凡纳对虾对虾素基因的克隆与抗菌性质分析

目的:抗菌肽分子在无脊椎动物的先天免疫系统中,发挥着重要的抗菌作用;为了不断完善无脊椎动物先天免疫系统的抗菌机制,作者以凡纳对虾的对虾素基因作为研究对象,进行分子生物学方面研究。方法:以凡纳对虾的对虾素基因———penaeidin 4抗菌肽基因(Lva-pen 4)作为研究对象,主要进行了基因克隆、氨基酸序列比对、系统进化关系分析以及分子结构初步预测等研究内容。结果:Lva-pen 4的cDNA序列全长624bp,开放阅读框包括204bp,演绎67个氨基酸残基;在Lva-pen 4分子一级结构的氨基酸序列中,存在一个对虾素结构域,其中包括8个保守存在的半胱氨酸残基和6个脯氨酸残基。结论:根据分子结构的分析结果,推测Lva-pen 4是一个重要的免疫反应相关基因,在先天免疫系统中发挥着重要作用。     

东北林蛙皮肤中一类新抗菌肽cDNA的克隆及成熟肽的预测

为进一步研究和开发高效广谱天然抗生素的抗菌肽,本文克隆东北林蛙(Rana dybowskii)的抗菌肽基因,并预测其成熟肽的有关性质。根据蛙属抗菌肽信号肽末端序列设计简并引物,以RT-PCR技术扩增皮肤中抗菌肽的cDNA,并进行克隆测序。用生物信息学软件分析cDNA序列特点,预测成熟肽的理化性质。研究发现一种长度为28个氨基酸残基的新抗菌肽dybowsin-1,该肽具有Rana box结构;与已发现的抗菌肽仅有35%的同源性;理论等电点在9.70-10.01之间;均呈阳离子性;从第3或4个氨基酸开始到第16个氨基酸形成α-螺旋结构,极性氨基酸位于螺旋轮的一侧,非极性氨基酸位于螺旋轮的另一侧;具有N-端疏水、C-端亲水的两亲性。一个个体表达5条cDNA序列编码3种不同的dybowsin-1分子,显示出该抗菌肽表达的多样性。序列分析显示,该抗菌肽可能由多基因座位编码。     

中国林蛙皮肤抗菌肽基因的cDNA克隆及抗菌、抗癌和溶血活性的测定

采用RT-PCR和3￠RACE方法, 从中国林蛙皮肤总RNA中克隆出了6条编码不同抗菌肽前体的cDNA序列, 分别命名为: preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb、preprotemporin-1CEc、preprobrevinin-1CEa、preprobrevinin-1CEb和preprochensinin-1。cDNA碱基序列全长为289~315 bp, 编码59~65个氨基酸。6个抗菌肽前体由3部分结构域组成: 22个氨基酸残基组成的信号肽、多个酸性氨基酸残基组成的中间序列、高度变异的成熟肽。preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb和preprotemporin-1CEc属于temporin-1家族抗菌肽前体, 具有肽链短, C-端酰胺化的特点; preprobrevinin-1CEb和preprobrevinin-1CEa属于brevinin-1家族抗菌肽前体, 在肽链的C-端含有RANA盒结构, 可在2个半胱氨酸残基间形成二硫键, 组成7肽环; preprochensinin-1在已知多种数据库中没有发现序列同源的多肽, 被鉴定为新抗菌肽。人工合成temporin-1CEa、temporin-1CEb、brevinin-1CEa和chensinin-1四种中国林蛙皮肤抗菌肽, 活性检测结果表明: 它们对金黄葡萄球菌等3种革兰氏阳性细菌的生长具有明显抑制作用, 同时抑制乳腺癌MCF-7细胞和宫颈癌HeLa细胞生长。     

凡纳滨对虾ANT2 基因的克隆及低温表达谱分析

为研究凡纳滨对虾适应低温的分子机理, 实验对从低温处理凡纳滨对虾抑制性消减文库中筛选出的一个360 bp EST 序列进行了研究。首先, 同源比对显示该EST 片段与其他物种的ANT2 基因高度同源, 命名为凡纳滨对虾ANT2 基因(LVANT2); 其次, 通过构建凡纳滨对虾肝胰腺全长cDNA 文库, PCR 扩增获得LVANT2 基因的全长cDNA1540 bp, 其中包括1011 bp 的完整开放阅读框, 编码336 个氨基酸残基。然后, 对基因进行了不同组织和低温处理的表达谱分析: (1)组织表达谱的结果显示, 该基因在凡纳滨对虾肌肉组织中表达量最高; (2)在不同低温处理下的表达结果显示, 该基因在15℃处理下基因表达量发生显著变化, 13℃开始呈下调表达, 11℃时表达量又升高; 13℃低温处理不同时间发现该基因在12h 内表达量发生显著变化,48h 后表达量最高。LVANT2 基因的低温诱导表达模式说明其可能在凡纳滨对虾低温适应中发挥作用       

