人催乳素受体胞外区蛋白的原核表达及纯化

目的:建立人催乳素受体的原核表达系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法:由RT-PCR获得人催乳素受体(human prolactin receptor,hPRLR)胞外区氨基酸的编码序列,扩增并通过酶切位点修饰后克隆至pMD18-T载体,经测序正确后,切下编码序列连接到重组表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用IPTG诱导重组工程菌表达,使用谷胱甘肽偶联的GSTrapFF柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:重组菌株可以表达GST-hPRLR融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量为37.6×103处有一条带。结论:利用大肠杆菌表达系统获得了较高纯度的GST-hPRLR融合蛋白,为进一步研究催乳素受体的功能和制备特异性的抗体奠定了基础。     

人颗粒裂解肽片段在大肠杆菌中的表达

目的：建立颗粒裂解肽（NKG5）的原核表达载体系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法：采用寡核苷酸合成、PCR扩增得到NKG5编码序列,克隆到pGEM-T载体上,经测序正确后,再切下编码序列连接到重组表达载体pGEx-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导重组工程菌表达,采用谷胱甘肽偶联的Sepharose 4B纯化重组蛋白。结果：重组菌株可以表达GST-NKG5融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量34000处有一条带。结论：获得了在大肠杆菌中低表达的颗粒裂解肽融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

vMIP-II-TfN融合蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,表达纯化vMIP-II-TfN融合蛋白。方法:利用PCR方法扩增编码人转铁蛋白N端半分子的基因片段,通过酶切、连接、转化等分子克隆方法构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体;电击法转化X33酵母菌;用甲醇诱导重组酵母菌表达融合蛋白,利用硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA层析等技术进行蛋白纯化,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达和纯化情况,利用趋化实验进行纯化蛋白活性检测。结果:经过两次PCR扩增了一个长约1.1kb的包含Xba I酶切位点的IgG3-TfN基因片段,插入pPIC-vMIP-II的Xba I酶切位点,经菌液PCR鉴定获得重组子,测序结果表明构建载体pPIC-vMIP-II-TfN的表达框正确无误,转化X33酵母菌,用甲醇诱导表达出48kDa的vMIP-II-TfN融合蛋白,经硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA纯化后得到纯度约为95%的vMIP-II-TfN融合蛋白。Western印迹结果表明融合蛋白能与转铁蛋白抗体特异性结合。活性检测表明经过诱导表达的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。结论:成功构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,重组酵母工程菌经甲醇诱导成功表达出vMIP-II-TfN融合蛋白,纯化后的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。     

蛇毒锯鳞蝰素融合蛋白的发酵与纯化

研究大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合蛋白的发酵和纯化工艺。将Ecs基因插入表达载体pTXB1,转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌。对工程菌进行补料分批培养并诱导表达,研究培养基、培养和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,经DTT裂解后,检测Ecs活性。发酵后菌体湿重可达75g/L,融合蛋白表达量约占总蛋白的35%,重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为28mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和纯化条件,为规模化生产奠定基础。     

GST-talin1融合蛋白的原核表达及纯化

应用PCR方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX-4T-1中,获取人源的GST-talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础.经酶切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B柱纯化,western blot鉴定.克隆得到了一个2400bp的talin1的cDNA片断,重组质粒目的DNA测序正确,纯化出分子量约为121.6kD的融合蛋白.用基因工程方法使GST-talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST-talin1融合蛋白.     

PSCA-HSP70融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

旨在大肠杆菌中表达PSCA-HSPT0融合蛋白,并对其进行纯化.克隆人PSCA基因及HSP70基因,构建表达PSCA-HSP融合蛋白的工程菌,优化表达及纯化条件,对重组蛋白进行纯化.结果表明,成功构建重组表达质粒PSCA-HSP,重组蛋白得到可溶性表达,优化纯化条件后获得90%以上纯度的重组蛋白.本研究成功实现了PSCA与HSP的融合表达,为下一步肿瘤疫苗的研制奠定基础.     

