卡伍尔氏链霉菌NA4的Ⅱ型聚酮基因簇的靶向激活及其产物鉴定

【目的】以基因组信息为导向,定向激活海洋来源卡伍尔氏链霉菌（Streptomyces cavourensis） NA4中沉默的Ⅱ型聚酮类次级代谢产物生物合成基因簇,鉴定新产生的次级代谢产物的结构和抑菌活性。【方法】通过添加启动子和敲除负调控基因的方法激活实验室培养条件下沉默或低表达的生物合成基因簇,并完成目标化合物的分离与纯化,通过电喷雾质谱（electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）数据分析鉴定目标化合物结构,对目标化合物进行抑菌活性鉴定,基于生物信息学信息推导化合物的生物合成途径。【结果】根据基因组生物信息学分析,从海洋来源链霉菌Streptomyces cavourensis NA4中选取一个编码PKSⅡ型次级代谢产物的生物合成基因簇开展研究,成功激活目标基因簇,从中分离到1个PKSⅡ型化合物,推导了其生物合成途径并进行了抑菌活性鉴定。【结论】基因组导向下的天然产物挖掘,可以目标明确地分离产物,充分挖掘链霉菌编码次级代谢产物的潜力。     

链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 8167中Naphthgeranine A生物合成基因簇的分析鉴定

【背景】微生物来源的天然产物是小分子药物或药物先导物的重要来源。对链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 8167的基因组分析显示,其包含多个次级代谢产物的生物合成基因簇,具有产生多种新化合物的潜力。【目的】对链霉菌S. antibioticus NRRL 8167中次级代谢产物进行研究,以期发现结构新颖或生物活性独特的化合物,并对相应产物的生物合成基因簇和生物合成途径进行解析。【方法】利用HPLC图谱结合特征性紫外吸收和LC-MS方法,排除S. antibioticus NRRL 8167产生的已知化合物,确定具有特殊紫外吸收的化合物作为挖掘对象,然后利用正、反相硅胶柱色谱、高效液相色谱等技术对次级代谢产物进行分离纯化,分离化合物。利用质谱及核磁共振光谱技术对化合物结构进行解析和鉴定;提取链霉菌S. antibioticus NRRL 8167基因组DNA,利用PacBio测序平台进行基因组测序;利用生物信息学对基因组进行注释,并对合成该化合物的基因簇进行定位分析,推导其生物合成途径。【结果】确定这个化合物是NaphthgeranineA,属于聚酮类化合物。全基因组序列分析发现S.antibioticusNRRL8167基因组含有28个次级代谢产物生物合成基因簇,其中基因簇20可能负责Naphthgeranine A的生物合成,并对其生物合成途径进行了推导。【结论】基于紫外吸收光谱和质谱特征,从S. antibioticus NRRL 8167菌株的发酵提取物中分离鉴定了一个聚酮类化合物Naphthgeranine A。该菌株的全基因组测序为其生物合成基因簇的鉴定提供了前提,对Naphthgeranine A生物合成基因簇和生物合成途径的推测为进一步研究这个化合物的生物合成机制奠定了基础。     

洛伐他汀工业菌株土曲霉HZ01的次级代谢产物合成分析

【目的】分析洛伐他汀工业生产菌株土曲霉HZ01的次级代谢产物合成能力,为后期的遗传改造、次级代谢产物及其基因簇挖掘提供指导。【方法】对洛伐他汀发酵条件下的样品进行了转录组分析,同时运用色谱分离技术及波谱学方法对主要次级代谢产物进行了分离和结构鉴定。【结果】洛伐他汀合成相关基因转录水平非常高,还有4个聚酮合酶(PKS)、6个非核糖体多肽合成酶(NRPS)和1个PKS-NRPS杂合酶基因进行了转录,其他PKS和NRPS基因都处于沉默状态。此外,从该菌的发酵产物中分离鉴定了10个主要副产物并确定了其结构。【结论】土曲霉HZ01是一株优良的洛伐他汀生产菌株,在构建次级代谢产物异源合成细胞工厂和鉴定次级代谢产物生物合成途径方面具有很好的应用潜力。     

