NDRG2 通过调控CD24 影响肝癌细胞侵袭能力的研究

目的：阐明NDRG2（N-Myc downstream-regulated gene 2）在肝癌细胞中对CD24 的调控及其对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。 方法：Western blot 检测低转移性的肝癌细胞Huh7、高转移性的肝癌细胞系MHCC97h 及正常人肝细胞系L-02 中NDRG2 和 CD24 的表达;通过腺病毒载体上调MHCC97h 细胞中NDRG2 的水平,或利用siRNA 下调Huh7 细胞中NDRG2 的表达,检测 CD24 的变化以及细胞侵袭能力的改变。结果：MHCC97h 细胞中NDRG2 基因和蛋白的表达水平低于Huh7 细胞,而CD24 的表达 水平高于Huh7 细胞;在MHCC97h 细胞中上调NDRG2 可以抑制CD24 的表达并抑制其侵袭能力,而在Huh7 细胞中下调 NDRG2 的表达可以提高CD24 的水平及细胞的侵袭能力。结论：NDRG2 可能通过影响CD24 参与调控肝癌细胞的侵袭能力。     

NDRG2通过调控CD24影响肝癌细胞侵袭能力的研究

目的：阐明NDRG2（N-Myc downstream-regulated gene2）在肝癌细胞中对CD24的调控及其对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。方法：Western blot检测低转移性的肝癌细胞Huh7、高转移性的肝癌细胞系MHCC97h及正常人肝细胞系L-02中NDRG2和CD24的表达;通过腺病毒载体上调MHCC97h细胞中NDRG2的水平,或利用siRNA下调Huh7细胞中NDRG2的表达,检测CD24的变化以及细胞侵袭能力的改变。结果：MHCC97h细胞中NDRG2基因和蛋白的表达水平低于Huh7细胞,而CD24的表达水平高于Huh7细胞;在MHCC97h细胞中上调NDRG2可以抑制CD24的表达并抑制其侵袭能力,而在Huh7细胞中下调NDRG2的表达可以提高CD24的水平及细胞的侵袭能力。结论：NDRG2可能通过影响CD24参与调控肝癌细胞的侵袭能力。     

应用siRNA技术探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的VEGF对树突状细胞的影响

为探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor, VEGF）对树突状细胞（dendritic cell, DC）功能及其分化的影响,针对VEGF基因设计siRNA（small interfering RNA, siRNA),采用脂质体转染法以100 nmol/L最佳转染浓度导入MCF-7乳腺癌细胞（siRNA组）,以脂质体Lipofectamine　2000TM转染MCF-7 乳腺癌细胞培养上清培养正常DC作为对照（对照组）,采用ELISA法检测经siRNA 干扰VEGF基因后的MCF-7 乳腺癌细胞分泌的VEGF因子含量, Western 印迹检测VEGF蛋白表达,以探讨siRNA的基因沉默效果;以siRNA组和对照组培养上清分别培养外周血单个核细胞,用流式细胞仪检测所诱导DC表型CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达,用MTT法检测转染前后两组DC 诱导的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）对MCF-7细胞的细胞毒作用.结果显示,MCF-7 乳腺癌细胞培养上清能明显抑制正常DC分化成熟及抗原递呈能力,干扰VEGF基因后MCF-7 乳腺癌细胞培养上清对DC的影响明显降低,CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达较对照组显著升高,而CD1a表达下降（P＜0.01）.转染前后DC 诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤活性有明显差异（P＜0.01）.由此可见,siRNA可靶向抑制MCF-7乳腺癌细胞VEGF的表达,下调VEGF后的MCF-7 细胞上清对DC分化成熟及功能的抑制作用明显降低,从而推测VEGF在肿瘤的发生、发展和免疫抑制方面可能起着重要的作用.     