鼠源休眠蛋白具有抑制内皮细胞增殖和诱导细胞凋亡的活性

内皮抑素 (endostatin)是最近发现的一种具有抑制血管生长的蛋白质。休眠蛋白 (restin)是内皮抑素的同源蛋白质 ,最早由Ramchandran等人发现 ,它来源于胶原蛋白XV的羧端非胶原蛋白结构域 (NC1)。为了研究鼠源休眠蛋白对内皮细胞生长的影响 ,利用RT PCR从鼠肌肉中扩增出它的基因 ,克隆入原核表达载体pQE32。诱导后 ,重组蛋白质以包涵体形式高效表达 ,表达量约占菌体总蛋白质的 6 0 %～ 70 %。重组蛋白质经纯化复性后 ,可以特异地抑制bFGF刺激的牛主动脉内皮细胞的增殖 ,但是休眠蛋白的抑制活性比内皮抑素活性稍低。流式细胞仪检测发现 ,休眠蛋白可以引起内皮细胞的细胞周期的改变 ,并且引起细胞凋亡     

GST—talinl融合蛋白的原核表达及纯化

应用PCR方法扩增talinl的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX-4T-1中,获取人源的GST—talinl融合蛋白,为下阶段深入的研究talinl的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶切、序列鉴定．选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B柱纯化,western blot鉴定。克隆得到了一个2400bp的talinl的cDNA片断,重组质粒目的DNA测序正确,纯化出分子量约为121、6kD的融合蛋白。用基因工程方法使GST—talinl重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST—talinl融合蛋白。     

重组胸腺素α1的表达、纯化和生物学活性

为获得重组人胸腺素α1(recombinantthymosinα1,Tα1) ,采用融合表达方式表达Tα1基因 ,重组融合表达载体Tα1 pGEX 4XT 1转化大肠杆菌DE3(lys)构建工程菌 .对工程菌进行补料分批培养并诱导表达 ,得到目的蛋白的可溶性表达 .亲和层析纯化融合蛋白GST Tα1,经凝血酶裂解融合蛋白 ,亲和层析除去GST ,SourceQ离子交换 ,得到Tα1单体 ,得率为 30mg L发酵液 .生物学活性分析显示 ,重组Tα1能显著促进小鼠脾细胞增殖 (P <0 0 1) ,其活性与天然Tα1相似     

硫氧还蛋白抗体柱的制备

目的:探索硫氧还蛋白(Trx)抗体柱对Trx融合蛋白纯化的可行性。方法与结果:对含有Trx基因的质粒表达载体pTrxFus进行改造,在Trx读框之后加入6×His序列,并在大肠杆菌中表达C端带有6×His标签的Trx,经Ni2+柱亲和纯化后制备多克隆抗体;把经蛋白A纯化后的抗体偶联在溴化氰活化的琼脂糖凝胶上,制成Trx抗体柱;用此抗体柱纯化与Trx融合表达的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI),SDS-PAGE结果显示获得了纯度较高的Trx-CpTI。结论:用Trx抗体制成的免疫亲和层析柱可以有效纯化Trx融合蛋白。     

人内皮生长抑制素基因克隆表达及其抑瘤作用

内皮生长抑制素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是最近报道具有抑制肿瘤生长和铁蛋白质,为此,从正常人肝细胞株Ｌ０２中抽提总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法获得了人内皮生长抑制素编码序列,序列分析表明,内皮生长抑制素ＣＤＮＡ开放阅读框架全长５５５ｂｐ,此基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为Ａ地８４０６０）,共编码１、８４个氨基酸残序列为５个碱基与文献报道不同,蛋白质序列中有３个氨基酸残基与文献报道不同,说明存在人种间差异。将人     

人血管内皮抑制素在毕赤酵母中的表达纯化及活性测定

血管内皮抑制素是胶原ⅩⅧ C-末端的一个片段,是一个有效的血管生成抑制因子。本文克隆了人血管内皮抑制素的基因,并用毕赤酵母进行表达,表达量为50.5 mg/L。发酵液上清经SP Sepharose Fast Flow凝胶一步层析,产物纯度达到98%以上,纯化收率达到95%以上。毕赤酵母分泌表达的人血管内皮抑制素具有免疫活性;能明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生长;并且能特异性地抑制bFGF刺激的人微血管内皮细的迁移,达到抑制效果为50%时所需的蛋白浓度（IC50）为0.4μg/ml。本研究为应用人血管内皮抑制素治疗肿瘤奠定了初步实验基础。     

Molecular cloning, expression and purification of recombinant soluble mouse endostatin as an anti-angiogenic protein in Escherichia coli

