牛乳铁蛋白肽转基因小鼠的构建

目的:探讨牛乳铁蛋白肽在转基因鼠乳汁中的表达及其抑菌活性。方法:将实验室构建并保存的包含山羊β-酪蛋白基因启动子和牛乳铁蛋白肽基因的乳腺特异表达载体PI-bcp-LfcinB,用Xho I和Nru I双酶切,得到含有全部表达盒的显微注射DNA片段,采用常规显微注射技术获得转基因小鼠。并通过对泌乳期转基因雌鼠乳腺组织的RT-PCR检测,确定了牛乳铁蛋白肽在mRNA水平的表达,同时利用琼脂板扩散法检测了转基因鼠乳汁中表达产物的抑菌活性。结果:获得了牛乳铁蛋白肽转基因小鼠,且转基因小鼠乳汁中能够表达具有抑菌活性的牛乳铁蛋白肽。结论:通过转基因动物乳腺可以获得具有生物活性的牛乳铁蛋白肽,为进一步研究抗菌肽转基因牛、培育抗乳房炎奶牛新品种以及通过建立转基因动物生物反应器进行抗菌肽的大量生产奠定了基础。     

乳酸乳球菌表达重组牛乳铁蛋白肽的抑菌活性分析

牛乳铁蛋白肽是由牛乳铁蛋白经消化酶水解产生的一类具有广谱抑菌活性的短肽;乳酸乳球菌作为食品级微生物,既有天然的益生作用,又是理想的表达牛乳铁蛋白肽的载体。【目的】探究重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363表达牛乳铁蛋白肽的抑菌活性。【方法】利用牛乳铁蛋白肽标准品绘制定量标准曲线来确定重组牛乳铁蛋白肽的含量,利用牛津杯法及微量肉汤稀释法测定重组牛乳铁蛋白肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等35株细菌的抑菌活性及最小抑菌浓度,利用扫描电镜、透射电镜、荧光显微镜、凝胶阻滞试验、黏附试验来探究重组牛乳铁蛋白肽对菌体结构、细菌DNA及黏附力的影响,利用CCK-8检测其对RAW 264.7细胞的毒性作用,并对小鼠红细胞溶血率进行测定。【结果】重组乳酸乳球菌上清中牛乳铁蛋白肽的浓度为24.39μg/mL,重组牛乳铁蛋白肽对测试的25株致病菌均有不同程度的抑制作用,抑菌浓度范围在16–128μg/mL,但对9株乳酸菌以及粪肠球菌没有明显的抑制作用,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、鸡白痢沙门菌的菌体完整性具有不同程度的破坏作用,其主要作用靶点为细菌的细胞膜,可以与细菌DNA结合并抑制细菌对Caco-2、IPEC细胞的黏附作用,重组牛乳铁蛋白肽对小鼠红细胞及RAW 264.7细胞没有明显的细胞毒性。【结论】乳酸乳球菌表达重组牛乳铁蛋白肽的抑菌活性与牛乳铁蛋白肽标准品相一致,通过直接作用于细菌细胞膜、胞内核酸或抑制细菌对正常细胞的黏附作用等多方面实现抑制或杀死细菌,发挥广谱的抗菌活性,且对真核细胞没有明显的细胞毒性作用。     

饲料中添加牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼生长性能、消化酶活力、肠道组织结构及抗病力的影响