腺病毒载体AdING4 对MCF-7乳腺癌细胞的增殖抑制及化疗增敏作用

目的:研究腺病毒载体AdING4对人MCF-7乳腺癌细胞的生长抑制及化疗增敏作用。方法:将搭载有ING-4基因的重组腺病毒载体AdING4感染人MCF-7乳腺癌细胞,用荧光显微镜观察感染后的MCF-7细胞形态学变化;RT-PCR和Western-Blot法检测ING-4基因在MCF-7细胞中的转录和表达;RT-PCR法检测凋亡相关基因在MCF-7细胞中的表达;CCK法测定Ad-ING4感染MCF-7乳腺癌细胞后所发挥的细胞增殖抑制作用。流式细胞技术检测ING-4对MCF-7乳腺癌细胞的促凋亡作用。CCK-8法分别测定病毒感染前后的MCF-7乳腺癌细胞的药物半数抑制浓度IC50,并观察Ad-ING4与化疗药物合用后对MCF-7细胞增殖抑制和化疗增敏现象。结果:MCF-7细胞在转染ING-4基因后,明显出现变圆、脱落、皱缩、聚集等现象;外源性ING-4基因在MCF-7细胞中获得成功表达;外源性ING-4基因作用下MCF-7细胞的增殖受到了明显抑制,凋亡率有所升高,凋亡相关基因Bax的表达水平明显上调,Bcl-2、Survivin的表达水平明显下调。ING-4基因感染MCF-7细胞后,使MCF-7细胞对相关化疗药物的敏感度更高;ING-4基因与化疗药物合用后对MCF-7细胞的增殖抑制作用,较之单用化疗药物更为明显。结论:MCF-7细胞在转染ING4基因后其增殖受到了明显抑制并更易凋亡,该现象可能是通过改变Bax,Bcl-2及Survivin表达水平来实现的,且对化疗药物的敏感性更高。     

硫酸化茯苓多糖对人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的影响

为了探讨硫酸化茯苓多糖(SP)对人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的影响,采用MTT法检测不同浓度、作用时间SP对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用,倒置显微镜观察MCF-7细胞的形态学变化,RT-PCR检测SP处理MCF-7细胞凋亡相关基因(Bcl-2,Bax)的表达;Western blotting技术检测SP对乳腺癌细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达变化。结果表明,SP对MCF-7细胞增殖有抑制作用,且在一定范围内呈剂量效应;细胞贴壁能力减弱,细胞间隙增大,胞膜褶皱;Bcl-2基因表达水平和蛋白表达水平明显降低(p0.05),Bax基因表达水平和蛋白表达水平明显升高(p0.05)。基于以上研究,SP通过促凋亡基因Bax的表达,抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达来下调Bcl-2/Bax比值,激活凋亡途径,诱导MCF-7细胞的凋亡。     

靶向VEGF小干扰RNA协同5-FU诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡机制的研究

探讨慢病毒介导的靶向VEGF小干扰RNA联合应用化疗药物5 FU诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的机制。以携带VEGF siRNA的慢病毒载体感染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组VEGF mRNA、VEGF蛋白及凋亡相关蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明,慢病毒VEGF siRNA干扰组细胞VEGF mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组,凋亡相关蛋白P53及P21表达上调,而SIRT1、Bcl-2及Survivin表达下调。流式细胞术检测显示慢病毒干扰组及5-FU组细胞凋亡率显著升高,联合治疗组的协同作用更为明显。上述结果表明：慢病毒介导的RNA干扰能明显抑制MCF-7细胞VEGF的表达,通过下调SIRTI蛋白的表达,导致P53蛋白表达上调,并调控其下游P21、bcl-2和Survivin的表达,从而诱导MCF-7细胞的凋亡,并且提高了MCF-7对5-FU的敏感性。     

shRNA下调MTDH基因抑制人乳腺癌MCF-7细胞HIF-1α及VEGF表达

目的：探讨转移粘附基因（metadherin,MTDH）的表达对人乳腺癌细胞中肿瘤血管生成相关分子标志物缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：将针对MTDH基因的干扰质粒MTDH-shRNA转染乳腺癌MCF-7细胞,RT-PCR及Western blot验证其对MTDH基因的沉默效果;应用Western blot检测转染前后MCF-7细胞中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及血管内皮生长因子（VEGF）在蛋白水平上的表达变化;MTT实验检测下调MTDH对MCF-7细胞增殖情况的影响。结果：MCF-7细胞转染48小时后,MTDH-shRNA转染组和MTDH-shRNA-neg转染组转染效率约70%。MTDH-shRNA转染组中MTDH在mRNA及蛋白水平上表达明显下调,此外HIF-1α及VEGF蛋白表达明显降低,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。MTDH-shRNA转染组MCF-7细胞增殖明显受到抑制,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：在乳腺癌MCF-7细胞中下调MTDH基因可以抑制HIF-1α、VEGF表达及细胞增殖,提示MTDH基因可能对乳腺癌肿瘤血管生成有促进作用。     

