用RACE技术扩增并克隆牛BMP4基因3''''端序列

RACE技术是一项扩增基因末端序列的新技术。该研究从牛BMP4基因出发,以牛软骨的RNA为模板,按照不同物种BMP4基因的相似性设计特异引物,运用PCR和RACE技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMP4的3′端序列,包含有1170bp组成的开放读码框(ORF),编码389个氨基酸,3′非编码区121bp个核苷酸和poly(A)15。同源性分析结果表明,牛BMP4 cDNA最大开放读码框所推测的氨基酸序列与已知人、小鼠、大鼠、狗、羊和鸡等真核生物BMP4氨基酸序列进行比较,分别有94.5%、93.1%、91.9%、87.4%、94.2%、79%的同源性。这为克隆其他物种的BMP4基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为我们更好的理解牛的生骨机理提供帮助。     

杜氏盐藻RuBisCO小亚基基因的克隆和分析

根据莱菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、团藻(Volvox carteri)、伞藻(Acetabularia cliftonii)等生物的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO)的小亚基rbcS基因氨基酸的高度保守序列,设计一对简并引物,进行RT-PCR.209 bp的PCR产物经测序分析及进行氨基酸序列同源性比对,表明克隆的序列为盐藻rbcS基因的cDNA片段.根据该序列信息,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends) 方法扩增其5'上游未知区和3'下游未知区.5'RACE得到的cDNA长度为约300 bp,3'RACE得到的长度约380 bp.三段序列拼接后cDNA全长为878bp,其中开放读码框包括190个氨基酸.此cDNA序列,推导成氨基酸序列与已知物种的rbcS基因相比对,同源性分别为V.carteri 78%,C.reinhardtii 75%,A.cliftonii 67%,据此可推断所克隆的序列为盐藻RuBisCO的小亚基cDNA序列,GenBank收录号为AY739272.     

草鱼AMBP基因cDNA的克隆与序列分析

α1-微球蛋白和Bikunin是由同一基因翻译表达出的两种功能不相关联的血浆蛋白。本文通过快速扩增cDNA末端的方法,首次从草鱼肝脏组织克隆了α1-微球蛋白和Bikunin前体蛋白(α1-microglobulin/Bulinin precursor, AMBP）基因全长cDNA。其cDNA全长1230bp,包含5′非翻译区23 bp,3′非翻译区160 bp和开放读码框1047 bp。开放读码框编码348个氨基酸,包含182个氨基酸的α1-微球蛋白和145个氨基酸的Bikunin。草鱼AMBP与其他物种的氨基酸序列分析结果表明,它们具有较高的同源性(44.7%－84.4%),其中草鱼与斑马鱼同源性最高(84.4%)。结果表明AMBP序列结构和α1-微球蛋白与Bikunin共翻译表达特点在动物机体中具有着重要的生理意义。     

血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶基因的克隆与序列分析

为克隆血红密孔菌 (Pycnoporussanguineus)漆酶基因 ,根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计了 1对简并引物 .以血红密孔菌基因组DNA为模板 ,PCR扩增出长 12 2 7bp的漆酶基因片段 .以此序列为基础 ,通过 5′及 3′RACE技术克隆出漆酶全长cDNA序列 ,序列长为 190 2bp ,其 5′端和 3′端非编码区长分别为 5 1bp和 2 97bp ,开放阅读框长 15 5 4bp ,编码 5 18个氨基酸的蛋白 .该蛋白具有 4个铜离子结合区域 ,预测其相对分子量为 5 6 313 2 ,等电点为 5 5 9,其氨基酸序列与Pycnoporuscinnabarinus漆酶 (lcc3 2 )的同源性最高 ,为 96 % .以该cDNA编码区的两端序列为引物 ,PCR扩增得到漆酶的长度为 2 15 4bp的全长DNA序列 ,序列中包括 10个内含子序列 ,长为 5 2～ 70bp     

应用RACE法克隆鸽恒定链基因的研究

为比较禽类恒定链的结构和功能, 应用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 技术首次克隆并鉴定了鸽恒定链基因。首先用一对含高度保守的DNA片段的简并引物, 从鸽脾细胞RNA扩增部分恒定链片段, 接着测序并设计新引物分别从5′和3′RACE扩增延长该片段。最后根据全基因的序列设计上、下游引物,获得大小为1 050 bp的全长cDNA。比较核苷酸序列, 鸽与鸡的Ii链同源性达到82.8％, 而与人等其它动物的同源性则在52.0％以上; 其中633 bp的开放阅读框编码211个氨基酸残基的前体蛋白。推导和分析氨基酸序列表明, 分子结构与鸡恒定链相似, 其中有些氨基酸残基表现出较高的保守性。     