为探讨饲料中添加不同水平牛乳铁蛋白肽(Bovine lactoferricin, LfcinB)对大口黑鲈(Micropterus salmoides)幼鱼生长性能、消化酶活力、肠道组织结构及抗病力的影响,试验选取了初均重为(19.88±0.03) g的450尾大口黑鲈,随机分成5组,每组3个重复,分别在基础饲料中添加0(阴性对照组)、1000、1500和2000 mg/kg牛乳铁蛋白肽,并设置基础饲料+30 mg/kg氟苯尼考为阳性对照组,共5种试验饲料。试验周期为8周。结果表明:(1)随着牛乳铁蛋白肽添加量的增加,大口黑鲈的末均重(FBW)、增重率(WGR)和特定生长率(SGR)均呈现先升高后降低的趋势, 1000 mg/kg牛乳铁蛋白肽组大口黑鲈的生长性能最好且与对照组(阴性对照、阳性对照)对应数据差异显著(P<0.05)。(2)与两个对照组比, 1000 mg/kg牛乳铁蛋白肽组大口黑鲈的肠道胰蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶活力均显著上升(P<0.05)。(3)与两个对照组比,饲料中添加1000 mg/kg牛乳铁蛋白肽可显著提高大口黑鲈前肠、中肠及后肠的绒毛高度和宽度(...     

乳铁蛋白肽基因的合成及其在动物乳腺中的表达

根据已发表的编码牛乳铁蛋白肽(LfcinB)25个氨基酸的mRNA序列,设计了4条用于合成牛乳铁蛋白肽全基因的引物,用重叠延伸PCR法合成149 bp的牛乳铁蛋白肽基因(包括牛乳铁蛋白信号肽序列、上下游酶切位点和终止密码子),并将此基因克隆到载体pI-B,获得了乳腺特异性表达质粒pI-BL,该质粒经生理盐水稀释后直接注入稳定泌乳期奶山羊和奶牛乳腺组织(注射量为400μg),以琼脂板溶圈法检测奶样抑菌活性。结果显示,注射后3~48 h,奶样有明显抑菌活性,其中3~9 h抑菌活性最高。     

牛乳铁蛋白素(1-15)-蜂毒素(5-12)杂合肽基因的合成及在大肠杆菌中的表达

为了构建新型的杂合肽,设计了一种新型杂合抗菌肽牛乳铁蛋白素(1-15)-蜂毒素(5-12),由牛乳铁蛋白素(LfcinB)N端第1~15个氨基酸残基和蜂毒素(Melittin)N端第5~12个氨基酸残基组成。根据大肠杆菌密码子的偏爱性,设计合成了杂合肽LfcinB(1-15)-Melittin(5-12)的基因片段,插入到表达载体pET-32a的NcoI和SalI的酶切位点之间,构建重组表达质粒。重组表达质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,融合蛋白以可溶形式在Escherichia coli BL21(DE3)中获得成功表达,表达量占菌体总蛋白的35%以上,每升培养物可获得35mg融合蛋白。带His标签的融合蛋白经His-Bind纯化试剂盒纯化、肠激酶切割和抑菌实验表明,杂合肽具有明显的抑菌效果。这为利用基因工程方法生产抗菌肽奠定了理论基础。     

牛乳铁蛋白素及其衍生物的研究进展

牛乳铁蛋白素是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶水解后释放出来的一段小肽,是牛乳铁蛋白的活性中心。通过对不同动物来源乳铁蛋白素活性的研究发现牛乳铁蛋白素的抗菌活性最强。进一步的丙氨酸突变实验研究表明,在牛乳铁蛋白素活性最强的15个氨基酸序列中,色氨酸在抗菌过程中起着重要作用。牛乳铁蛋白素正是因为含有两个色氨酸,其活性才会比只含有一个色氨酸的其它来源的乳铁蛋白素活性要高。很多实验室围绕着牛乳铁蛋白素中的色氨酸、碱性氨基酸和其他一些芳香族氨基酸展开了一系列的突变研究,本文综述了这些研究及在氨基酸改变后活性的变化,为以后研究及开发牛乳铁蛋白素提供理论基础。     

