大鼠心肌细胞凋亡的保护作用

为探讨p53上调凋亡调制物(p53 up-regulated modulator of apoptosis, PUMA)在大鼠心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenatio, H/R）损伤中的作用,本 研究将靶向PUMA的siRNA（si-PUMA）转染大鼠心肌细胞以建立PUMA沉默表达模型,观察其对心肌细胞H/R损伤的影响.RT-PCR和Western印迹结果表明,最适转染浓度50 nmol/L si-PUMA能靶向抑制H/R损伤心肌细胞的PUMA表达;MTT法检测心肌细胞存活率及培养基乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）活性测定结果发现,si-PUMA 组细胞存活率较H/R 6 h模型组明显提高,培养液中LDH活性显著降低（P<0.01）;分光光度法及Annexin V-FITC/PI联合染色流式细胞凋亡检测结果显示,si-PUMA组caspase-3活性较H/R 6h组明显下调,细胞凋亡率明显降低（P <0.01）;RT-PCR结果 提示,与H/R 6 h组相比,si-PUMA组Bax及Bcl-2表达分别出现显著下调及上调（P <0.05）.以上结果表明,靶向PUMA的siRNA转染能明显增强心肌细胞耐受H/R损伤的能力,对心肌细胞具有较好的保护作用;PUMA介导H/R诱导的心肌细胞凋亡,是心肌缺血/再灌注损伤基因治疗的一个潜在靶点.     

靶向PUMA的siRNA对缺氧/复氧诱导大鼠心肌细胞凋亡的保护作用

为探讨p53上调凋亡调制物(p53 up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)在大鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenatio,H/R)损伤中的作用,本研究将靶向PUMA的siRNA(si-PUMA)转染大鼠心肌细胞以建立PUMA沉默表达模型,观察其对心肌细胞H/R损伤的影响.RT-PCR和Western印迹结果表明,最适转染浓度50 nmol/L si-PUMA能靶向抑制H/R损伤心肌细胞的PUMA表达;MTT法检测心肌细胞存活率及培养基乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性测定结果发现,si-PUMA组细胞存活率较H/R 6 h模型组明显提高,培养液中LDH活性显著降低(P<0.01);分光光度法及Annexin V-FITC/PI联合染色流式细胞凋亡检测结果显示,si-PUMA组caspase-3活性较H/R 6h组明显下调,细胞凋亡率明显降低(P<0.01);RT-PCR结果提示,与H/R6 h组相比,si-PUMA组Bax及Bcl-2表达分别出现显著下调及上调(P<0.05).以上结果表明,靶向PUMA的siRN...     

阿糖胞苷通过抑制HDAC6促进白血病细胞K562凋亡的机制研究

为了探讨阿糖胞苷(Ara-C)通过组蛋白乙酰化酶6(HDAC6)影响人红白血病K562细胞株凋亡作用及可能的机制。采用CCK-8法检测不同浓度的Ara-C作用24h后检测细胞活力;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率;Hoechest染色观察细胞核染色质的形态;RT-PCR检测HDAC1-6基因的表达变化;Western blotting检测HDAC6、p38和p-p38的蛋白表达。CCK-8检测显示不同浓度的Ara-C能抑制K562细胞的活力,并呈浓度依赖性;FCM检测显示Ara-C能增加细胞的凋亡率;Hoechest染色发现Ara-C组细胞呈凋亡形态学改变;RT-PCR检测显示Ara-C能降低HDAC1、HDAC2和HDAC6的表达;FCM和Hoechest染色发现HDAC抑制能增强Ara-C诱导K562细胞凋亡;Western blotting检测发现Ara-C能降低HDAC6,增加磷酸化p38和激活型Caspase-3表达。可见Ara-C能够通过抑制HDAC6激活p38,诱导K562细胞发生凋亡。     

