极端酸性矿山环境微生物基于CRISPR系统的适应性免疫机制

【目的】通过对酸性矿山环境中嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、钩端螺旋菌属(Leptospirillum)、硫化杆菌属(Sulfobacillus)、酸原体属(Acidiplasma)和铁质菌属(Ferroplasma)的100株冶金微生物基因组中CRISPR-Cas系统的结构特征和同源关系进行生物信息学分析,在基因组水平上解析冶金微生物基于CRISPR系统对极端环境的适应性免疫机制。【方法】从NCBI网站下载基因组序列,采用CRISPR Finder定位基因组中潜在的CRISPR簇。分析CRISPR系统的组成结构与功能:利用Clustal Omega对重复序列(repeat)分类;将间隔序列(spacer)分别与nr数据库、质粒数据库和病毒数据库比对,获得注释信息;根据Cas蛋白的种类和同源性对酸性矿山环境微生物的CRISPR-Cas系统分型。【结果】在100株冶金微生物基因组中共鉴定出415个CRISPR簇,在176个c CRISPR簇中共有80种不同的重复序列和4147条间隔序列。对重复序列分类,发现12类重复序列均能形成典型的RNA二级结构,Cluster10中的重复序列在冶金微生物中最具有代表性。间隔序列注释结果表明,这些微生物曾遭受来自细菌质粒与病毒的攻击,并通过不同的防御机制抵抗外源核酸序列的入侵。冶金微生物细菌的大部分CRISPR-Cas系统属于I-C和I-E亚类型,而古菌的CRISPR-Cas系统多为I-D亚类型,两者基于CRISPR-Cas系统的进化过程中存在显著差异。【结论】酸性矿山环境微生物的CRISPR结构可能采用不同免疫机制介导外源核酸序列与Cas蛋白的相互作用,为进一步揭示极端环境微生物的适应性进化机理奠定了基础。     

产甲烷古菌中CRISPR簇的研究

【目的】通过对51个产甲烷古菌基因组中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的组成和来源进行研究,推测产甲烷古菌与环境中其他微生物的物质交换和相互作用,在基因组水平上阐述产甲烷古菌之间的遗传差异。【方法】利用CRISPRdb和CRISPRFinder,找出产甲烷古菌基因组中所有潜在的CRISPR簇。对CRISPR簇的基本组成部分进行分析:利用BLASTCLUST对重复序列(Repeat)进行分类;分别将间隔序列(Spacer)与Refseq病毒基因组、Refseq质粒基因组和Refseq产甲烷古菌基因组进行比对,从而获得间隔序列的物种来源和功能信息的注释。【结果】在51个产甲烷古菌中共找到了196个CRISPR簇,这些CRISPR簇中包含了总共4 355条间隔序列。在这些产甲烷古菌中,CRISPR簇的分布是不均匀的,且每个物种的间隔序列数量与其CRISPR簇数量是不成正比的。在对重复序列进行分类之后,发现Mclu1是分布最广且最具代表性的一类重复序列。在4 355条间隔序列中有388条具有物种注释信息,266条具有功能注释信息。从CRISPR簇间隔序列的来源来看,产甲烷古菌曾受到来自Poxiviridae、Siphoviridae以及Myoviridae属病毒的攻击,并且产甲烷古菌之间存在比较广泛的遗传物质交换。【结论】产甲烷古菌基因组中的CRISPR簇在组成和来源上存在较大的差异,这些差异与它们的生存环境有较大的关系。从CRISPR簇的角度阐述了产甲烷古菌之间基因组序列的差异。     