牛乳铁蛋白肽(LfcinB)在苏云金芽胞杆菌中的融合表达

牛乳铁蛋白肽（bovine lactoferrincin,LfcinB）来源于牛乳铁蛋白（bovine lactoferrin）,是目前已知所有乳铁蛋白肽中活性最高的。前期研究表明,可以通过大肠杆菌表达体系和毕赤酵母表达体系表达有活性的LfcinB,但得到的产物难以纯化,产量也不理想,所以研究构建新型的LfcinB表达体系有很重要的意义。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）能在芽胞形成的同时产生一种δ-内毒素组装成的杀虫晶体,在发酵完成后细胞裂解,将芽胞和晶体释放到培养基中。基于Bt的这种优势,将LfcinB与分子量为35kDa的Cry60Ba晶体蛋白作融合表达。通过PCR扩增和酶切连接,将LfcinB基因连接到 cry60Ba 的下游,构建融合基因并转入无晶体Bt菌株中表达,得到了工程菌4Q7/pPFT60Ba-LfcinB。利用GYS培养发酵48h,再经过超声破碎、包涵体纯化,SDS-PAGE分析表明,工程菌表达了一条38kDa左右的蛋白质条带。将纯化的融合蛋白盐酸水解后进行SDS-PAGE分析,得到近似于3kDa的蛋白质条带,挖取目的条带进行胶内酶解和质谱分析,质谱结果显示,挖取的目的条带样品为LfcinB蛋白的特异性肽段,说明在酸水解过后,融合蛋白Cry60Ba-LfcinB中的Cry60Ba和LfcinB分离开,得到单独的LfcinB蛋白。由此可见,利用晶体蛋白在苏云金芽胞杆菌中进行融合表达可能作为一种新型有效的LfcinB的高效表达体系,为采用基因工程的方法大量生产具有活性的牛乳铁蛋白肽LfcinB蛋白奠定基础。     

基因工程的现状与未来(续)

借助基因工程制造药物 谈起基因工程在实际生产中的应用时,话题是药物生产,而人干扰素、人生长激素和胰岛素更是它们的三大支柱。此外还有关于β内啡肽和生长激素释放抑制因子(这两种物质有调节脑神经的作用)、肠促胰液肽和胸腺素d_1(调节免疫反应)等药物生产的报道。     

杂合抗菌肽牛乳铁蛋白素-天蚕素在大肠杆菌中的高效表达及其活性鉴定

【目的】菌株耐药性问题日益突出,研制新型安全高效的抗菌药物成为目前的研究热点之一。抗菌肽具有多种优良特性,高活性抗菌肽的开发及其重组表达对解决菌株耐药性问题具有重要意义。【方法】根据牛乳铁蛋白素与天蚕素的结构,设计一种新型的杂合抗菌肽牛乳铁蛋白素-天蚕素(LfcinB-Cecropin),根据Escherichia coli密码子偏爱性合成其编码基因,利用同尾酶法构建含有不同LfcinB-Cecropin基因片段拷贝数的重组表达载体,转化到E.coli BL21(DE3)进行重组表达。【结果】经IPTG诱导,LfcinB-Cecropin融合蛋白成功获得表达。经超声破碎、包涵体纯化、甲酸裂解后,获得具有明显抑菌活性的杂合肽LfcinB-Cecropin。【结论】获得一种高活性的新型抗菌肽LfcinB-Cecropin,并实现了在E.coli中的高效重组表达。     

重组枯草芽孢杆菌发酵生产乳铁蛋白N叶工艺优化北大核心CSCD

为实现乳铁蛋白N叶的大规模制备,本研究对表达乳铁蛋白N叶的工程菌枯草芽孢杆菌pMA0911-D60Y/Y92D进行了发酵工艺的优化。确定了最佳的培养条件:以葡萄糖为最佳碳源,以胰蛋白胨为最佳氮源,在pH 7.0、温度28℃、发酵25.5 h条件下诱导表达目的蛋白,目的蛋白的IOD值高达68.03%。在10L发酵罐上对重组菌株的发酵条件进行优化,获得如下的最佳发酵工艺,即采用300 r/min转速,0-7 h时,在pH 7.5、30℃条件下培养菌体;7-25 h时,在pH 7.0、28℃条件下诱导表达目的蛋白。发酵结束后,收集细胞并破碎后取上清液用HisTrapHP亲和层析及SuperdexTM200(10/300GL)亲和层析法对细胞上清液进行纯化至均一条带,获得了纯度>94%的重组乳铁蛋白N叶,1 L菌体能制备23.5 mg纯蛋白。本研究为重组牛乳铁蛋白N-叶的高效制备奠定了基础。     