多巴胺受体(DR2)激活对乳鼠心肌细胞缺氧/再灌注损伤的保护作用及其机制

目的:观察多巴胺受体(DR2)激活对乳鼠心肌细胞缺氧/再灌注损伤的影响,并探讨其机制。方法:复制原代培养乳鼠心肌细胞缺氧/再灌注损伤模型,细胞随机分为正常组(Control)、缺氧/再灌注组(H/R)、DR2激动剂组(溴麦角环肽,Bro)、抑制剂组(氟哌啶醇,Hal)。倒置显微镜、透射电镜、流式细胞仪检测细胞凋亡情况;检测细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;RT-PCR和Western blot方法检测心肌细胞促凋亡因子(Cyt C、caspase-3、caspase-8、caspase-9、Fas及Fas-L)及抑凋亡因子(Bc-l 2)mRNA和蛋白表达。结果:与正常组相比,H/R组细胞凋亡率、LDH活性、MDA含量、促凋亡因子及抑凋亡因子表达均增加,唯有SOD活性降低;与H/R组比较,Bro组可减轻或逆转上述指标的变化;Hal组上述指标变化不明显。结论:DR2激活可抑制缺氧/再灌注所致的乳鼠心肌细胞损伤和凋亡,机制与减少氧自由基有关。     

人脑星形细胞瘤中p53，Fas／FasL的表达及其与凋亡关系的研究

目的：探讨细胞凋亡在星形细胞瘤中的作用及其与p53、Fas和Fas配体（Fas ligand,FasL）的关系。方法：对43例星形细胞瘤的标本分别进行HE染色,TUNEL及免疫组化分别标记p53,Fas和FasL。结果：高级别肿瘤和低级别肿瘤间的凋亡无显著差异（P〉0．05）。高级别星形细胞瘤的p53,Fas和FasL的表达均显著高于低级别肿瘤（P均〈0．05）。结论：突变型p53可作为评价星形细胞瘤生物学行为的参考指标。与低级别星形细胞瘤相比,高级别肿瘤中的细胞凋亡受到了抑制,且Fas与FasL的过表达对细胞凋亡可产生明显影响。     

PUMA在结肠癌细胞中的表达及诱导细胞凋亡中的作用

目的:通过5-Fu诱导携带有野生型p53基因的HCT116和携带有突变性p53基因的HT-29两种结肠癌细胞系,比较两株细胞在各时间点凋亡水平和PUMA mRNA表达情况的差异,探讨PUMA对细胞凋亡的作用及诱导其表达的基本途径。方法:用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测不同结肠癌细胞株HT-29、HCT116在抗肿瘤药物5-Fu作用下不同时间点结肠癌细胞株内PUMA mRNA表达水平的差异,用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)荧光染色检测各时间点细胞的凋亡水平,分析其与PUMAmRNA表达水平之间的关系。结果:携带有野生型P53基因的结肠癌细胞株HCT116在5-Fu作用下6h即可出现PUMA mRNA的表达,随着药物作用时间的延长其表达强度增加,并且与细胞凋亡水平呈正相关;含有突变型P53基因的结肠癌细胞株HT-29在5-Fu作用下无PUMA的表达。结论:通过5-Fu诱导细胞凋亡出现的PUMA表达需要野生型P53基因,突变型P53基因无法诱导PUMA的表达。PUMA与结肠癌细胞凋亡水平呈正相关,是一种促凋亡蛋白。     

梓醇对氧糖剥夺诱导PC1 2 细胞凋亡的保护作用

目的：观察梓醇对氧糖剥夺（OGD）诱导PC12细胞凋亡的保护作用。方法：采用Hoechst 33258 DNA染色法,四甲基偶氮唑盐（MTT）检测细胞活性;化学比色法测定乳酸脱氢酶（LDH）的释放量,用流式细胞技术检测细胞凋亡比例以及P53和Bcl-2蛋白。结果：OGD可导致PC12细胞活力明显下降,LDH释放量增加、P53蛋白表达上升,Bcl-2蛋白表达下降。梓醇可明显改善细胞形态结构,显著降低LDH释放量、降低P53蛋白的表达,提高Bcl-2蛋白的表达,降低细胞凋亡率。结论：梓醇通过调节细胞凋亡相关基因的表达而抑制细胞凋亡。     

ASPP2增强结肠癌HCT116细胞对奥沙利铂的化疗敏感性

为研究ASPP2对奥沙利铂诱导的结肠癌细胞系HCT116 p53+/+(野生型)凋亡及周期的影响.利用ASPP2（rAd-ASPP2）及p53腺病毒（rAd-p53）感染HCT116 p53+/+细胞,经奥沙利铂50 μmol/L诱导细胞凋亡及周期改变.Western印迹检测ASPP2及p53的表达水平;MTT法检测ASPP2腺病毒对奥沙利铂诱导的HCT116细胞活性的影响;Calcein/PI吸收试验检测细胞凋亡情况;流式细胞术分析细胞周期分布. 结果显示,ASPP2、p53共同过表达,或者ASPP2单独过表达均能增强奥沙利铂诱导的HCT116 p53+/+细胞增殖抑制,以及S期抑制并伴有细胞凋亡水平的升高;而无奥沙利铂诱导时,ASPP2对HCT116 p53+/+细胞的活性、细胞周期及细胞凋亡水平的影响无统计学意义. 上述结果表明,ASPP2能够增强奥沙利铂诱导HCT116 p53+/+细胞的增殖抑制、细胞周期抑制和细胞凋亡.     