地中海富盐菌中非编码RNA的鉴定与分析

【目的】通过转录组高通量测序技术(即RNA-seq),结合生物信息学分析和分子生物学方法,在组学水平鉴定极端嗜盐菌中可能的非编码RNA(nc RNA)。【方法】将培养至对数中期的地中海富盐菌在不同盐浓度下处理30分钟,提取RNA,进行链特异的转录组测序和5′端区分的转录组测序,通过生物信息学分析在全基因组范围内鉴定nc RNA,预测其转录边界;然后通过Northern blot和环化RNA反转录聚合酶链式反应(CR-RT-PCR)对部分预测的nc RNA进行实验验证。【结果】比较两种RNA-seq技术在不同培养条件下的RNA测序结果和对转录单元的精细分析,共鉴定到105个高可信度的nc RNA,并发现4个在不同盐度下表达差异较大的nc RNA,通过Northern blot和CR-RT-PCR验证了inc RNA1436和inc RNA1903的表达情况、转录本、转录起始位点及终止位点等。【结论】首次在组学水平鉴定了地中海富盐菌中的nc RNA,不同盐浓度刺激下部分nc RNA的转录差异暗示其有可能参与地中海富盐菌对盐胁迫的适应,高可信度nc RNA的组学发现为今后全面开展嗜盐古菌nc RNA的功能机制研究提供了基础数据及重要的切入点。     

极端嗜盐多形性古菌病毒HRPV13的分离鉴定及生物学特性

【背景】与感染细菌和真核生物的病毒相比,目前发现的古菌病毒数量很少,但是却展现出形态多样性。因此,分离和鉴定新的古菌病毒具有重要意义。【目的】为了进一步了解古菌病毒的多样性,我们从青海省翡翠湖水样中分离到一株新的嗜盐古菌病毒株,研究其生物学特性并进行分类。【方法】首先通过挑取单菌落法分离嗜盐古菌,通过噬菌斑法获得嗜盐古菌病毒,PEG 6000两步沉淀法和CsCl密度梯度离心对病毒颗粒进行浓缩和纯化,用醋酸双氧铀对病毒负染染色,在透射电镜下观察病毒形态,提取病毒基因组后进行测序并进行生物信息学分析,以三氯乙酸法制备病毒蛋白样品并进行SDS-PAGE分析,分别用考马斯亮蓝和苏丹黑B染色并观察其蛋白和脂质条带。【结果】在以Halorubrum属极端嗜盐古菌K2菌株为敏感菌的双层平板上分离到了一株嗜盐古菌病毒,其噬菌斑为浊斑,透射电镜下呈多形性包膜病毒状,直径60 nm左右;含有9333bp大小的双链环状DNA基因组,与已报道的β多形包膜病毒属(Betapleolipovirus)的HRPV11、HRPV12和HRPV10具有约75%的一致性,是该属的一个病毒新种。根据形态及基因组特征,将其归...     

嗜麦芽窄食单胞菌OUC_Est10全基因组测序及脂类水解酶多样性分析（英文）

【目的】本研究的目的是研究嗜麦芽窄食单胞菌OUC_Est10中脂类水解酶的多样性。【方法】使用离子交换层析、全基因组测序和异源表达三种方法研究嗜麦芽窄食单胞菌OUC_Est10中脂类水解酶的多样性。【结果】离子交换层析结果显示嗜麦芽窄食单胞菌OUC_Est10可以分泌多种脂类水解酶。通过全基因组测序,我们给出了该菌的全基因组序列,该基因组大小为4668743 bp,GC含量为66.25%。通过详细的基因组序列分析,我们从该基因组中找到33个可能具有脂类水解酶活性的假定基因。通过异源表达OUC_Est10中的5个假定脂类水解酶基因,来研究其催化特性的多样性,结果显示这些脂类水解酶具有不同的催化特性。【结论】我们证明了嗜麦芽窄食单胞菌OUC_Est10拥有多样的脂类水解酶,这暗示了它在不同领域中的应用潜力。     