茎瘤芥根际一株产紫色杆菌素杜擀氏菌的分离鉴定及其基因组分析

【目的】对茎瘤芥根际微生物进行分离鉴定,分析微生物菌群构成,选择具有优良特性的菌株,评估其次级代谢产物合成能力,为茎瘤芥根际微生物多样性和菌种资源的挖掘利用奠定基础。【方法】采集重庆市涪陵区二渡村和邓家村的茎瘤芥根,分离培养根际微生物菌株,通过菌株形态观察和看家基因的序列分析,对菌株进行初步鉴定、归类和保存。选择具有优良性状的菌株,利用Pacbio RS II和Illumina HiSeq平台完成全基因组测序,通过antiSMASH分析评估其次级代谢产物合成潜力,克隆目的基因簇并进行异源表达和产物鉴定。【结果】分离得到256株微生物,初步鉴定120株;从中鉴定了一株产紫色杆菌素的杜擀氏菌BjR8,完成了基因组测序及分析,发现该菌基因组为一条环状染色体,全长7 205 593 bp,GC含量为64.67%,含有6 241个编码基因。生物信息学分析发现基因组含有9个次级代谢产物生物合成基因簇,其中7个基因簇与已知化合物编码基因簇同源性较低,说明该菌具有产生多种新型次级代谢产物的潜力;克隆得到紫色杆菌素生物合成基因簇,并在变铅青链霉菌TK23中完成了异源表达。【结论】从茎瘤芥根际分离得到256株微生物,初步分析了茎瘤芥根际的微生物菌群构成;完成了一株产紫色杆菌素杜擀氏菌的基因组测定与分析,从中克隆了紫色杆菌素基因簇,并成功在链霉菌中实现异源表达。     

石磺来源海洋链霉菌Streptomyces ardesiacus SCSIO LO23中germicidin类化合物的分离鉴定及其生物合成分析

海洋共附生放线菌具有生产结构特殊和活性显著化合物的潜力。【目的】以海洋软体动物石磺Onchidium sp.来源共附生海洋链霉菌Streptomyces ardesiacus SCSIO LO23为研究对象,分离并鉴定其次级代谢产物结构,分析化合物的生物合成基因簇及其生物合成途径。【方法】采用多种培养基对该菌株进行发酵优化并放大发酵,利用多种柱色谱方法分离得到germicidin类化合物,并利用波谱学手段和X-Ray单晶衍射技术完成化合物的结构鉴定;利用Illumina HiSeq对目标菌株进行全基因组测序,结合antiSMASH和BLAST在线分析软件实现菌株中germicidin类化合物生物合成基因功能注释和生物合成途径分析,并通过异源表达进一步确定其生物合成基因。【结果】从AM3培养基发酵产物中分离鉴定了6个吡喃酮类化合物germicidinA(1)、germicidinB(2)、germicidin D (3)、germicidin H (4)、isogermicidin A (5)和isogermicidin B (6),其中化合物2和6对斑马鱼神经行为有显著兴奋作用。通过对...     

珠江口沉积物来源链霉菌SCSIO 40020中bafilomycins的鉴定及其生物合成基因簇的异源表达

[目的] 从珠江口沉积物来源的菌株SCSIO 40020中分离bafilomycins,并对其生物合成基因簇进行克隆和异源表达研究。[方法] 通过分析菌株SCSIO 40020的16S rRNA基因序列并构建系统发育树以鉴定菌种,以柱层析法和制备色谱法对次级代谢产物进行分离纯化,借助波谱学手段完成单体化合物的结构鉴定,采用生物信息学分析定位bafilomycins的生物合成基因簇,通过筛选菌株SCSIO 40020基因组的细菌人工染色体文库和接合转移将bafilomycins生物合成基因簇导入3种链霉菌进行异源表达,利用高效液相色谱检测异源表达菌株的发酵产物。[结果] 菌株SCSIO 40020被鉴定为链霉菌属菌株,从其发酵产物中分离鉴定了2个单体化合物bafilomycins A₁和D。克隆了链霉菌SCSIO 40020中bafilomycins的生物合成基因簇并推导了其生物合成途径,在3种链霉菌中表达产生了bafilomycins。[结论] 从珠江口环境中获得了一株产生bafilomycins的链霉菌SCSIO 40020,成功建立了该菌株次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达体系,并首次在链霉菌Streptomyces lividans SBT18、Streptomyces coelicolor M1154和Streptomyces albus J1074中进行了表达,获得了bafilomycins,为后续bafilomycins结构类似物的生产和链霉菌SCSIO 40020中新结构活性化合物的挖掘奠定了基础。     

链霉菌隐性次级代谢产物生物合成基因簇的激活

链霉菌基因组中存在许多隐性次级代谢产物生物合成基因簇(cryptic secondary metabolite biosynthetic gene cluster,CSMG),在实验室条件下,它们多数处于沉默状态或者很低的表达水平。但在一定条件下这些CSMG可以被激活合成次级代谢产物,这为寻找新的活性天然产物提供新来源。本文总结了目前激活链霉菌CSMG所使用的方法,包括改变发酵条件、核糖体工程、共培养、异源表达、CSR(cluster-situated regulator)基因的遗传改造等。     