苦参碱对鼻咽癌细胞凋亡及凋亡相关基因p53的表达研究

目的：探讨苦参碱对体外培养的人鼻咽癌细胞增殖、凋亡及凋亡相关基因p53 mRNA和蛋白表达的影响,初步探讨苦参碱诱导人鼻咽癌细胞凋亡的可能机制。方法：采用MTT法检测不同浓度苦参碱（0、0.25、0.5、1、1.5、2 mg/ml）对CNE1、CNE2细胞增殖的影响;采用荧光定量PCR法检测这些浓度的苦参碱处理48 h后CNE2细胞p53 mRNA的变化;Western Blot检测其蛋白的变化情况。结果：MTT结果显示苦参碱具有抑制CNE1、CNE2细胞体外增殖作用,其抑制率存在浓度、时间依赖性。荧光定量PCR及Western Blot检测结果显示,苦参碱抑制CNE2细胞p53 mRNA和蛋白的表达,且亦呈浓度依赖性。结论：苦参碱抑制CNE2细胞的增殖,诱导细胞凋亡,呈现浓度、时间依赖性,其作用与抑制CNE2细胞中p53基因和蛋白的表达密切相关。     

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对人肝癌细胞的凋亡及半胱氨酸天冬酶活性的影响

先前的研究表明,基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 (rBTI) 具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用.为了揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机理,从基因水平上探讨与凋亡有关的分子事件,本研究用不同浓度的 rBTI 体外作用于人肝癌细胞 HepG2 后,采用 MTT 比色法检测抑制剂对epG2 细胞的抑制率,用 DNA 凝胶电泳和细胞核的形态学观察检测 HepG2 细胞的凋亡.结果表明,rBTI 在体外能够明显抑制 HepG2 细胞的增长,并诱导细胞凋亡.另外,细胞凋亡与Bcl-2/Bax mRNA 水平有关.通过 RT-PCR 检测发现,细胞经过rBTI处理后,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA 水平下调,促凋亡基因 Bax mRNA 有所上调,而对照 GAPDH 无变化.对 HepG2细胞中 Fas/Fas 配体及半胱氨酸天冬酶（caspase）的研究证明,细胞经过 rBTI 处理后,对死亡受体 Fas mRNA没有影响; rBTI 可明显激活caspase-3 和 caspase-9 酶活性, 对caspase-8 活性几乎无影响.上述结果表明,rBTI 对HepG2 细胞具有明显的诱导凋亡作用,其诱导细胞凋亡的机制与 caspase-3 依赖性凋亡调节信号通路有关,未涉及 Fas/Fas 配体途径.     

褪黑素对骨肉瘤MG-63细胞的增殖和抑制作用的体外实验研究

目的：研究褪黑素对人成骨肉瘤细胞株MG-63增殖和抑制作用。方法：不同浓度的褪黑素作用于体外培养的MG-63细胞,倒置显微镜下观察MG-63细胞的形态学变化,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同浓度褪黑素对MG-63存活率,细胞计数试剂8（CCK-8）法检测褪黑素对MG-63细胞增殖抑制能力,AnnexinV／PI双染法标记检测细胞凋亡情况以及黏附实验测定细胞黏附能力和培养液中LDH释放量的检测。结果：MTT法检测经褪黑素作用后的MG-63细胞存活率以及细胞黏附能力明显下降,LDH的增加提示MG-63细胞死亡率上升;褪黑素可抑制骨肉瘤细胞株MG-63细胞增殖,5mmol／L的褪黑素对MG-63细胞诱导凋亡作用最明显,不同浓度的褪黑素之间实验结果具有统计学意义。结论：褪黑素能够诱导MG-63细胞凋亡,降低存活率,抑制细胞增殖,是治疗骨肉瘤潜在的靶向药物。     