凡纳滨对虾MT基因序列及其在卵巢发育和低温胁迫中的表达分析

在低温处理仔虾全长cDNA文库的筛选测序中, 获得凡纳滨对虾(Litopenaeus vannmei)金属硫蛋白基因全长cDNA序列, 该序列含有425个碱基, 包含177 bp开放阅读框, 上游98 bp的非编码区及下游150 bp 的非编码区, 编码58个氨基酸, 其中半胱氨酸含量丰富, 富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys 结构。多序列比对表明, 凡纳滨对虾MT蛋白序列与美洲螯龙虾(Homarus americanus)MT蛋白序列具最高同源性72.4%。Real-time PCR结果表明, 凡纳滨对虾MT基因在卵巢组织中呈优势表达, 在不同发育期的卵巢中的表达量都很高, 在低温处理凡纳滨对虾肝胰腺组织中上调表达。实验所得结果为研究凡纳滨对虾金属硫蛋白基因在生殖发育和低温应激中的功能提供了参考。       

猪T细胞受体γ链基因的克隆及生物信息学分析

目的:克隆猪T细胞受体γ链(pTCR-γ)基因,用以研究猪T细胞受体分子结构与功能。方法与结果:以GenBank上登载的pTCR-γ基因为参考序列,用RT-PCR法从猪外周血淋巴细胞中克隆pTCR-γ基因。序列分析表明,pTCR-γ基因开放读框为1026bp,编码341个氨基酸残基,含有由23个氨基酸残基构成的信号肽序列;与参考序列相比,在核苷酸和推导氨基酸序列上的同源性分别为95.6%和88.8%;系统进化分析发现,该基因与绵羊、恒河猴、人、马、牛的同源性相对较高,与褐鼠、家犬、家鼠、家猫的同源性次之,而与禽类、鱼类的同源性最低;生物信息学结构预测表明猪T细胞受体γ链含2个结构域,其中1个为IG_LIKE1结构域(IGv结构域),由第14～114位共101个氨基酸残基组成;另一个为IG_LIKE2结构域(IGc结构域),由第143～238位共96个氨基酸残基组成。结论:克隆并应用生物信息学技术分析了猪T细胞受体γ链基因序列及编码蛋白的结构特征,为进一步研究γ链的结构与功能奠定了基础。     

眼镜王蛇泛素融合蛋白基因和核糖体蛋白L30基因的克隆及分析

从广西产眼镜王蛇（Ophiophagus hannah）毒腺中抽提总RNA,经mRNA纯化后构建眼镜王蛇毒腺cDNA文库。从所构建的cDNA文库中,随机筛选200个克隆测序,得到两个在进化上高度保守的基因：泛素融合蛋白基因（GenBank登录号为AF297036）和核糖体蛋白L30基因（GenBank登录号是AF297033）。前者cDNA的开放阅读框为387bp,后者为348bp。前者编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;后者编码115个氨基酸残基组成的核糖体蛋白L30前体。由cDNA序列推导出的氨基酸序列分析表明,泛素融合蛋白前体包括N-末端的泛素结构域（76个氨基酸残基）和C-末端的核糖体蛋白L40结构域（52个氨基酸残基）。该蛋白为一高碱性蛋白,C末端含有一个“锌指”模式结构。与16个物种比较的结果表明,眼镜王蛇与脊椎动物的泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性。     

斑节对虾α-淀粉酶基因的克隆及其表达分析

为了研究斑节对虾α-淀粉酶基因的结构和生物学功能, 根据原实验室构建的斑节对虾(Penaeus monodon) cDNA文库得到的EST序列, 利用RACE技术获得了斑节对虾α-淀粉酶基因(PmAmy)的cDNA全长序列。该基因序列全长2465 bp, 包括2175 bp的开放阅读框, 编码724个氨基酸, 分子总量为78.9 kD, 理论等电点为4.66。PmAmy包含一个α-淀粉酶家族保守的A结构域(Thr34-Ser410)和一个C结构域(Glu420-Ala496)。PmAmy氨基酸序列与其他物种的相似性为47%—99%, 利用PmAmy构建的进化树显示斑节对虾和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的亲缘关系最近。基因表达结果显示PmAmy在肝胰腺组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。斑节对虾PmAmy基因在卵巢发育的过程中均有表达, 表达量有所变化, 虽然没有发现显著性的差异(P=0.09)。斑节对虾PmAmy在整个生长阶段的检测中都有表达, 其中幼体发育过程中存在显著性差异, 糠虾时期PmAmy表达量显著高于无节幼体、溞状幼体和仔虾时期(P<0.05)。以上实验结果初步说明了PmAmy可能与斑节对虾的幼体发育相关。     