蒙古牛BMPR-IB基因部分cDNA的克隆和序列分析

BMPR-IB基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用。该研究从影响卵巢生长发育和调控的BMPR-IB基因出发,以牛卵巢的RNA为模板,按照不同物种BMPR-IB基因的相似性设计特异引物,运用RT-PCR技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMPR-IB序列,包含有953bp组成的部分cDNA序列,同源性分析结果表明,牛BMPR-IB基因序列与绵羊、山羊、人、猪、小鼠的BMPR-IB基因分别为98%、97%、92%、93%、88%的同源性。这为克隆其他物种的BMPR-IB基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为更好地理解牛的生殖机理提供帮助。     

家兔BMP7基因的克隆及其生物信息学分析

在对已知部分编码序列(CDS)进行分析的基础上, 采用RT-PCR分步扩增以及RACE方法, 对家兔BMP7基因3′和5′末端未知序列进行了克隆与生物信息学分析。测序结果综合分析表明, 所获序列共计1 654 bp, 包括家兔BMP7近全长前肽、全长成熟肽CDS及3′非翻译序列(3′UTR), 将已有的序列向5′和3′端分别延伸了395 bp和628 bp。序列对比表明, 克隆的家兔BMP7 CDS部分与人、小鼠的对应序列的同源性分别为91.89%和89.32%, 预测的氨基酸序列同源性分别为96.51%和96.01%。家兔BMP7 3′UTR长446 bp, 与人、小鼠对应序列同源性分别为57.38%和45.57%; 具有2个转录终止信号位点。推测家兔BMP7成熟蛋白有BMPs特有的7个位置固定的半胱氨酸残基和TGF-β家族指纹。家兔BMP7 3′UTR区转录终止信号的可选择性可能与基因转录后调控有关。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株基因组序列测定和分析

应用RT-PCR方法分段扩增出PRRSV上海分离株S1毒株的4条基因大片段,扩增后的产物分别克隆于pCR-XL-TOPO载体鉴定后测序,同时应用RACE方法对S1毒株的3′和5′基因末端进行了成功的扩增并克隆于pMD-18T载体进行测序,按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSVS1株全基因组cDNA序列。测序结果表明PRRSVS1株基因组全长15441bp,包含9个开放式阅读框,5′UTR含有189nt,3′端UTR含有181nt,其中包含30ntPoly(A)。基因组序列分析结果显示该病毒与ATCCVR-2332和BJ-4分离株的核苷酸同源性分别99.5%和99.6%。与另一国内分离株CH-1a的核苷酸同源性为90.8%。     

西伯利亚蓼rd22基因的克隆与序列分析

以3% NaHCO₃溶液胁迫处理48 h的西伯利亚蓼为试材,利用RACE技术,从其茎部组织克隆了脱水应答蛋白RD22的全长cDNA序列。测序后的结果分析表明,该cDNA序列全长为1 302 bp,5′非翻译区为59 bp,3′非翻译区为25 bp,开放读码框为1 218 bp,编码405个氨基酸。在氨基酸序列的C端含有一个比较保守的BURP结构域,N端含有5个重复序列THV-VGKGGV-V。信号肽检测证明该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽结构。其推演的氨基酸序列与葡萄的同源性最高,达到60%。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为DQ836050。     

鸡含锰超氧化物歧化酶cDNA克隆及序列分析

 为弄清鸡含锰超氧化物歧化酶 (manganese containingsuperoxidedismutase ,MnSOD)的cDNA序列 ,以开展动物锰营养学的深入研究 ,根据已知鸡MnSOD的N端氨基酸序列设计简并引物 ,应用 3′RACE(rapidamplificationofcDNAends)技术 ,扩增克隆了鸡心肌MnSOD 990bp的 3′cDNA片段 .再根据 3′RACE片段测序结果设计引物进行 5′RACE ,结果获取了一个与 3′RACE片段相互重叠的鸡心肌MnSOD 52 1bp的 5′RACE片段 ,并对其进行了克隆测序 .最后根据 3′RACE片段和 5′RACE片段序列信息进行拼接 ,从而获取鸡MnSODcDNA的全序列信息 .研究结果表明 :鸡MnSODcDNA全长为 110 8个核苷酸 ,其中 5′非翻译区 2 5个核苷酸 ,编码区 675个核苷酸 ,3′非翻译区 4 0 8个核苷酸 ,编码一个长 2 2 4个氨基酸残基的蛋白质前体 .其中信号肽长 2 6个氨基酸残基 ,成熟肽长 198个氨基酸残基 ,分子量为 2 2kD .与人、大鼠、线虫、果蝇等真核生物MnSOD氨基酸序列的同源性分别为82 4 %、84 .7%、62 .4 %、59.3% .     