LRP16通过调控E-钙粘合素的表达促进MCF-7细胞的侵袭生长

LRP16在原代乳腺癌组织中表达水平与雌激素受体α（ERα）表达状态以及腋窝淋巴结侵袭数目密切相关.为研究LRP16基因对乳腺癌MCF-7细胞侵袭生长的影响,并探讨涉及的分子机制,采用基质胶黏附实验与Transwell方法,检测内源性LRP16表达抑制MCF-7细胞的体外黏附、侵袭生长与迁移特征.结果表明,抑制LRP16在MCF-7细胞中的表达,降低了细胞的体外黏附、侵袭与迁移能力;采用FVB小鼠进行的实验性转移试验结果显示,抑制LRP16显著降低了MCF-7细胞的肺转移结节数目;为探索可能的分子机制,采用Western印迹方法,检测了LRP16对乳腺癌转移相关分子MMP-2, MMP-9, CD44和E-钙黏着蛋白表达的影响,结果在LRP16抑制的MCF-7细胞中只有E-钙黏着蛋白蛋白表达上调.进一步的Northern印迹与免疫组化实验结果表明,抑制LRP16可上调MCF-7细胞中E 钙黏着蛋白基因的mRNA与蛋白表达水平;共转染与双荧光素酶方法检测LRP16对E-钙黏着蛋白基因启动子的表达调控效应,结果显示,LRP16抑制E 钙黏着蛋白基因基因5′-近端启动子的转录激活,该抑制效应选择性存在于内源性ERα阳性细胞,并且依赖于雌激素的存在;染色质免疫共沉淀方法（ChIP）检测ERα与E-钙黏着蛋白基因启动子的相互作用,结果显示,在LRP16基因表达缺陷的MCF-7细胞中,ERα抗体沉淀到E-钙黏着蛋白基因启动子的DNA序列;上述研究结果表明,抑制LRP16基因表达,削弱了激素依赖型乳腺癌细胞的侵袭生长能力,其分子机制涉及了LRP16通过ERα介导对E-钙黏着蛋白基因基因转录激活的调控.     

Sprouty2蛋白与人乳腺癌MCF-7细胞增殖与迁徙的关系

目的：探讨Sprouty2蛋白与人乳腺癌MCF-7细胞增殖与迁徙的关系。方法：通过siRNA技术干扰MCF-7细胞sprouty2基因的表达,通过qPCR,细胞免疫荧光和westernblotting检测sprouty2基因的干扰效果,MTT检测细胞增殖活力,划痕实验观察细胞迁徙能力,westernblotting检测MMP-2,MMP-9和MMP-13的表达。结果：qPCR,细胞免疫荧光和westernblotting检测sprouty2基因,发现sprouty2基因的下调很明显,MTT实验发现siRNASprouty2基因后的MCF-7细胞比对照组细胞活力明显提高,沉默组细胞的迁徙能力也明显强于对照组,且沉默sprouty2基因的MCF-7细胞,MMP-2,MMP-9和MMP-13蛋白相对对照组均上调。结论：sprouty2基因下调后,MCF-7细胞的细胞活力和迁徙能力明显提高。     

抑制VEGF基因表达对乳腺癌细胞细胞周期的影响

目的：研究针对VEGF基因的siRNA（small interferenceRNA）对乳腺癌MCF-7细胞细胞周期的影响。方法：依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对VEGF基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。脂质体转染法将合成的siRNA转染入MCF-7细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNAscr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响：流式细胞法检测细胞周期变化,RT—PCR法比较转染前后p21、CyclinDl表达水平的变化,Westemblot检测转染前后磷酸化ERK的表达。结果：细胞计数法结果显示,转染24h后siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。siRNA转染后能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0／G1期,S期细胞明显减少,G0／G1期细胞比例逐渐增多;p21mRNA表达显著上调,抑制CyclinD1mRNA及磷酸化ERK蛋白的表达。结论：体外转录合成的siRNA可能通过上调细胞周期蚤白激酶抑制剂p21的表达,下调CyclinDl及磷酸化ERK的表达,将细胞周期阻滞于G0／G1期,从而显著抑制MCF-7细胞的增殖。     

Inhibition of endothelial cell proliferation and tumor angiogenesis by up-regulating NDRG2 expression in breast cancer cells

