因表达的影响

为研究大口黑鲈(Micropterus salmoides) 胆囊收缩素(Cholecystokinin, CCK)和其受体(Cholecystokinin receptor, CCKR)基因在摄食活动中的功能, 研究通过克隆得到CCK1、CCK2、CCK1R和CCK2R基因的编码区序列, 其长度分别为414、387、1368和1359 bp, 分别编码137、128、455和452个氨基酸。荧光定量结果表明CCK1和CCK2基因均在脑组织中高表达, 其次为肠道组织, 而CCK1R和CCK2R基因分别在胆囊和脑组织中高表达。在摄食后24h内, CCK1、CCK2、CCK1R和CCK2R基因的相对表达量呈先升高后下降趋势, 其中CCK1、CCK1R和CCK2R基因在摄食后3h相对表达量达到最高值, 而CCK2基因在摄食后12h相对表达量达到最高值(P<0.05)。禁食过程中CCK1、CCK1R和CCK2R基因相对表达量在禁食14d时显著升高(P<0.05)。复投喂后CCK1、CCK1R和CCK2R基因的相对表达趋势与餐后表达趋势相似, 呈先升高后降低趋势。但在禁食和复投喂过程中CCK2基因相对表达量并无显著变化。综上所述, 研究结果推测CCK1基因可能与CCK1R、CCK2R基因结合, 作为饱腹信号因子, 通过抑制食欲调控大口黑鲈摄食、消化等生理过程; 而CCK2基因可能作为短期食欲因子调节摄食活动。研究结果可为大口黑鲈摄食活动调节提供理论依据。     

大口黑鲈MyoD cDNA的克隆和序列分析

MyoD基因是生肌调节因子MRFs家族的主要成员之一,是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因之一,对骨骼肌的形成和分化起主要作用。采用RT-PCR和RACE方法获得大口黑鲈MyoD基因的cDNA序列长为1 157bp,其中3'非编码区为314bp,开放阅读框长843bp,编码280个氨基酸。结构分析表明该肽链无信号肽,第1～110个氨基酸为MyoD基因的Basic区(碱性氨基酸区),第124～167个氨基酸为MyoD基因的HLH结构(螺旋环螺旋结构)。通过对比分析已知GenBank中其它脊椎动物MyoD基因发现,该基因编码的氨基酸肽链随动物由低等向高等进化有加长的趋势,且核苷酸以及推测的氨基酸同源性和动物之间的亲缘关系相一致;大口黑鲈MyoD基因的克隆为研究该基因打靶和鱼类肌肉发育调控机理奠定基础。     

大口黑鲈生长相关标记的聚合及其效果分析

为了解与大口黑鲈(Micropterus salmoides)生长性状相关分子标记优势基因型的聚合效果, 研究选择先前已获得的13个与生长性状相关的分子标记, 位于PCK1、HSBP1、FOXO3b、MYH、HSC70-1、CTSB、HBP、POU1F1、PACAP、IGF-I、ghrelin、ApoproteinA1和MSTN基因上。在40尾亲本群体中对各标记的基因型进行检测, 选择可聚合优势基因型最多的2对亲本分别构建家系。在9月龄时, 从2个家系子代中分别采集305尾和266尾个体进行生长性状测量和各标记的基因型分析。家系1子代个体中含生长相关优势基因型的数量为0—6个, 对应的个体数依次为8、26、75、74、76、35和11, 对应的平均体质量依次为185.03、196.46、198.73、212.59、222.66、235.54和261.27 g。家系2子代个体中含生长相关优势基因型的数量为1—6个, 对应的平均体质量依次为184.43、213.17、243.77、249.98、252.11和266.00 g。个体中生长相关优势基因型聚合数量多少与生长性状呈正相关, 提示通过对生长相关优势基因型进行聚合可获得生长性状优良的大口黑鲈, 为大口黑鲈分子标记辅助育种的应用提供科学依据。     

大口黑鲈GHRH-LP和GHRH基因序列同源性、基因结构和时序表达研究

促生长激素释放激素(Growth hormone releasing hormone,GHRH)是生长激素释放调控的重要因子。过去人们一直将鱼类的促生长激素释放激素样多肽(Growth hormone releasing hormone like peptide,GHRH-LP)误认为是GHRH,直到最近才分离出GHRH基因。为了了解GHRH和GHRH-LP基因的结构特征及表达差异,研究克隆了大口黑鲈(Micropterus salmoides)GHRH和GHRH-LP基因,同时应用实时定量PCR技术研究了这两个基因的组织表达及发育时序表达情况。结果显示,大口黑鲈GHRH的成熟肽由27个氨基酸残基组成,GHRH-LP的成熟肽由44个氨基酸残基组成。两个基因均由5个外显子和4个内含子组成,但两者成熟肽编码区在外显子上的分布有明显不同。与其他脊椎动物比较,GHRH同源性为74%100%,而GHRH-LP同源性为41%96%,两者间具有一定的相似性(37%63%)。GHRH基因仅在前脑和延脑中表达,而GHRH-LP基因在中枢神经系统及外周组织中均有表达;在胚胎发育过程中GHRH在神经胚后期检测到表达,其表达水平在仔鱼出膜1d后显著提高,而GHRH-LP在囊胚期及后续发育过程中均检测到表达。基因结构、序列同源性及表达谱研究均表明,GHRH和GHRH-LP存在显著差异,应为具有不同功能的两个基因。       