氨磷汀对氧糖剥夺引起的PC12细胞缺血再灌注损伤的保护作用研究

目的：研究氨磷汀对体外培养的神经元样细胞的缺血再灌注损伤的保护作用,为其最终用于临床脑缺血的治疗打下基础。方法：体外培养的PC12细胞氧糖剥夺4h后复氧复糖,给予不同浓度的氨磷汀处理,20h后镜下观察细胞形态学变化,用MTT和LDH检测细胞活力和损伤情况,免疫荧光染色观察凋亡细胞,流式细胞仪计数凋亡细胞的比例。结果：高浓度氨磷汀对正常PC12细胞活力有抑制作用（P〈0.05）,而低浓度则无。氨磷汀可以提高缺血再灌注损伤PC12细胞活力（P〈0.05）,减少LDH释放（P〈0.05）,保护细胞正常形态,抑制细胞凋亡（P〈0.05）。结论：氨磷汀对氧糖剥夺引起的神经元样细胞的缺血再灌注损伤具有保护作用。     

缺氧环境下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡相关蛋白和mRNA的表达

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）在缺氧环境下凋亡相关蛋白和mRNA的表达。方法将接种的P3细胞置于94％N2、1％O2和5％CO2缺氧箱中37℃孵育,分别于0．5h、1h、2h、4h、6h、8h和12h取出分别应用Annexin V／PI双染法进行流式细胞仪（FCM）分析MSCs凋亡率（Apoptotic Rate,AR）,并同步用免疫细胞化学、western blotting和Rt-PCR等方法检测Bax／Bcl-2,Fas／FasL和Caspase-3蛋白和mRNA的表达。结果1．缺氧前,免疫细胞化学法未检测到Bcl-2、Bax、Fas、FasL和Caspase-3蛋白表达,缺氧0．5h后均可较强表达;2．各缺氧时间点Bcl-2、Bax、Fas、FasL、Caspase-3蛋白和mRNA表达较缺氧前均显著性增高（P均〈0．05）;随缺氧时间延伸,Bcl-2蛋白和mRNA表达不显著增加（P〉0．05）,而Bax、Fas、FasL、Caspase-3蛋白和mRNA表达均显著增加（P均〈0．05）,但缺氧6-12h时间点之间表达均没有统计学意义（P均〉0．05）;3．AR和Bcl-2／Bax蛋白（r1=0．417,P=0．043）及mRNA（r2=-0．435,P=0．040）呈显著负相关,而和Fas（r1=0．639,P=0．025;r2=0．711,P=0．018）、Fas-L（r1=0．581,P=0．022;r2=0．605,P=0．037）、Caspase-3（r1=0．704,P=O．014;r2=0．657,P=0．026）蛋白及mRNA均呈显著正相关。结论在缺氧促进MSCs凋亡的过程中,Bcl-2蛋白和mRNA可能起着保护作用,而Bax、Fas-L、Fas、Caspase-3蛋白和mRNA可能在MsCs凋亡的进程中起着促进作用。     

KDR靶向RNA干扰对MCF一7细胞凋亡的影响

目的：研究KDR靶向RNA干扰对MCF-7细胞凋亡的影响,探讨其可能的机制。方法：采用阳离子脂质体Lipofecta．mine2000TM作为转染试剂将人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF-7,诱RNAi,采用Hoechst33258染色和半定量RT—PCR检测Caspase-3、survivin的mRNA表达及细胞凋亡变化;比色法检测Caspase．3的活性;利用免疫组织化学方法检测survivin的表达,并用图像分析仪分析蛋白表达强度。结果：靶向KDR的siRNA转染MCF-7后,Caspase-3的mRNA表达上调,survivin基因mRNA及蛋白表达水平下调（P〈0．05）。结论：KDRsiRNA通过减少乳腺癌细胞survivin的表达,增加Caspase．3表达来促进肿瘤细胞凋亡,发挥其抗肿瘤作用。     