基于基因组挖掘的农抗120活性成分制霉菌素和丰加霉素的发现和鉴定

【目的】分析刺孢吸水链霉菌北京变种(农抗120产生菌)基因组和次级代谢产物组分,研究并鉴定农抗120产生菌中未被发现的活性组分。【方法】利用antiSMASH在线分析农抗120产生菌Streptomyces hygrospinosusvar.beijingensis基因组信息,锁定可能的制霉菌素和丰加霉素生物合成基因簇。利用HPLC和LC-MS等分析方法对农抗120产生菌发酵产物进行分析,同时利用制霉菌素和丰加霉素标准品作为对照,以鉴定该菌株代谢组分中的次级代谢产物。此外,通过构建目标基因簇大片段缺失突变株,并对所得突变株发酵产物进行检测,以确定生物合成基因簇与目的代谢产物的对应关系。【结果】本研究综合利用基因组序列分析、基因缺失突变株构建以及代谢产物检测方法,鉴定了农抗120产生菌中制霉菌素和丰加霉素两种活性成分,并确定了负责这些化合物合成的基因簇。【结论】本研究所构建的多重基因簇失活突变株为挖掘刺孢吸水链霉菌北京变种更多的天然次级代谢产物奠定了基础。     

东乡野生稻内生放线菌Streptomyces sp. PRh5的全基因组测序及序列分析

【目的】Streptomyces sp. PRh5是从东乡野生稻(Oryza rufipogon Griff.)中分离获得的一株对细菌和真菌都具有较强抗菌活性的内生放线菌。为深入研究PRh5菌株抗菌机制及挖掘次级代谢产物基因资源,有必要解析PRh5菌株的基因组序列信息。【方法】采用高通量测序技术对PRh5菌株进行全基因组测序,然后使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释、直系同源簇(COG)聚类分析、共线性分析及次级代谢产物合成基因簇预测等。【结果】基因组组装获得290 contigs,整个基因组大小约11.1 Mb,GC含量为71.1%,序列已提交至GenBank数据库,登录号为JABQ00000000。同时,预测得到50个次级代谢产物合成基因簇。【结论】将为Streptomyces sp. PRh5的功能基因组学研究及相关次级代谢产物的生物合成途径与异源表达研究提供基础。     

隐性次级代谢产物生物合成基因簇的激活及天然产物定向发现

传统的"活性-化合物"天然药物发现方法导致大量已知化合物被重复分离,大大加剧了新药发现的难度。规模化基因组测序揭示了微生物基因组中存在大量的隐性(cryptic)次级代谢产物生物合成基因簇,如何激活这些隐性基因簇成为当今世界天然产物研究领域的难点与热点。本文从途径特异性和多效性两个角度综述了隐性生物合成基因簇激活策略;同时,对基因组信息指导下结构导向(structure-guided)的化合物定向分离技术进行了归纳。隐性基因簇的激活为定向发掘具有优良活性的新型天然产物提供了新的契机。     

白色链霉菌DSM 41398中洋橄榄菌素和放线吡喃酮的发现及其生物合成途径分析

【目的】从菌株Streptomyces albus DSM 41398的发酵产物中发掘结构多样的由I型聚酮合酶催化形成的化合物,以期找到具有新颖结构或强生物活性的化合物。在结构鉴定的基础上,对其生物合成途径进行分析。【方法】利用HPLC分析方法,通过系统比较野生型菌株S.albus DSM 41398与I型聚酮合酶编码基因簇失活突变株的发酵产物差异,实现目标化合物的定向分离。然后,利用~1H-和~(13)C-NMR以及HR-ESI-MS进行化合物的结构鉴定。最后,利用生物信息学等方法对化合物的生物合成途径进行推测和分析。【结果】从5 L的S.albus DSM 41398发酵产物中,分离得到了2个具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物放线吡喃酮和洋橄榄菌素,分别定位了它们的生物合成基因簇,并分别对其生物合成途径进行了推导。其中,放线吡喃酮的生物合成基因簇为首次报道。【结论】本研究一方面为基因组发掘S.albus DSM 41398中其他由I型聚酮合酶催化形成的化合物提供参考,另一方面也为相关化合物的结构修饰改造奠定了良好的基础。     