大口黑鲈肌肉生长抑制素多克隆抗体的制备及其对仔鱼生长影响

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)是抑制肌肉生长和发育的生长调控因子.将大口黑鲈(Micropterus salmoides)MSTN成熟肽cDNA改造后克隆到pET32a(+)载体上,构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中进行表达.SDS-PAGE检测表明重组表达的融合蛋白分子大小约28 kD,含量为菌体总蛋白的34%.用纯化后的表达蛋白免疫新西兰兔制备抗大口黑鲈MSTN多克隆抗体,Western blot和ELISA检测证实所获得的抗体可与抗原蛋白特异性结合,抗体的效价为1: 62 500.将获得的抗体显微注射到大口黑鲈的受精卵卵黄区,结果显示具有促进仔鱼生长的作用.     

大口黑鲈微卫星DNA指纹图谱的构建和遗传结构分析

以国内目前养殖的大口黑鲈[Micropterus salmoides(Lacépède)]群体(CH)、2009年引进的佛罗里达亚种(FL-09)、2010年引进的佛罗里达亚种(FL-10)、2010年引进的北方亚种(NT-10)为实验材料,应用43个微卫星DNA标记对这4个大口黑鲈群体进行遗传检测,构建了各群体的微卫星DNA指纹图谱,并对其遗传结构进行分析。结果显示:CH、FL-09、FL-10和NT-10群体的平均等位基因数(A)分别为2.58、3.74、3.70和4.21,平均期望杂合度(He)分别为0.4549、0.4896、0.5010和0.6138,平均多态信息量(PIC)分别为0.3786、0.4443、0.4566和0.5546,表明国内目前养殖的大口黑鲈群体遗传多样性水平远远低于国外新引进的大口黑鲈群体。利用UPGMA法对4个群体进行聚类,结果 FL-09和FL-10聚为一支,遗传距离为0.0506;NT-10和CH聚为另一支,遗传距离为0.4244,推测FL-09和FL-10两个佛罗里达亚种属于相同的群体,而NT-10和CH两个北方亚种来自不同的群体,甚至不同的水系。同时从指纹图谱中,筛选到5个特异的微卫星标记(JZL114、MiSaTPW11、Lma120、Mdo6和Msal21),可以鉴别FL、NT-10和CH群体,其中MiSaTPW11和Msal21这两个标记组合可以完全鉴别这3个群体。将5个特异性微卫星标记的图谱数据转化成计算机可以识别的数码指纹,可以方便应用于大口黑鲈不同群体及其杂交种的鉴定。研究结果可以为我国大口黑鲈种质资源保存、品种鉴定和良种选育提供理论依据。     

大口黑鲈转录组SNPs筛选及其与生长的关联分析

为开发人工饲料代替冰鲜杂鱼养殖大口黑鲈的分子标记,以食用冰鲜鱼和配合饲料的同批大口黑鲈为研究材料,利用RNA-Seq（RNA sequencing）技术挖掘SNPs（Single nucleotide polymorphisms）标记,并以关联分析筛选可用于育种的候选标记。转录组进行测序共获得174 M数据,8681个SNPs位点。挑选其中具有表达差异的50个SNPs位点进行SNaPshot分型,结果39个分型成功,其中有4个为假阳性,通过转录组技术开发出SNPs标记35个,成功率为70.0%。为进一步检验这些标记是否可用于评估驯食饲料的大口黑鲈选育研究,研究以327尾摄食人工配合饲料的大口黑鲈为试验材料,SPSS软件进行一般线性模型分析SNPs的不同基因型与生长性状的相关性,结果显示有2个SNPs位点与体质量、全长和体高等生长性状存在显著相关性（P<0.05）,可作为候选标记用于大口黑鲈的分子辅助育种。由于转录组数据直接反应基因的表达情况,从中挖掘与性状相关的优势基因型与分子标记的成功率高,效果较好。同时也为解决大口黑鲈选育研究中标记缺乏提供了有效途径,为选育提供遗传依据、加速育种进程。     

大口黑鲈生长性状的微卫星DNA标记筛选

本研究在人工养殖的大口黑鲈（Micropterus salmoides L.）群体中对40个微卫星位点进行扩增, 运用卡方检验分析微卫星位点在极端大个体组和极端小个体组中的基因型分布差异, 选择差异显著的16个微卫星位点对大口黑鲈随机群体进行基因型与性状的关联分析, 同时分析群体的遗传多样性。结果表明: 关联分析得到7个微卫星位点(JZL60、JZL67、JZL72、JZL124、MiSaTPW76、MiSaTPW117和MiSaTPW173)与体重、体长和体高显著或极显著相关(P<0.05或P<0.01), 同时对差异显著的位点进行不同基因型间与生长性状的多重比较, 找到了与体重、体长和体高性状相关的最有利基因型为JZL60位点的AA、JZL67位点的BB、JZL72位点的AC、MiSaTPW76位点的BB和MiSaTPW117位点的BC。应用这16个微卫星位点对随机群体进行遗传多样性分析, 共检测到47个等位基因,平均等位基因2.938个,每个位点检测到的等位基因数为2~5个、群体的平均观测杂合度、平均期望杂合度和平均多态信息含量分别为0.515、0.500和0.445, 表明该群体遗传多样性处于中等水平。