副溶血性弧菌CRISPR的检测及其结构分析

【目的】检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,简称VP)中规律成簇间隔的短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),并对不同来源的VP中CRISPR位点的结构多样性进行分析。【方法】根据CRISPR DB数据库中公布的VP中确定的CRISPR结构序列CRISPR-1及文献中新发现的疑似CRISPR结构序列CRISPR-2设计引物,对不同来源的79株VP进行PCR扩增。利用CRISPR Finder分析CRISPR结构,采用生物信息学方法对不同来源VP的CRISPR位点结构多样性进行比较分析。【结果】79株VP中CRISPR-1的检出率为92.41%,CRISPR-2的检出率为96.20%,同时具有这2个位点的菌株占总数的89.87%,只有1株菌被检出不含有任何位点。分别比较不同来源的菌株CRISPR-1、CRISPR-2位点的重复序列发现不存在序列差异,而临床菌株的这2个CRISPR位点在间隔序列上比环境分离菌株存在更多的变异。2个CRISPR位点根据间隔序列的不同在VP中一共组成8种CRISPR谱型(编号A-H),除F谱型外,A-E、G谱型均只在临床分离菌株中发现,而在环境分离菌中还发现不含任何位点的H型。【结论】CRISPR在VP中普遍存在。环境分离菌株与临床分离菌株中CRISPR的结构存在差异。     

简化cDNA末端快速扩增技术测定基因III、VIb和VIId型新城疫病毒基因组末端序列及分析

摘要: 【目的】简化cDNA末端快速扩增技术（Rapid amplification of cDNA ends, RACE）流程,测定基因III、VIb和VIId型新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）基因组两侧末端序列,并对NDV的leader和trailer进行分析。【方法】利用T4 RNA连接酶将特定寡聚核苷酸片段的连接于病毒基因组RNA和cDNA,再利用RT-PCR或PCR方法对病毒基因组的末端进行快速的扩增。【结果】建立一套操作简单、低成本、可重复性高的RACE方法,测定了三种基因型5株NDV 3’末端leader和5’末端trailer序列比对分析。【结论】本实验测定的鹅源VII型毒株JS/7/05/Ch基因组的15,184 nt由一个T变为了C,5’端trailer与3’端leader的连续互补序列由8 nt变为12 nt,而其它4株基因III型和VI型NDV均未发现该突变。通过RNA的二级结构分析,NDV基因组和反向基因组RNA的3’末端形成一个发卡结构。JS/7/05/Ch等3株NDV U→C（T→C）的突变位于发卡环上,不影响二级结构的形成,发卡环的RNA序列突变为3’-UCUC-5’,与基因组3’端发卡环的3’-UCUUA-5’相似,推测可能影响了基因组RNA的复制速度。     

青藏高原察尔汗盐湖地区可培养中度嗜盐菌的群落结构与多样性

【目的】研究青海察尔汗盐湖地区的可培养中度嗜盐菌的群落结构及多样性。【方法】采用多种选择性培养基进行中度嗜盐菌的分离、培养;通过16S r RNA基因序列扩增、测定,根据序列信息,进行系统进化树构建、群落结构组成分析及多样性指数计算。【结果】从察尔汗盐湖卤水及湖泥中分离到中度嗜盐菌421株,合并重复菌株后共83株中度嗜盐菌。菌株16S rRNA基因序列信息显示,4株中度嗜盐菌为潜在的新分类单元。83株嗜盐细菌分布于3个门的6个科16个属。其中,Bacillus属、Oceanobacillus属和Halomonas属为优势属。多样性结果显示,水样中的菌株多样性高于泥样,而泥样中的菌株优势度高于水样。【结论】察尔汗盐湖中度嗜盐菌具有丰富的遗传多样性,种群种类丰富,优势菌群集中,该盐湖地区存在可分离培养的中度嗜盐菌的疑似新物种。     

基于比较基因组学分析大黄鱼来源波罗的海希瓦氏菌的防御系统

【目的】波罗的海希瓦氏菌是冷藏海产品中常见的腐败菌,通过全基因组测序和转录组测序,分析它们的规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统和限制修饰(restricted modification,R-M)系统,为波罗的海希瓦氏菌的基础生物学研究和海产品中微生物的致腐机制提供理论基础。【方法】分析大黄鱼来源波罗的海希瓦氏菌SB-19株和W-3株的致腐能力,对W-3株的全基因组序列进行测序、组装和注释,结合已报道的SB-19株和27株希瓦氏菌的全基因组序列,采用比较基因组学方法探究它们的CRISPR和R-M系统的差异,进而对SB-19株和W-3株在不同生长时期进行转录组测序,以及两株菌内致腐相关基因的共进化分析。【结果】灭菌大黄鱼汁中产生挥发性盐基总氮和三甲胺值显示波罗的海希瓦氏菌SB-19株和W-3株分别为强致腐能力和弱致腐能力菌株;平均核苷酸一致性证实SB-19株和W-3株为波罗的海希瓦氏菌,但基于全基因组构建的系统发育树则发现二者之间存在遗传信息上的差异;SB-19株...     

