重组人白细胞介素—2制备工艺的研究

本文对大肠杆菌表达的重组人白细胞介素-2进行了制备工艺的研究。用4mol／L脲溶解可溶性细菌蛋白后可使rIL—2包涵体纯度达70％;在变性条件下进行凝胶过滤并收集rlL－2主峰纯度可达90％;利用Cu2 氧化复性;最后用反相HPLC纯化,得到高度均一,纯度高达98％,比活达到8．0×106U／mg蛋白,且无热源,无残留DNA的rIL—2;每次反相色谱分离过程可获得400mg左右的rIL－2,得率约25％。     

重度子痫前期患者外周血NK 细胞功能的研究*

目的:探讨重度子痫前期患者外周血中NK细胞数量、杀伤功能以及相关细胞因子的变化。方法:选择重度子痫前期患者25例(研究组)以及正常妊娠妇女25例(对照组),流式细胞术测定外周血中NK细胞数量,细胞毒实验测定NK细胞的杀伤活性,ELISA法测定血清IFN-γ及IL-2的浓度。结果:研究组患者外周血中NK细胞的数量以及杀伤活性显著高于对照组;研究组外周血中IFN-γ、IL-2的浓度也显著高于对照组。结论:重度子痫前期患者外周血NK细胞数量增多,杀伤活性增强,血清中NK细胞相关细胞因子也增加。这些改变可能参与重度子痫前期的发病机制。     

草鱼、中华鳖脾细胞培养上清液ＩＬ—２物质的检测

用刀豆蛋白Ａ（ConA)刺激诱导草鱼和中华鳖脾细胞,收细胞培养上清液,用小鼠胸腺细胞增殖试验和对小鼠Ｌ９２９细胞系杀伤试验检测上清液中白细胞介素－２（简称ＩＬ－２）活性。结果表明：草鱼、中华鳖脾细胞培养上清液中有ＩＬ－２样活性物质,这种物质使小鼠的胸腺细胞^3H-TdR掺入量明显增加,在相同效靶比的条件下对小鼠Ｌ９２９细胞系杀伤率也显著增强,这种ＩＬ－２活性均能被抗人rIL-2血清所抑制。中华鳖脾细胞培养上清液（含ＩＬ－２）对中华鳖胸腺细胞也有较明显的促增殖作用并能消除兔抗中华鳖胸腺细胞血清（ＲＡＴＴＳ）对中华鳖胸腺细胞增殖的抑制作用,进一步用抗人白细胞分化抗原ＣＤ２５（ＩＬ－２受体,简称ＩＬ－２Ｒ）单克隆抗体进行免疫组化交叉反应提示草鱼、中华鳖淋巴细胞膜上含有与人类ＩＬ－２Ｒ类似功能和结构的物质。     

生物肽SP对NK细胞NKG2D/NKG2A受体表达的影响

选择NK92-MI细胞为研究体系,研究SP对NK细胞的杀伤活性及功能性受体NKG2D/NKG2A表达的影响,以探讨SP对NK细胞功能的调节作用机制。采用MTT法测定NK92-MI细胞对K562细胞的杀伤活性;采用Real-Time PCR和流式细胞术检测NK92-MI细胞活化性受体NKG2D和抑制性受体NKG2A的基因表达和膜表达。10-14～10-8 mol/L的SP在体外可明显增强NK92-MI细胞的杀伤活性。该浓度范围的SP均可上调NKG2D/NKG2A的mRNA水平;10-14～10-8 mol/L的SP均上调NKG2D/NKG2A的膜表达,较低浓度（10-14 mol/L）的SP仅使NKG2D表达上调,而NKG2A表达无明显变化;SP刺激NKG2D膜表达增加的程度高于NKG2A。生物肽SP调节NK细胞功能性受体NKG2D/NKG2A的表达,可能是SP增强NK细胞杀伤活性的一种原因。     