雄烯二酮高产菌新金分枝杆菌MN4的全基因组测序及序列分析北大核心CSCD

【目的】新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)MN4是1株经诱变育种获得的高产雄烯二酮,并且能够耐受高浓度底物植物甾醇的突变菌株。为深入研究MN4菌株耐底物的机制及雄烯二酮的生物合成途径,有必要解析MN4菌株的全基因组序列信息。【方法】本研究采用高通量测序技术对MN4进行全基因组测序,然后使用相关软件对测序数据进行基因组装、基因预测与功能注释、COG聚类分析以及次级代谢产物合成基因簇预测等。【结果】新金分枝杆菌MN4基因组装获得33个Contigs,整个基因组大小为5.39 Mb,GC含量为66.9%,编码4920个蛋白基因,序列提交至Gen Bank数据库,登录号为JXYZ00000000。【结论】本研究首次报道了1株高产雄烯二酮菌株MN4的全基因组序列,分析了基因组的基本特征,初步解析了该菌株降解植物甾醇生产雄烯二酮的关键基因,将为MN4的功能基因组学研究及相关次级代谢产物的生物合成途径与异源表达研究提供基础。     

一种适用于链霉菌异源合成基因簇同框缺失的高效方法

【背景】对抗生素生物合成途径的阐明有助于提高目标化合物的产量并开发具有更高活性的新化合物。基因的同框缺失是天然产物生物合成研究的常规手段,通过分析突变菌株积累的中间产物,可以帮助推导天然产物的合成途径及相关基因的功能。天然产物生物合成基因簇的大小一般在20 kb以上,对每个基因进行同框缺失耗时耗力,因此,优化链霉菌来源的基因同框缺失的方法有重要的意义。【目的】基于PCR-targeting重新设计了一套在链霉菌柯斯文库质粒上进行基因同框缺失的方法,实现链霉菌基因在大肠杆菌中快速、高效的基因同框缺失的技术体系。【方法】使用氨苄青霉素抗性基因bla作为PCR-targeting DNA片段的筛选标记,同时使用体外的Pac I酶切和酶连系统代替体内的Flp/FRT系统来介导同框缺失的构建。【结果】利用这种方法,在6 d内完成了米多霉素生物合成基因簇中14个基因的同框缺失。【结论】此方法与传统的PCR-targeting方法相比,构建同框缺失载体的效率明显提高;Pac I识别序列在链霉菌基因组上的稀有性使得此方法在构建抗生素生物合成基因簇必需基因的同框缺失载体上具有普适性。     

三烷基取代芳香聚酮gombapyrones生物合成基因簇的确认及其生物合成推导

【目的】本研究旨在确认链霉菌Streptomyces rubellomurinus ATCC 31215来源芳香聚酮化合物(gombapyrones, GOMs)的生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster, BGC),并对其生物合成途径进行推导。【方法】对链霉菌S. rubellomurinus ATCC 31215进行大规模发酵及提取分离,得到GOM-B和GOM-D;以三烷基取代芳香聚酮生物合成途径保守存在的P450单氧化酶的蛋白序列作为探针,在GOMs产生菌S. rubellomurinus基因组中进行BLAST搜索获得潜在的GOMs生物合成基因簇(gom BGC);通过对gom BGC中的聚酮合成酶(polyketide synthase, PKS)结构基因进行同框缺失突变,对突变株发酵产物进行高效液相色谱-质谱(highperformanceliquidchromatography-massspectrometry,HPLC-MS)分析以确认gomBGC与GOMs的产生相关;基于生物信息学分析,推导GOM-B的生物合成途径。【结果】从S. rubell...     

珊瑚来源真菌Parengyodontium album SCSIO SX7W11中聚酮化合物的发现及其生物合成途径分析

海洋来源真菌的天然产物因其独特的结构与生物学活性而备受关注,而利用基因组信息对其代谢产物进行深入挖掘也成为研究策略之一。[目的] 本文以一株南海珊瑚来源的真菌Parengyodontium album SCSIO SX7W11为目标菌株,挖掘其生产聚酮类化合物的潜能。[方法] 本研究利用Illumina Miseq技术对SX7W11菌株进行全基因组扫描测序,运用生物信息学手段对其基因组的生物合成基因簇进行预测和基因功能注释,挖掘可能产生新颖聚酮化合物的基因簇。对SX7W11进行放大发酵后,利用正相色谱、中压反相色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱、HPLC半制备等分离手段分离纯化出单体化合物。再利用高分辨质谱（HR-ESI-MS）、¹H NMR、¹³C NMR、X-ray单晶衍射等波谱手段确定化合物的结构,并根据生物合成基因簇对化合物的生物合成途径进行推导。[结果] 全基因组扫描测序结果显示,P.album SCSIO SX7W11基因组大小为34.0 Mb,含有24个生物合成基因簇,包括6个聚酮合酶基因簇以及3个萜烯合酶基因簇。从发酵产物中分离鉴定到3个聚酮类化合物：emodin（1）、alternaphenol B（2）和sydowinin A（3）,其中化合物3获得了单晶结构数据。通过生物信息学方法从菌株基因组中定位到了sydowinin A的生物合成基因簇。结合文献对emodin（1）、alternaphenol B（2）和sydowinin A（3）的生物合成途径进行了分析。[结论] 本研究通过基因组挖掘及培养基优化,发现1株珊瑚来源的真菌P.album SCSIO SX7W11具有生产sydowinins类聚酮类化合物的能力,为该类化合物生物合成机制深入研究奠定了基础。     