基因工程抗体的原核高效表达

基因工程抗体具有生产简单、价格低廉和容易获得稀有抗体等优点而日益受到广泛关注,是当前制备治疗性抗体的主要手段。抗体表达量低依然是制约其大规模生产和应用的主要因素,通过对表达载体、宿主细胞和表达条件等进行改造与优化,将有可能获得基因工程抗体的高效表达。     

降血压肽基因工程菌的构建及高效表达策略

降血压肽具有很好的降血压效果而且天然无毒副作用,是目前基因工程研究的热点之一。本文阐述了降血压肽基因工程菌构建的重要性,综述了国内外关于降血压肽及各种小肽表达方面的研究进展。探讨了降血压肽基因工程菌在构建过程中目的片段的选择、串联连接的方式、串联体的获得及表达载体的选择等方面采用的策略和依据,重点介绍了各种不同表达类型载体的优缺点。旨在能对今后做降血压基因工程菌的多肽表达提供参考,以方便实验设计。     

猪支原体肺炎基因工程疫苗的研究进展

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia,Mhp)引起的一种慢性呼吸道传染病,该病给养猪业造成了巨大的经济损失。疫苗接种是目前减轻或预防由猪肺炎支原体感染引发经济损失的主要手段。对猪支原体肺炎基因工程疫苗近年来的研究进展进行综述,主要包括黏附因子相关疫苗、核苷酸还原酶相关疫苗、DNA疫苗、表达文库疫苗和肽疫苗等,最后对基因工程疫苗研究工作的继续开展提供了建议。     

抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

利用巴斯德毕赤酵母系统表达抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽简称LfcinBD,获得的表达产物具有较强的抗菌活性.将人工设计的用化学合成法合成的以酵母偏爱密码子编码的LfcinBD基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinBD通过限制性内切酶Sac Ⅰ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母GS115宿主菌,G418抗性筛选,得到高拷贝转化子.经PCR检测,LfcinBD基因与毕赤酵母染色体稳定整合.阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinBD,诱导表达5 d,每24 h取上清1 mL,进行抑菌试验.结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽衍生肽基因已整合到酵母细胞基因组中并获得表达,经0.5%甲醇在30℃诱导48 h可产生较强抗菌活性的抗菌肽,而且对氨苄青霉素抗性的大肠杆菌亦有较强的抑菌作用.     

乳铁蛋白的多功能生物活性与临床进展

目前,为应对抗生素耐药性问题,需要探索更多的抗生素替代物用于对抗微生物的感染。乳铁蛋白是一类源自哺乳动物乳汁或其他粘膜分泌的一种糖基化蛋白,具有广谱抗微生物活性、免疫调节以及抗癌作用。乳铁蛋白对于易受感染的早产儿也有很好的耐受作用,基本无不良反应,具有良好的开发前景。本文主要概述乳铁蛋白的基本性质、多功能的生物学活性和作用机制,并探讨牛乳铁蛋白与talactoferrin的临床研究情况。     

牛乳铁蛋白素抗菌活性及抗菌活性位点

牛乳铁蛋白素(Bovine Lactoferrcin, LfcinB)是乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶作用N端释放的一段多肽, 它具有多种生物学功能。研究LfcinB广谱抗菌性及改变LfcinB氨基酸序列对其抗菌能力的影响, 寻找LfcinB抗菌作用的结构位点。人工合成LfcinB, 采用琼脂扩散法测定LfcinB抗菌图谱。人工合成丙氨酸取代3位半胱氨酸的LfcinB、丙氨酸取代8位色氨酸的LfcinB和去掉2个半胱氨酸的LfcinB样品, 测定最小抑菌浓度, 确定LfcinB抗菌活性位点。研究结果表明:     