醋酸菌中CRISPR位点的比较基因组学与进化分析

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是近几年发现的一种广泛存在于细菌和古菌中,能够应对外源DNA干扰(噬菌体、病毒、质粒等),并提供免疫机制的重复序列结构。CRISPR系统通常由同向重复序列、前导序列、间隔序列和CRISPR相关蛋白组成。本研究以醋酸发酵中常见3个属醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)和葡糖杆菌属(Gluconobacter)的48个菌株为研究对象,通过其基因组上CRISPR相关基因序列的生物信息学分析,探索CRISPR位点在醋酸菌中的多态性及其进化模式。结果表明48株醋酸菌中有32株存在CRISPR结构,大部分CRISPR-Cas结构属于type I-E和type I-C类型。除了葡糖杆菌属外,葡糖醋杆菌属和醋杆菌属中的部分菌株含有II类的CRISPR-Cas系统结构(CRISPR-Cas9)。来自不同属菌株的CRISPR结构中重复序列具有较强的保守性,而且部分菌株CRISPR结构中的前导序列具有保守的motif (与基因的转录调控有关)及启动子序列。进化树分析表明cas1适合用于醋酸菌株的分类,而不同菌株间cas1基因的进化与重复序列的保守性相关,预示它们可能受相似的功能选择压力。此外,间隔序列的数量与噬菌体数量及插入序列(Insertion sequence, IS)数量有正相关的趋势,说明醋酸菌在进化过程中可能正不断受新的外源DNA入侵。醋酸菌中CRISPR结构位点的分析,为进一步研究不同醋酸菌株对醋酸胁迫耐受性差异及其基因组稳定性的分子机制奠定了基础。     

Comparative genomic structures of Mycobacterium CRISPR-Cas

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) are inheritable genetic elements of many archaea and bacteria, conferring acquired immunity against invading nucleic acids. CRISPR might be indicative of the bacterial niche adaptation and evolutionary. Mycobacterium is an important genus occupying diverse niches with profound medical and environmental significance. To present a comparative genomic landscape of the Mycobacterium CRISPR, the feature of mycobacterium CRISPR structures with sequenced complete genomes were bioinformatically analyzed. The results show that CRISPR structures can be found among 14 mycobacteria, and all loci are chromosomally located. Long CRISPRs present in three species, namely M. tuberculosis, M. bovis, and M. avium. Integrated CRISPR-Cas system can only be found in M. tuberculosis and M. bovis, with highly conserved repeat sequences, very short leaders, and promoterless. M. tuberculosis and M. bovis repeat sequences cannot form stable RNA secondary structure, consistent with a Cas6-binding sequence. M. avium repeat sequences can form classical stem-loop structure. A three-step model of M. tuberculosis CRISPR-Cas system action was put forward based on the composition and function of cas genes cluster. M. tuberculosis and M. bovis CRISPRs might interfere with the invading nucleic acids, but have somehow lost the capacity to incorporate new spacers and co-evolve with corresponding mycobacteriophages.     