The N-myc downstream-regulated gene 2 (NDRG2) is involved in tumor cell differentiation and apoptosis, but its function in tumor angiogenesis remains to be established. Here, we employed adenovirus overexpressing NDRG2 (Ad-NDRG2) to efficiently up-regulate target gene expression in the NDRG2-low-expressing, breast cancer cell line MCF-7. Moreover, VEGF secretion was decreased in MCF-7 cells infected by Ad-NDRG2, and medium conditioned by these infected cells could significantly inhibit the proliferation, tube formation and invasion of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Further study indicated that the angiogenesis promoting factors VEGF and HIF-1α were down-regulated, whereas the angiogenesis suppressing factors p53 and VHL were up-regulated in MCF-7 cells infected by Ad-NDRG2. Finally, in a nude mouse model, intratumoral injections of Ad-NDRG2 every 3 days for 20 days significantly inhibited the growth and angiogenesis of xenografted MCF-7 tumors. In summary, these data indicate that NDRG2 may be involved in angiogenesis by impacting the expression of angiogenesis related factors. Thus, specific overexpression of NDRG2 by adenovirus represents a promising approach for the treatment of tumor angiogenesis.     

低氧条件下奥巴克拉联合吉西他滨对乳腺癌细胞的作用

目的: 研究在低氧条件下,奥巴克拉(OBX)联合吉西他滨(GEM)对乳腺癌细胞MCF-7、BT-20的细胞活性、迁移、侵袭及凋亡的影响。方法: 选取乳腺癌细胞MCF-7与BT-20细胞,分组为正常氧组,低氧组,GEM组,OBX+GEM组。正常氧组:37℃,5% CO₂培养箱培养24 h与48 h;低氧组:37℃,1%O₂,5% CO₂ ,94% N₂条件下培养24 h与48 h; GEM组:37℃,1%O₂,5% CO₂ , 94% N₂,加入终浓度为10 μmol/L的GEM培养24 h与48 h;OBX+ GEM组:7℃,1%O₂,5% CO₂ ,94% N₂,加入终浓度为10 μmol/L的GEM与终浓度为50 nmol/L的OBX培养24 h与48 h。利用Western blot检测正常氧及低氧条件下MCF-7与BT-20细胞中低氧诱导因子(HIF-1α)的表达;利用CCK-8实验检测各组中MCF-7与BT-20细胞活性,每组设置15个复孔;利用划痕实验检测各组MCF-7与BT-20细胞迁移能力,每组设置6个复孔;利用Western blot检测各组MCF-7细胞中vimentin、E-Cadherin及p53蛋白的表达。结果: HIF-1α在低氧条件下培养的细胞中的表达远远高于其在正常氧条件下培养的细胞中的表达(P＜0.05),说明低氧条件成功;与低氧组相比较,GEM可降低MCF-7与BT-20细胞迁移能力和细胞活性(P＜0.05),减少细胞中vimentin的表达(P＜0.01),促进E-Cadherin和p53的表达(P＜0.01);与GEM组相比较,OBX联合GEM组可明显降低细胞活性和MCF-7与BT-20细胞的迁移能力(P＜0.01),显著降低细胞中vimentin的表达(P＜0.01),显著升高E-Cadherin和p53的表达(P＜0.01)。 结论:在低氧条件下,OBX联合小剂量GEM可显著抑制乳腺癌细胞的生长、迁移、侵袭,增强GEM对乳腺癌细胞的促凋亡作用,具体机制尚需要进一步研究。     

人体乳腺癌细胞系Bcap－37和MCF－7的细胞遗传学研究

应用低温同步法与秋水酰胺处理,对人体乳腺癌细胞系Ｂｃａｐ－３７和ＭＣＦ－７的中期及早中期细胞进行Ｇ－显带分析。研究表明,Ｂｃａｐ－３７细胞染色体众数为６３,可识别其结构的标记染色体１７条;ＭＣＦ－７细胞染色体众数为５６,可识别其结构的标记染色体１３条。结合文献报道以及本研究结果显示,乳腺癌中最常涉及到第１、３、５、７、１１、１３和１７号染色体结构及数目的异常,染色体断裂点１ｐ１１（１ｑ１１）、１ｐ１３、３ｐ２１、３ｑ１１、５ｑ１１、６ｑ１３、６ｑ２３、７ｑ２２、１１ｐ１３和１１ｐ１５也经常涉及;它们可能与癌相关基因的激活和抗癌基因的丢失有关,从而在乳腺癌发生发展中起一定作用。     