rIL-2工程菌诱导阶段细胞再循环培养的研究

为了减少rIL-2工程菌高密度培养时乙酸的积累,在诱导阶段对该工程菌进行细胞再循环培养的研究,比较了细胞再循环补料液、pH、细胞循环培养时间段对工程菌的生长及rIL-2表达的影响。结果表明在菌密度D_(600)为50时,细胞再循环补料液中酵母抽提物与胰蛋白胨浓度为发酵培养基的5倍就能满足rIL-2表达的需求,同时选择诱导后4～6h之间的细胞再循环培养能有效地防止乙酸的过高积累并减少营养物质的损失,有利于rIL-2的表达。根据以上研究结果得到了rIL-2工程菌诱导阶段细胞再循环培养方法,使得在诱导前菌密度D_(600)为50左右时rIL-2的表达水平约为40％。     

肿瘤相关巨噬细胞与肺癌复发无相关性

宿主抵抗恶性肿瘤的功能主要是通过体内具有杀伤活性的细胞及其分泌的递质来完成的,例如,杀伤性T淋巴细胞、活性巨噬细胞(Mφ)、天然杀伤细胞(NK细胞)及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。验中活性 Mφ特别引人关注,它不仅可直接杀伤肿瘤细胞,还可抑制肿瘤细胞的 DNA 合成。尽管许多实其     

双歧杆菌、大肠杆菌菌体多糖对iIEL激活作用的对比研究

采用Percoll非连续密度梯度离心法从小鼠小肠提取小肠上皮间淋巴细胞（intestinalintraeptheliallymphocyte,iIEL）,应用双抗原标记间接免疫荧光法对其抗原表型进行测定;同时,应用有机溶剂提取的双歧杆菌、大肠杆菌菌体多糖与iIEL细胞共同孵育作用后,检测iIEL细胞的自然杀伤活性、IFNγ和IL－2产生能力。结果表明：iIEL细胞的表型为85．1％CD3 73.8％CD8 细胞,且有TCRγδ表达。双歧杆菌、大肠杆菌菌体多糖均能增加iIEL细胞的自然杀伤活性,并能促进iIEL细胞产生IFNγ和IL－2但双歧杆菌菌体多糖的作用强。     

5-氟尿嘧啶增强HeLa细胞对自然杀伤细胞敏感性研究

目的用5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）处理HeLa细胞,检测其NKG2D配体MICA的表达及其对NK92细胞杀伤敏感性的变化。方法不同浓度的5-Fu处理HeLa细胞,在不同时间点用半定量PCR及流式细胞术检测HeLa细胞表面的NKG2D配体MICA在RNA及蛋白水平的表达变化情况,用MTT法检测NKG2D抗体封闭NK92细胞的NKG2D受体前后,NK92细胞对HeLa细胞的杀伤作用。结果不同浓度的5．Fu作用于HeLa细胞后,半定量RT—PCR结果显示MICA表达随5-Fu作用浓度增加逐渐增高。而且40μg／ml5．Fu作用于HeLa细胞后随着作用时间的延长（0、8、16、24h）MICA表达增加,流式细胞术检测结果表明,MICA表达的增加主要依赖于未凋亡细胞的MICA表达。在40μg／ml5-FU作用24h,效靶比为2．5：1,5：1,10：1,20：1时都检测到NK92细胞对HeLa细胞的杀伤增强,杀伤作用可部分被NKG2D抗体抑制。结论5-FU能够上调HeLa细胞表面NKG2D配体MICA的表达,增强HeLa细胞对NK92细胞的敏感性,提示化疗联合NK细胞免疫治疗宫颈癌可产生协同作用,提高治疗效果。     