红色红曲菌M7的丝衣霉酸基因簇及其功能研究

【目的】明确红色红曲菌(Monascus ruber) M7的基因组中是否存在丝衣霉酸(byssochlamic acid, BA)基因簇,并探讨BA基因簇中聚酮合酶基因mr-Bys及3-羟酰基辅酶A脱氢酶基因mr-hdh对BA产生的影响。【方法】采用生物信息学方法对M7基因组进行分析,以确定BA候选基因簇;以基因敲除及过表达方法研究mr-Bys和mr-hdh对BA产生的影响;以超高效液相色谱(ultra-performance liquid chromatography, UPLC)和质谱(mass spectrometry, MS)方法分析BA。【结果】在红色红曲菌M7基因组中发现了BA基因簇,敲除mr-Bys后,BA消失,而敲除和过表达mr-hdh均可影响BA的产生。【结论】红色红曲菌M7基因组中存在BA基因簇,可产生BA。研究结果不仅丰富了红曲菌次生代谢产物及其合成途径的相关研究,也为以红曲菌为菌种开发新产品奠定了基础。     

金霉素生物合成基因簇中调控基因ctcB的功能

【目的】研究金霉素产生菌中SARP家族转录调控基因ctc B的作用。【方法】利用大肠杆菌、链霉菌的属间接合转移和同源重组双交换的方法,构建ctc B基因缺失突变株。通过c DNA在相邻同转录方向的基因间隔进行PCR验证,确定金霉素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株金霉素生物合成基因簇的转录水平检测。随后,生物信息学预测分析了金霉素生物合成基因簇内Ctc B与DNA的结合位点。【结果】获得了ctc B基因缺失的双交换突变株。发酵结果显示,该突变株失去产生金霉素与四环素的能力。金霉素生物合成基因簇内有6个共转录单元,其中4个共转录单元在ctc B基因缺失突变株中转录水平明显下降。软件分析预测到一致性较高的Ctc B结合重复序列。【结论】ctc B正调控金霉素生物合成结构基因ctc G-D、ctc H-K、ctc N-P、ctc W-T 4个转录单元和ctc Q,为进一步研究ctc B调控机制奠定了基础。     

非核糖体多肽Surugamides生物合成基因簇镶嵌式结构的解析

【目的】多肽化合物Surugamides(sgm)生物合成基因簇包含4个非核糖体多肽合酶(NRPS)基因surA–D,负责2个NRPS生物合成途径。已有报道确认surA基因与SurugamideA产物相关,而surB基因与sgm F产物相关,但对surC和surD基因功能的归属尚没有实验证据。本工作拟在之前研究的基础上进一步确认surA和surD负责Surugamide A产物生物合成,为基因工程改造Surugamides生物合成途径以及研究其NRPS蛋白之间的识别机制提供理论依据。【方法】从海绵中分离放线菌并通过16S rRNA基因序列比对分析其分类单元。通过在线数据库antiSMASH分析基因组序列,发现天然产物生物合成基因簇。通过UPLC-Q-TOF-MS和~(13)CNMR鉴定化合物结构。把构建完成的同源重组双交换质粒导入链霉菌宿主后筛选基因缺失或替换突变株。【结果】从胄甲海绵来源链霉菌S.albidoflavus LHW3101基因组中发现了Surugamides生物合成基因簇,确认了该菌株发酵产物中的化合物sgmA和sgm F。构建了surB和surC基因同时缺失的突变株RJ9,发现RJ9不再产sgm F而仍然产Surugamide A。在缺失突变surB和surC基因的同时在surD基因前引入了组成型强启动子ermEp*,结果发现RJ9产SurugamideA水平是野生型菌株的约2倍。【结论】确认了surB和surC基因与sgmA产物无关。在surD基因前引入强启动子后显著提高了SurugamideA的产量,提示surD基因与sgmA产物相关,结合已报到surA基因与Surugamide A产物相关的证据,进一步确认了surA和surD基因负责Surugamide A生物合成的推论。