基于CRISPR-Cas系统的基因组定点修饰新技术

CRISPR(clustered regulatory interspersed short palindromic repeat)序列源于原核生物的一种获得性免疫系统,协同Cas(CRISPR-associated)蛋白家族参与抵抗噬菌体或其它病毒的二次感染,广泛存在于细菌(60%)和古菌(90%)中.病菌和宿主的共同进化导致了CRISPR-Cas系统具有多样性,可分为3大类(Ⅰ-Ⅲ),又分为10亚类.在Ⅱ型CRISPR-Cas系统基础上建立了RNA介导的CRISPR-Cas系统来修饰(删除、添加、激活、抑制)靶细胞中特定的基因序列,现已在人类细胞、小鼠、斑马鱼、酵母、细菌、果蝇、线虫、拟南芥中得以应用.本文主要介绍了Ⅱ型CRISPR-Cas系统的结构特点、作用机理及作为新型基因组定点修饰技术的研究进展,分析该技术优势,并展望CRISPRCas系统的应用前景.     

蜡状芽孢杆菌群中规律成簇间隔短回文重复序列的生物信息学分析

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是最近发现针对噬菌体等外源遗传物质的获得性和可遗传性的新型原核生物防御系统。通过BLAST、多序列比对、RNA二级结构预测等生物信息学方法对已经完成全基因组测序的蜡状芽孢杆菌群24个菌株进行CRISPR的系统分析,结果表明:42%的菌株含有该结构;8个CRISPR座位的正向重复序列可以形成RNA二级结构,提示正向重复序列可能介导外源DNA或RNA与CAS编码蛋白的相互作用;31%的间区序列与噬菌体、质粒、蜡状芽孢杆菌群基因组序列具有同源性,进一步验证间区序列很可能来源于外源可移动遗传因子。由于大部分蜡状芽孢杆菌群菌株含有多个前噬菌体和质粒,通过对蜡状芽孢杆菌群CRISPR的分析,为揭示其对宿主菌与噬菌体,以及宿主菌与质粒间的关系奠定基础。     

Helicase dissociation and annealing of RNA-DNA hybrids by Escherichia coli Cas3 protein

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/Cas (CRISPR-associated) is a nucleic acid processing system in bacteria and archaea that interacts with mobile genetic elements. CRISPR DNA and RNA sequences are processed by Cas proteins: in Escherichia coli K-12, one CRISPR locus links to eight cas genes (cas1, 2, 3 and casABCDE), whose protein products promote protection against phage. In the present paper, we report that purified E. coli Cas3 catalyses ATP-independent annealing of RNA with DNA forming R-loops, hybrids of RNA base-paired into duplex DNA. ATP abolishes Cas3 R-loop formation and instead powers Cas3 helicase unwinding of the invading RNA strand of a model R-loop substrate. R-loop formation by Cas3 requires magnesium as a co-factor and is inactivated by mutagenesis of a conserved amino acid motif. Cells expressing the mutant Cas3 protein are more sensitive to plaque formation by the phage λvir. A complex of CasABCDE ('Cascade') also promotes R-loop formation and we discuss possible overlapping roles of Cas3 and Cascade in E. coli, and the apparently antagonistic roles of Cas3 catalysing RNA-DNA annealing and ATP-dependent helicase unwinding.     

The role of Cas8?in type?I CRISPR interference

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) systems provide bacteria and archaea with adaptive immunity to repel invasive genetic elements. Type I systems use ‘cascade’ [CRISPR-associated (Cas) complex for antiviral defence] ribonucleoprotein complexes to target invader DNA, by base pairing CRISPR RNA (crRNA) to protospacers. Cascade identifies PAMs (protospacer adjacent motifs) on invader DNA, triggering R-loop formation and subsequent DNA degradation by Cas3. Cas8 is a candidate PAM recognition factor in some cascades. We analysed Cas8 homologues from type IB CRISPR systems in archaea Haloferax volcanii (Hvo) and Methanothermobacter thermautotrophicus (Mth). Cas8 was essential for CRISPR interference in Hvo and purified Mth Cas8 protein responded to PAM sequence when binding to nucleic acids. Cas8 interacted physically with Cas5–Cas7–crRNA complex, stimulating binding to PAM containing substrates. Mutation of conserved Cas8 amino acid residues abolished interference in vivo and altered catalytic activity of Cas8 protein in vitro. This is experimental evidence that Cas8 is important for targeting Cascade to invader DNA.