抗癌肽研究进展

随着全球癌症患病比例的逐年增加,癌症已经成为全球死亡的主要原因和重大的公共卫生问题。抗癌肽能破坏肿瘤细胞膜结构或抑制癌细胞增殖和迁移以及肿瘤血管的形成,几乎不表现溶血性且对正常的人体细胞基本无损伤等优点,已经成为抗肿瘤新药研究的一大热点。抗癌肽主要来源可分为4类:抗菌肽类如牛乳铁蛋白肽(Lfcin B)、天蚕素等,对细菌等微生物具有广谱高效的抑制活性,同时能够抑制多种癌细胞的增殖和生长,诱导癌细胞凋亡;多肽激素类如心房利钠肽(ANP)以及在ANP形成过程中的其他一些多肽,在临床上具有增加血管通透性、降压、利钠、利尿、舒张血管平滑肌、调节水盐平衡和抑制细胞增殖等作用,最近研究发现它们可以直接杀死肿瘤细胞或强力抑制癌细胞DNA的合成,从而抑制癌细胞的生长;多肽毒素类如蜂毒、蛇毒、蝎毒等毒性较强的生物毒素,对多种肿瘤均有抑制作用;内皮抑制素可以抑制肿瘤血管的生成抑制癌细胞的生长和转移。抗癌肽主要通过诱导细胞凋亡、破坏细胞的膜结构,改变细胞周围或细胞内p H以及增强免疫应答等多种机制来抑制癌细胞增殖。综述抗癌肽的来源、抑癌机理,并对抗癌肽的应用前景进行分析,旨为抗癌肽的深入研究和开发应用提供参考。     

乳铁蛋白肽(Lactoferricin)作用机制研究进展

近年来抗菌肽由于自身的优点成为抗生素的替代品 ,并已成为研究与开发的热点 ,其中乳铁蛋白肽因其强大的生物学功能而备受关注。就其结构、功能进行了综述 ,并根据其结构和生物学活性的关系探讨该肽的作用机制 ,同时也提出了乳铁蛋白肽研究中存在的一些问题及相应对策。     

人组织激肽释放酶基因在哺乳动物细胞中的表达

克隆人胰腺组织激肽释放酶基因 (hKK) ,构建融合荧光蛋白基因的真核表达载体 ,在CHO细胞中表达 ,为开发激肽释放酶基因工程产品以及开展基因治疗高血压研究奠定了基础。提取人胰腺组织总RNA后 ,RT PCR扩增KK ,构建中间载体KSKK。从KSKK中切出激肽释放酶基因 ,插入真核表达载体pEGFP C2 ,构建出激肽释放酶带有荧光蛋白报告基因的表达载体pEGC KK ,测序分析后转染CHO细胞 ,荧光显微镜观察激肽释放酶基因表达。并进行SDS PAGE及Westernblot分析。成功克隆激肽释放酶基因 ,并在CHO细胞获得表达 ,克隆的人组织激肽释放酶基因可用于激肽释放酶基因工程产品开发以及基因治疗研究。     

新的重组蛋白表达系统——植物根分泌和叶分泌

多种基因工程抗体、酶、激素、血浆蛋白和疫苗等都已在植物的叶、茎、根、果实、种子以及植物细胞和器官中得到表达 ,然而提取和纯化始终是大规模利用植物生产重组蛋白的主要障碍 .Ｂｏｒｉｓｊｕｋ和Ｋｏｍａｍｙｔｓｋｙ等 (1999年和 2 0 0 0年 )依据内质网和内质网信号肽在蛋白质合成中的作用 ,把 3种重组蛋白 ,嗜热细菌来源的木聚糖酶、水母的绿色荧光蛋白和人胎盘分泌的碱性磷酸酶 (ＳＥＡＰ) ,定位到质外体中 ,通过植物根分泌和叶分泌途径获得表达 ,从而建立了 2种新的重组蛋白表达系统———植物根分泌和叶分泌 ,简化了分离和纯化程…