牛β-酪蛋白5′端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用PCR扩增了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取DNA。在牛β－酪蛋白基因外显子1和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为19个核苷酸,引物间跨度为635bp。以牛肝DNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。从凝胶中回收目的片段,克隆到pGEM－T载体中。重组质粒提取DNA,进行序列分析。测序结果与文献发表的类似序列相比,仅有4个碱基不同,同源性达99．4％。表明获得了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列的克隆。     

大口黑鲈脂代谢相关基因NPY、UCP2、LPL、HL克隆与分子进化分析

采用RT-PCR和RACE方法克隆了大口黑鲈NPY基因cDNA全序列及UCP2、LPL、HL基因cDNA核心片段。序列分析结果表明,大口黑鲈NPY基因cDNA全序列长664 bp,其中5′端非翻译区(5′-UTR)长53 bp,3′端非翻译区(3′-UTR)长311 bp,开放阅读框(ORF)长300 bp,编码99个氨基酸,即前体NPY。大口黑鲈前体NPY包括三个部分,28个氨基酸组成的信号肽、36氨基酸组成的成熟NPY以及32个氨基酸组成的由Gly-Lys-Arg指示的NPY C端肽（CPON）。大口黑鲈UCP2、LPL、HL基因cDNA核心片段长度分别为737 bp、509 bp和666 bp,各自编码245个氨基酸、169个氨基酸和222个氨基酸。将4个基因的氨基酸序列分别与其他物种的氨基酸序列进行同源性比较,并通过MEGA3构建系统树,对这4个脂代谢相关基因的分子进化特征进行了探讨。     

桃多聚半乳糖醛酸酶基因的cDNA克隆及序列分析

以白粉桃成熟果实为材料,用Trizol法提取桃总RNA,根据已发表的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的序列设计合成一对特异引物,经 RT-PCR 扩增出一条1 188 bp的目的片段,包括一个393个氨基酸组成的开放阅读框.通过TA克隆,把它连接到pGEM-T vector上.PCR、酶切鉴定后进行基因测序,结果表明所克隆的PG基因与GenBank中肥城桃PG基因序列(AF095577)同源性为98.65%,相应的氨基酸的同源性为97.46%,说明此片段为桃PG基因片段.     

中华蜜蜂蜂毒镇静肽基因的cDNA克隆和表达

从中华蜜蜂 (Apisceranacerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR扩增得到大小约为2 5 0bp的cDNA片段 ,测序得到的片段长度为 2 34bp ,为蜂毒前镇静肽原 (preprosecapin)基因编码区的cDNA .以 3′RACE方法 ,扩增和测定了 3′端非编码区 2 19bp序列 .中蜂前镇静肽原cDNA序列与已报道的欧洲意蜂该基因cDNA序列具有 92 %同源性 ,氨基酸序列具有 87%同源性 .代表成熟肽镇静肽的最后 2 5个氨基酸序列 ,中蜂与意蜂同源性为 88% .3′端非编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有 73 1%同源性 .将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与 3′非编码区部分克隆 ,构建了镇静肽与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX AcSecapin .将载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)进行融合表达 .表达产物与抗GST抗体在 2 9kD处有很强的交叉反应 .大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白 ,通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白     

藏酋猴达菲抗原/趋化因子受体基因的克隆与序列分析

利用GenBank公布的恒河猴达菲抗原/趋化因子受体基因(FY)核苷酸序列设计2对特异引物,采用PCR方法克隆藏酋猴Macaca thibetana FY基因,分别得到1.0kb和1.1kb的DNA片段,通过DNA测序和序列拼接获得藏酋猴FY基因1491bp片段,该片段包含2个外显子(21bp和990bp)和1个内含子(480bp)。该基因开放阅读框长1011bp,编码336个氨基酸,该蛋白等电点是5.77,分子量是35.52kDa,分子半衰期30h,不稳定指数是39.84,总平均疏水性是0.689,是疏水性蛋白。拓扑结构预测显示该基因编码氨基酸有15个潜在的功能位点:3个N-糖基化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,10个N-肉豆蔻酰化位点。整个蛋白质多肽链含有7个跨膜螺旋区,4个细胞外区和4个细胞内区。同源性比较结果显示,与人、恒河猴、牛、兔、犬、大熊猫6个物种FY基因编码区核苷酸序列间同源性分别为94.7%、99%、75.2%、80.2%、74.5%、71.7%,氨基酸序列间同源性分别为92%、99%、89.8%、78.2%、90%、89.3%。系统进化树结果表明:藏酋猴与恒河猴亲缘关系最近,与人类亲缘关系较近。     