日本对虾(Marsupenaeys japonicus)HsP70基因cDNA的克隆与序列分析

根据中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)Hsp70的cDNA序列及日本对虾(Marsupenaeusjaponicus)Hsp70cDNA序列片段设计引物,用RT-PCR方法,从经热休克处理的日本对虾鳃总RNA中克隆到长1992bp的Hsp70cDNA序列,包括长1959bp的完整编码序列(CDS)。根据编码序列推导出相应的652个氨基酸,与其他真核生物Hsp70家族成员进行同源性比较,发现与凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、斑节对虾(PinaeusmonodonFabricius)、中国明对虾(Penaeuschinesis)的相似度分别为99.5%、99.4%、99.4%,与日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)和罗氏沼虾(M.rosenbergii)的相似度分别为93.7%和92.9%,与虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、原鸡(Callusgallus)、家鼠(Musmusculus)和人(Homosapiens)的相似度为89.2%、85.4%、88.3%和88.3%,表现出较高的保守性。分析表明所得到的日本对虾Hsp70是一种Dnak亚家族类型的细胞质Hsp70,拥有完整的N端ATP酶结构域(约45kDa)、底物肽结合结构域(18kDa)及C端结构域(10kDa)。以上结果说明我们所得到的序列是一条包含完整CDS的Hsp70基因序列。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)盐度调控相关基因CLCA1的克隆及表达分析

钙激活氯离子通道调节剂(calcium-activated chloride channel regulator,CLCA)为一类金属蛋白酶依赖家族,在哺乳动物上皮组织杯状细胞的粘液产生和粘液平衡中起重要作用.为了探究CLCA1基因在凡纳滨对虾渗透压中的作用机制,本研究采用RACE技术在凡纳滨对虾中克隆出了CLCA1基因,该基因总长度为3129 bp,5'端非编码区长度为175 bp,3'端非编码区长度为107 bp,开放阅读框ORF长度为2847 bp,共编码984个氨基酸,有1个跨膜区域,膜外有VMA结构域.与其他物种氨基酸序列比对结果显示,凡纳滨对虾CLCA1氨基酸与其他物种相似性都较低,相似度最高的为刀额新对虾(Procambarus clarkii) CLCA2氨基酸序列,为47.83％.RT-qPCR结果显示,CLCA1基因在凡纳滨对虾各组织中均有表达,其中肠道、肝胰腺和鳃中的表达量较高;对不同盐度下凡纳滨对虾4个组织中CLCA1基因的定量结果显示,随着盐度的下降,CLCA1基因的表达量在4个组织中呈下调趋势,表明CLCA1基因与凡纳滨对虾的渗透压调节相关.本研究初步阐明了CLCA1基因的理化性质,对CLCA1基因在凡纳滨对虾体内各组织和不同盐度下各组织的表达定量可为CLCA1基因在今后甲壳动物的渗透压调节及免疫调节的研究提供基础支持.     

A double WAP domain (DWD)-containing protein with proteinase inhibitory activity in Chinese white shrimp, Fenneropenaeus chinensis

The whey major component, whey acidic protein (WAP), has one or more WAP domains characterized by a four-disulfide core (4-DSC) structure. These kinds of proteins are involved in multiple functions, including proteinase inhibitor activity, antimicrobial activity, ATPase inhibitor activity, and regulatory function in cell proliferation. Recent research indicates that WAP domain-containing proteins play an important role in the innate immunity of crustaceans. In this study, a novel double WAP domain (DWD)-containing protein named Fc-DWD was found for the first time in Chinese white shrimp, Fenneropenaeus chinensis. The open reading frame of Fc-DWD encodes a protein of 117 amino acids, including a signal peptide of 16 amino acids and two WAP domains. The predicted molecular mass of the mature protein is 12.78 kDa with an estimated pI of 8.49. The first WAP domain, named WAP 1, composed of 49 amino acids locates in the amino-terminal of Fc-DWD, and the second WAP domain, named WAP 2, composed of 45 amino acids locates in the carboxy-terminal. Fc-DWD mRNA was upregulated in hemocytes, hepatopancreas, gills, and stomach of bacteria- and virus-challenged shrimp. Results of the binding assay showed that rFc-DWD could bind to both Gram-negative bacteria and Gram-positive bacteria. rWAP 1 could only bind to Gram-positive bacteria, but rWAP 2 could bind to both Gram-negative and positive bacteria. Moreover, rFc-DWD exhibited proteinase inhibitory activity against the secretory proteinase(s) from Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa. All of these findings suggest that Fc-DWD may play an important role in enabling the host defense to execute its proteinase inhibitory activity against pathogens.     