miR-449a对人乳腺癌细胞MCF-7增殖及迁移能力的影响

目的：通过敲低微小RNA （microRNA,miRNA）-449a的方法研究miR-449a对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖和迁移能力的影响。方法：采用miRNA芯片在乳腺癌细胞MCF-7和人正常乳腺细胞MCF-10A筛选具有表达差异的miRNA;化学合成法制备miR-449a的抑制剂（inhibitor）,转染后经real-time PCR验证表达的变化;细胞增殖CCK-8实验对转染后细胞增殖能力进行检测;划痕实验检测细胞转移能力,transwell小室实验检测细胞侵袭的改变;蛋白免疫印迹法（Western blot）实验对MCF-7细胞增殖和迁移相关的β-catenin和E-cadherin蛋白进行检测;通过生物信息学软件预测miR-449a潜在靶基因为Notch 1,荧光素酶实验检测Notch 1是miR-449a的靶基因。结果：分别收集MCF-7和MCF-10A细胞,芯片结果显示miR-449a在MCF-7细胞的表达水平显著高于MCF-10A;本研究将细胞分为未处理组（Mock组）,阴性对照组（negative control组,NC组）和处理组,通过收集不同组MCF-7细胞进行试验,CCK-8结果显示miR-449a下调后MCF-7细胞增殖能力显著降低;划痕实验结果显示miR-449a表达降低导致MCF-7细胞转移能力降低;transwell实验结果显示MCF-7细胞侵袭受到抑制;Western blot结果发现miR-449a敲低后β-catenin表达降低,E-cadherin表达增加;荧光素酶试验结果显示,miR-449a能够显著降低Notch 1-3'-UTR质粒的荧光素活性（P<0.01）。结论：在乳腺癌细胞MCF-7中敲低miR-449a能够显著抑制癌细胞增殖和迁移,而这一变化可能通过降低Notch 1蛋白表达实现的。     

Bone morphogenetic protein-4 induced by NDRG2 expression inhibits MMP-9 activity in breast cancer cells

In the current study, we examined the function of N-myc downstream-regulated gene 2 (NDRG2) expression in breast cancer cells, especially focusing on the role of bone morphogenetic protein-4 (BMP-4) induced by NDRG2. NDRG2 expression in MDA-MB-231 cells inhibited the mRNA expression of several matrix metalloproteinases (MMPs) and the gelatinolytic activity of MMP-9. Interestingly, a specific induction of active BMP-4 was exclusively observed in MDA-MB-231-NDRG2 cells but not in MDA-MB-231-mock cells. Neutralization of BMP-4 in MDA-MB-231-NDRG2 cells resulted in the rescue of MMP-9 mRNA expression and migration capacity. In addition, treatment with recombinant BMP-4 dramatically suppressed MMP-9 mRNA expression, gelatinolytic MMP-9 activity, migration, and invasion capacity both in MDA-MB-231 and PMA-treated MCF-7 cells. Collectively, our data show that BMP-4 induced by NDRG2 expression inhibits the metastatic potential of breast cancer cells, especially via suppression of MMP-9 activity.     

CD24 regulates cell proliferation and transforming growth factor β-induced epithelial to mesenchymal transition through modulation of integrin β1 stability

To determine the role of CD24 in breast cancer cells, we knocked down CD24 in MCF-7 human breast cancer cells by retroviral delivery of shRNA. MCF-7 cells with knocked down CD24 (MCF-7 hCD24 shRNA) exhibited decreased cell proliferation and cell adhesion as compared to control MCF-7 mCD24 shRNA cells. Decreased proliferation of MCF-7 hCD24 shRNA cells resulted from the inhibition of cell cycle progression from G1 to S phase. The specific inhibition of MEK/ERK signaling by CD24 ablation might be responsible for the inhibition of cell proliferation. Phosphorylation of Src/FAK and TGF-β1-mediated epithelial to mesenchymal transition was also down-regulated in MCF-7 hCD24 shRNA cells. Reduced Src/FAK activity was caused by a decrease in integrin β1 bound with CD24 and subsequent destabilization of integrin β1. Our results suggest that down-regulation of Raf/MEK/ERK signaling via Src/FAK may be dependent on integrin β1 function and that this mechanism is largely responsible for the CD24 ablation-induced decreases in cell proliferation and epithelial to mesenchymal transition.