蛇白蔹白藜芦醇合酶基因CNRS2的克隆与原核表达

白藜芦醇合酶(resveratrol synthetic enzyme,RS)是植物白藜芦醇合成途径中的关键酶,利用已知的葡萄RS基因(AF274281)序列设计并合成了一对引物,以蛇白蔹基因组DNA为模板,PCR扩增得到包含RS完整基因在内的一段序列,测序与序列分析表明:该克隆片段全长1 536bp,其中包含一个内含子及两个外显子。采用悬挂延伸PCR法克隆了目的基因,命名为CNRS2。序列分析表明该基因的开放读码框1 170 bp,编码389个氨基酸残基。同源性比较发现,CNRS2与已知葡萄RS基因序列的同源性达93%～98%。CNRS2与pET-30a(+)构建原核表达载体,经IPTG诱导后可表达获得相对分子量约为46 kD的外源融合蛋白。以上结果证实CNRS2属葡萄RS基因家族成员,为今后进一步对该基因的研究利用打下基础。     

梅花鹿卵泡刺激素α-亚基cDNA的分子克隆与序列分析

从新屠宰的母梅花鹿脑垂体中提取总RNA,反转录获得CDNA,以此CDNA为模板用PCR法扩增目的片段,获得长为380bp的梅花鹿卵泡刺激素α-亚基CDNA片段,它将克隆至PMD-18-T-Verctor。随机挑选3个阳性重组子进行测序,并将测序结果与绵羊、牛、猪等多种哺乳动物该基因的核苷酸序列及相应氨基酸序列进行比较。结果表明,梅花鹿卵泡刺激素α-亚基基因编码的氨基酸序列与绵羊、水牛的该基因同源性最高,达97%,只有4个氨基酸不同;与牛的该基因同源性达96%。与人的该基因氨基酸序列同源性较低,为75%。其编码的核苷酸序列与绵羊、水牛、牛的同源性最高,达96%,只有14-16个碱基不同,与人的基因核苷酸同源性最低,为84%,总的来说,哺乳动物的卵泡刺激素α-亚基具有很高的同源性。     

棉铃虫羧酸酯酶基因的克隆、序列分析及组织表达

为了从分子水平上研究棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner) 对杀虫剂抗性的产生机理,本文通过RT PCR和RACE方法首次从棉铃虫中肠中克隆了一个羧酸酯酶全长cDNA序列。序列分析表明,该基因包含一个1 794 bp的开放读码框,129 bp的5′UTR和139 bp的3′UTR区域。该基因编码597个氨基酸, 推测编码蛋白质的等电点pI为4.92,分子量为67.1 kD,GenBank登录号为EF547544。通过对氨基酸的同源性分析表明,该羧酸酯酶与斜纹夜蛾Spodoptera litura羧酸酯酶的同源性最高,达60%。半定量RT-PCR分析表明,该基因在中肠组织中表达量最高,在脂肪体和生殖腺中表达量较低,在头部则不表达。推测该羧酸酯酶基因可能主要参与棉铃虫对外源物质的解毒代谢。     

雄牛特异的SRY同源序列的扩增和分析

利用人、兔、鼠SRY序列设计引物,应用PCR扩增牛的SRY序列,获得200bp的雄牛特异的扩增片段。克隆该扩增片段,获得重组质粒pCH21,进行序列分析,并与人、兔和鼠SRY的对应区域比较,具有高度同源性。用pCH21 DNA作探针与牛的基因组DNA酶切图谱杂交,显示了雄牛特异的I．7kb的杂交带。分析200bp的PCR扩增片段是牛的SRY基因片段。用同一对引物扩增人和山羊的DNA样品,也获得雄性特异的200bp的扩增片段。     

二化螟β1微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

微管是真核生物体内分布最为广泛的一类蛋白,是由a-和β-两种不同的微管蛋白组成的异源二聚体.微管参与许多细胞功能,如细胞形态发生、细胞生长和分裂等.以二化螟3龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),扩增得到该虫的β微管蛋白基因的cDNA序列一条.cDNA序列含1 862个碱基,开放读码框1 344个碱基,编码氨基酸447个,分子量约为50.2kD,等电点4.82.氨基酸序列中1～4个氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,是微管蛋白特异片段;氨基酸序列的140～146GGGTGSG位存在一个微管蛋白标志信号片段.序列比对表明,克隆的β微管蛋白基因与其他昆虫的β微管蛋白基因在核苷酸和氨基酸水平上都是高度同源的,与家蚕Bombyx moriβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.1%,与烟草天蛾β1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到98.7%,与果蝇Drosophila melanogasterβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到96.9%.该基因cDNA序列已经登录Genbank并获得登录号为EU429675.