A novel antimicrobial peptide from salivary glands of the hard tick, Ixodes sinensis

A novel antimicrobial peptide named as ixosin was isolated from the salivary glands of the hard tick, Ixodes sinensis, by gel filtration, ion exchange chromatography and reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). Its amino acid sequence was determined as GLHKVMREVLGYERNSYKKFFLR by Edman degradation and its molecular weight was 2870.5 analyzed by fast atom bombardment (FAB) mass spectrometry. This is the first antimicrobial peptide from ticks that lacks cysteine in its primary structure. The cDNA encoding ixosin was cloned by cDNA library screening. The predicted protein from the cDNA sequence composed of 79 amino acids including mature ixosin. Purified ixosin exerted its antimicrobial activities against bacteria and fungi. No similarity was found by BLAST search to any database entries and, thus, our findings describe a novel antimicrobial peptide.     

Snake venom-like waprin from the frog of Ceratophrys calcarata contains antimicrobial function

A 255-bp cDNA encoding an 84-amino acid residue (aa) precursor protein containing 8 half-cysteines was cloned from the skin of the frog, Ceratophrys calcarata. By sequence comparison and signal peptide prediction, the precursor was predicted to release a 63-aa mature peptide with amino acid sequence, NVTPATKPTPSKPGYCRVMDELILCPDPPLSKDLCKNDSDCPGAQKCCYRTCIMQCLPPIFRE. The mature was named ceratoxin. Ceratoxin shares significant sequence similarity with the toxin family of waprins containing the whey acidic protein-type (WAP) four-disulfide core domain found in snake venoms. Antimicrobial and trypsin-inhibitory abilities of recombinant ceratoxin were tested. Recombinant ceratoxin showed strong antimicrobial activities against wide spectrum of microorganisms including Gram-negative and Gram-positive bacteria and fungi. It had no serine protease-inhibitory activity. The current results suggested that the snake venom-like waprin with antimicrobial activities in the frog skin plays a role in innate immunity.     

Molecular cloning, characterization and expression of a serine protease with clip-domain homologue from scallop Chlamys farreri

Serine proteases play critical roles in a variety of invertebrate immune defense responses, including hemolymph coagulation, antimicrobial peptide synthesis, and melanization. The first mollusk serine protease with clip-domain (designated CFSP1) cDNA was obtained from the scallop Chlamys farreri challenged with Vibrio anguillarum by randomly sequencing a whole tissue cDNA library and rapid amplification of cDNA ends (RACE). The full-length cDNA of the C. farreri serine protease was 1211bp, consisting of a 5'-terminal untranslated region (UTR) of 72bp, a 3'-terminal UTR of 77bp with a canonical polyadenylation signal sequence AATAAA and a poly (A) tail, and an open reading frame of 1062bp. The CFSP1 cDNA encoded a polypeptide of 354 amino acids with a putative signal peptide of 19 amino acids and a mature protein of 335 amino acids. The deduced amino acid sequence of CFSP1 contained an amino-terminal clip domain, a low complexity region, and a carboxyl-terminal serine protease domain. CFSP1 mRNA was mainly expressed constitutively in the hemocytes and was up-regulated and increased 2.9- and 1.9-fold at 16h after injury and injection of bacteria.     

泥鳅MnSOD基因的电子克隆及序列分析

目的:电子克隆并分析泥鳅MnSOD基因.方法:通过电子克隆泥鳅MnSOD基因的开放阅读框,并对其氨基酸组成、功能结构域、系统进化、信号肽、二级结构、三级结构等信息进行预测分析.结果:通过电子克隆获得泥鳅MnSOD基因的cDNA.该基因的开放阅读框大小为675bp,编码224个氨基酸残基,推导的蛋白质分子量为25kDa,等电点约为8.41,其编码序列与其他物种相比非常保守,与鲤形目淡水鱼的MnSOD在进化上亲缘关系最近.其N端含转运肽,推测它定位于线粒体中.预测泥鳅MnSOD的二级结构及三级结构含有较多的不规则卷曲和α螺旋,其N端为两个长的反平行螺旋,C端则为含有拧成三股折叠片的α+β结构.结论:该研究为泥鳅进一步的分子生物学及抗氧化研究奠定了基础.