Inhibition of angiogenesis has become a particular interest for treatment of solid tumors. Endostatin, a C-terminal fragment of collagen XVIII, has been reported to exhibit potent inhibitory effect on endothelial cells proliferation, migration and tube formation. In this research, the cDNA library of endostatin was synthesized from mouse liver and inserted into the SacI and SalI enzyme-cutting sites of pUC18 cloning vector. The recombinant vector was transferred into Escherichia coli DH5a and the recombinant clone was selected on LB agar plate plus ampicillin. PCR analysis and DNA sequencing proved the presence of intact endostatin gene in pUC18. The endostatin gene subcloned into pET32a expression vector and the competent bacterial cells of E. coli BL21 were transformed by the vector harboring endostatin gene. In the optimum conditions, expression plasmid was induced with IPTG and recombinant soluble endostatin as a fusion with thioredoxin was purified with Ni–NTA (Ni²⁺-nitrilotriacetate) resin. The results showed that soluble recombinant endostatin as a fusion protein with thioredoxin is a homogenous polypeptide that inhibits angiogenesis (capillary tube formation) in human umbilical vein endothelial cells by 200 ng/ml.     

NC1 domain of human type VIII collagen (alpha 1) inhibits bovine aortic endothelial cell proliferation and causes cell apoptosis.

Endostatin, a natural angiogenesis inhibitor, had been identified for years. It opened a new approach for cancer therapy. Sequence analysis revealed that endostatin is the NC1 domain (non-triple-helical domain) of collagen XVIII. In this report, the cDNA of NC1 domain of type VIII collagen (alpha 1) was cloned and expressed as soluble form in Escherichia coli. The recombinant protein was purified with Ni-NTA agarose column and named as vastatin. It inhibited the proliferation of bovine aortic endothelial (BAE) cell stimulated by basic fibroblast growth factor (bFGF) in a dose-dependent manner. The ED(50) of vastatin was 0.6 microg/ml, while the ED(50) of endostatin was 0.5 microg/ml. Treatment of BAE cell with vastatin caused G(0)-G(1) arrest and cell apoptosis. It is interesting that sequence analysis showed that there was only about 12% amino acid sequence homology between vastatin and endostatin. The structure-function relationship of these angiogenesis molecules remains to be elucidated.     

人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化与生物功能研究

内皮抑素（Endostatin）是近年来新发现的一种内源性新生血管生成（Angiogenesis）抑制因子,通过抑制新血管生成而抑制肿瘤的形成和转移且不会引起耐药性,具有极高的临床应用前景。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)具有表达率高、产物可分泌、可对高等真核生物蛋白正确进行翻译后加工、遗传稳定、发酵工艺成熟等优点被用来进行重组人Endostatin的表达。本研究用PCR的方法从人胎肝cDNA文库中扩增出人Endostatin的cDNA,测序正确后转入毕赤巴斯德甲醇酵母,并获得了高效可溶型表达,用肝素亲和层析的方法进行纯化,纯化后产物经SDSPAGE薄层扫描分析纯度达987％以上,质谱测定分子量为2043kD与理论值一致,蛋白质N端序列测定结果为SPPAHTHRDFQPVLH与天然序列一致。生物活性检测证明可抑制鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）的新生血管生成（Angiogenesis),并可抑制血管内皮细胞的增殖。因此用酵母表达系统可以得到具有生物活性的内皮抑素,经纯化后可用于进一步的生物功能和作用机理试验。     

重组人角质细胞生长因子-2基因克隆、表达、纯化与活性分析

 从人胚肺二倍体细胞KMB17中抽提总RNA ,经RT PCR扩增获得编码人角质细胞生长因子 2 (keratinocytegrowthfactor 2 ,KGF 2 )的cDNA .克隆于硫氧环蛋白表达载体pThioHisA ,序列分析表明与文献报道一致 .经IPTG诱导 ,在大肠杆菌BL2 1中实现高效表达 ,表达量可达菌体总蛋白 10 %～15 % .菌体超声破碎 ,上清经CM SepharoseFF阳离子交换 ,Heparin Sepharose亲和层析 ,Superdex 75凝胶过滤层析纯化得到重组人KGF 2 ,纯度高于 95 % .生物活性分析表明 ,它能够促进成纤维细胞NIH 3T3的增殖 ,诱导鸡胚背根神经结神经轴突的生长 ,促进鸡胚尿囊膜血管生成 .研究结果表明 ,获得了 95 %纯度的具有生物学活性的重组人KGF 2 ,为进一步的基础与应用研究提供了基础     