褪黑素对脂多糖诱导血管内皮细胞损伤的保护机制研究

目的：研究褪黑素（melatonin,MLT）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的保护作用及其机制探讨。方法：不同浓度的褪黑素作用于体外培养的内皮细胞脂质过氧化损伤模型,实验分为5组,即正常对照组（Ctrl）,脂多糖（LPS）氧化损伤组：在培养基中加入2mmol／L的LPS诱导损伤4h;LPS加MLT低剂量（200t~mol／L）组、中剂量（400ixmol／L）组、高剂量（600txmol／L）gai。采用MTT法观察MET对HUVECs活性的影响;用双波长荧光分光光度法测定HUVECs细胞内游离钙离子浓度;检测各组内皮细胞匀浆中丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH·Px）活性;用ELISA法测定培养的细胞上清液中白细胞介素6（IL．6）表达的变化;并测定细胞凋亡率。结果：①LPS作用后血管内皮细胞损伤明显,细胞增殖减少,细胞培养上清液和细胞匀浆中MDA含量、细胞内钙离子浓度和IL．6均升高,SOD、GSH-Px活性下降,凋亡率可达38．9±1．1％,均与正常对照组有统计学差异（P〈0．01）;②加入MET可明显减轻LPS对抗氧化酶SOD、GSH—Px的影响,同时MDA含量、细胞内钙离子浓度和几一6均明显下降,并显著减少凋亡细胞数量,各指标差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：褪黑素可保护和修复LPS引起的血管内皮细胞损伤,其作用途径可能与保护细胞的线粒体,提高了该细胞的抗氧化酶活性,降低细胞内钙离子浓度作用有关。     

间歇低压低氧预处理对心肌缺血／再灌注损伤及ZFP580表达的影响

目的：探讨间歇性低压低氧（IHH）预处理对大鼠心肌缺血／再灌注（I/R）损伤后血清中心肌酶、心肌梗死的影响及锌指核转录因子ZFP580发挥的作用。方法：32只雄性Wistar大鼠随机分为IHH预处理组和常氧对照组（n=16）。IHH组大鼠置于模拟海拔高度为5000m的低压氧舱中,每天6h,持续42d。两组大鼠经结扎冠状动脉左前降支建立心肌I/R损伤模型后,检测血清中乳酸脱氢酶（LDH）活性及肌酸磷酸肌酶同功酶（CK-MB）浓度,并利用Western blot方法观察各组大鼠心肌组织中ZFP580的表达情况。每组另外8只大鼠经心肌酞菁蓝-TIC染色后比较心肌梗死面积。培养大鼠H9c2心肌细胞,利用慢病毒介导的基因转染实验获得高表达ZFP580的心肌细胞,并进行心肌细胞模拟缺血／再灌注（SI/）损伤实验。利用Annexin V-PE／7-AAD柒色及流式细胞术检测H9c2心肌细胞的凋亡情况。结果：IHH预处理能明显减少心肌I／R损伤后IDH、CK-MB漏出至血清,并明显缩小心肌梗死面积。大鼠经IHH预处理后心肌组织中ZFP580的表达上调,IHH预处理明显上调心肌L／R损伤后心肌组织中ZFP580的表达。高表达ZFP580的H9c2心肌细胞在STIR损伤后细胞凋亡率明显下降。结论：IHH预处理对于心肌I／R损伤具有明显细胞保护作用,其上调的ZFPS80表达具有减少心肌细胞凋亡的作用,ZFP580可能作为心肌细胞内源性抗凋亡分子之一,参与IHH预处理抗心肌I／R损伤的过程。     

番茄红素对血管内皮细胞氧化应激损伤的作用及机制研究

目的:观察番茄红素(lycopene,LYC)对于血管内皮细胞功能的作用,探讨其作用机制。方法:人脐静脉内皮细胞(HUVECs)处理实验分组:对照组,H2O2组,H2O2+LYC组(1、2、4、8μmolL-1)。MTT法检测HUVECs存活率;免疫印迹法(Western blot)检测p38MAPK蛋白磷酸化水平、抗凋亡蛋白B淋巴细胞/白血病-2(bcl-2)及线粒体凋亡通路相关蛋白bax的表达;细胞黏附能力测定和伤口愈合实验检测HUVECs粘附率和迁移率;TUNEL法检测HUVECs凋亡率;ELASA法测定HUVECs内活性氧(ROS),超氧化物歧化酶(SOD),乳酸盐脱氢酶(LDH)释放量和caspase-3的活性。结果:H2O2损伤后HUVECs存活率显著降低(P0.01),凋亡率显著增加(P0.01),黏附和迁移能力显著降低(P0.01),bax和p-p38MAPK的表达上调,bcl-2的表达下调,并且ROS、LDH的释放和caspase-3的活性增加(P0.01),SOD的释放减少。而LYC的预处理可以明显逆转H2O2以上作用。结论:H2O2氧化应激损伤中,LYC保护内皮细胞可能与其抗过氧化损伤细胞凋亡,抑制异常的p38MAPK信号通路有关。