人TIMP—3cDNA的克隆,表达及其抗血管生成作用

从人新鲜的胎盘组织中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法获取了人组织金属蛋白酶抑制－３成熟蛋白的ｃＤＮＡ。序列分析表明,ＴＩＭＰ－３成熟蛋白含有１８８个氨基酸残基,其中１２个半胱氨酸残基在ＴＩＭＰ家族中高度保守。将人ＴＩＭＰ－３ｃＤＮＡ插入含７启动子的质粒ｐＥＴ－２４构建表达质粒ｐＥＴ－ＴＩＭＰ３,转化大肠杆菌ＢＬ２１,筛选表达菌株ＢＬＴＩＭＰ３。     

重组人Endostatin／MBP融合蛋白片段的构建及体外抑制内皮细胞增殖活性

为了寻找人endostain基因的核心作用自然,先用PCR方法从人的肝脏cDNA库克隆出人endostain基因。然后,利用限制性内匹酶酶切得到5个不同的endostatin基因片段,并净它们构建到肠杆菌表达得到rh Endo-statin/MPB6个不同片段的融合蛋白,用亲和层析技术分离纯化,并分别作用于 外培养的牛肾上腺毛细血管内皮细胞（BCE）,检测它们对内皮细胞增殖的影响,rh Endostain/MBP不同片段的融合蛋白对经bFGF刺激引起的BCE细胞的快速增殖有不同程序的抑制作用。Endostain作用的活性片段位于Endostain蛋白N端的第55－96氨基酸位置内。     

日本七鳃鳗RGD毒素肽Lj-RGD2的克隆、表达及其抗血管新生活性

日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白Lj-RGD2毒素肽分子质量为8 kD,是含有2个RGD（Arg-Gly-Asp）模体序列的多肽.为了探讨其是否具有RGD毒素蛋白的功能,对其基因进行了克隆和表达,并对其重组蛋白进行了抗血管新生活性研究.从日本七鳃鳗口腔腺中提取mRNA,以自行设计的引物进行RT-PCR扩增,以获得Lj-RGD2基因;将获取的目的基因与pET23b载体连接,经转化、克隆、阳性转化子的筛选鉴定;将含组氨酸标签的pET23b-Lj-RGD2转化BL21菌中诱导表达;经亲和层析纯化,获得可溶性重组rLj-RGD2蛋白,并对重组rLj-RGD2蛋白的抗血管新生功能进行了研究.结果显示,rLj-RGD2蛋白的IC50为1.77μmol/L,并以剂量依赖方式抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖;rLj-RGD2蛋白还能抑制ECV304细胞对人工基质膜Matrigel的黏附、以BFGF（basic fibroblast growth factor）为趋化剂的迁移及侵袭.鸡胚绒毛尿囊膜CAM（chick chorioallantoic membrane）血管新生实验结果表明,rLj-RGD2蛋白能以剂量依赖方式抑制BFGF诱导的CAM血管新生.由此可见,rLj RGD2蛋白具有RGD毒素肽的活性特征,其有望成为一种抗血管新生基因工程新药. 关键词日本七鳃鳗; RGD毒素蛋白; 细胞黏附; 迁移及侵袭; 血管新生     

重组人纤溶酶原Kringle1-5的制备及其

为了研究重组人纤溶酶原 Kringle1-5(K1-5)的抗血管生成活性及其对内皮细胞增殖的影响, 通过PCR扩增人纤溶酶原K1-5 cDNA,定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pET-K1-5, 转化E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达,SDS-PAGE 和Western 杂交检测K1-5的表达。鸡胚尿囊膜 (CAM) 实验和MTT实验分别检测重组人纤溶酶原Kringle1-5对鸡胚新生血管生成和内皮细胞的抑制作用。结果表明,IPTG诱导原核表达载体pET-K1-5在E.coli BL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的32%, K1-5主要以包涵体形式存在,包涵体经过洗涤、溶解、Ni-spin 亲合柱层析纯化以及蛋白质复性等步骤后,获得了纯度约为96%的重组K1-5蛋白。CAM实验表明,原核表达的重组人K1-5能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成。MTT实验结果显示,重组人K1-5特异地抑制内皮细胞的增殖, 而对非内皮细胞无抑制作用。