人NK细胞对同种和异种内皮细胞MHCⅠ类分子的差异识别

以HUVEC和PAEC为靶细胞,人PBNK和NK92为效应细胞,研究了人NK细胞对同种和异种内皮细胞杀伤的差异性;并通过酸处理内皮细胞及抗体封闭MHCⅠ类分子、CD94和KIR(NKB1),研究了MHCⅠ类分子对人NK细胞杀伤HUVEC和PAEC的影响. 结果表明,PBNK和NK92对PAEC的杀伤均大于对HUVEC的杀伤. 酸处理后,两种NK细胞对HUVEC杀伤的增加幅度大于对PAEC的;此外,抗CD94单抗未能改变NK的杀伤效应;KIR(NKB1)封闭使PBNK杀伤HUVEC增加95%,杀伤PAEC仅增加29%. 以上结果提示:NK细胞对异种内皮细胞MHCⅠ类分子的差异识别作用可能是NK细胞杀伤PAEC的主要原因,而KIR很可能是NK杀伤内皮细胞时主要的传递抑制信号的受体.     

嗜酸性乳杆菌细胞壁提取成分对小鼠小肠上皮内淋巴细胞免疫功能的影响

采用机械分离法和Ｐｅｒｃｏｌ非连续密度梯度离心法从鼠小肠提取小肠上皮间淋巴细胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｎｔｒａ－ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ,ｉＩＥＬ）,应用间接免疫荧光染色法进行表面抗原表型测定;同时,应用嗜酸性乳杆菌细胞壁提取物与ｉＩＥＬ细胞共同孵育作用后,检测ｉＩＥＬ细胞的自然杀伤活性和ＩＬ—２产生情况。结果表明：ｉＩＥＬ细胞膜表面抗原的表型７３８％以上为ＣＤ８＋Ｔ细胞,且有４３８％表达ＴＣＲγδ。酸性嗜乳杆菌细胞壁提取物能增加ｉＩＥＬ细胞的自然杀伤活性,并能促进ｉＩＥＬ细胞产生ＩＬ—２。     

LAK细胞实验室及临床研究的进展

LAK细胞又称淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphokine activated killer Cell)是近年来在生物工程迅速发展的基础上产生的一门高新技术,广泛引起免疫学家和临床学家的极大兴趣。近年来基因重组白细胞介素-2(rIL-2)的深入研究和国产化的成功,更推动着这一新技术的实验室和临床研究在国内的蓬勃发展,取得了可喜的成绩。本文仅就国内外有关这方面的进展结合我们的工作加以概述。     

失重条件对小鼠NK细胞体外生物活性的影响

建立在失重环境下NK细胞的培养体系,探讨失重培养条件对NK细胞活性的影响。取C57BL/6小鼠脾,分离NK细胞,在正常重力和失重状态下旋转细胞两种培养体系中培养NK细胞48 h。以Yac-1细胞为靶细胞,采用MTT法检测其杀伤活性;半定量PCR分析穿孔素、颗粒酶的转录水平。与正常重力培养对照相比,失重培养的NK细胞杀伤活性显著降低,其穿孔素和颗粒酶B的转录水平均显著低于正常重力培养组,穿孔素/GAPDH结果为失重培养组0.625±0.042;正常重力培养组1.054±0.036(P<0.01);得到颗粒酶B/GAPDH结果为失重培养组0.700±0.042;正常重力培养组1.068±0.058(P<0.01)。成功建立了NK细胞体外培养体系,在失重环境下NK细胞杀伤活性降低。     

重组人白细胞介素2复性条件的研究

由E.coli表达的重组白细胞介素2(rIL—2)以包涵体形式存在于工程菌胞浆中。用变性剂将包涵体溶解后得到的还原态rIL—2没有生物活性,必须对其进行复性才能最终得到有用的产品。本实验研究了以盐酸胍(GUHCl)为变性剂条件下,变性剂浓度、复性剂、pH值以及温度和时间等对rIL—2复性的影响。     

紫杉醇对NK-92MI细胞杀伤功能及凋亡的影响

探讨紫杉醇对人自然杀伤细胞系NK-92MI细胞株杀伤活性及凋亡的影响。用不同浓度的紫杉醇处理NK.92MI细胞后,测定NK-92MI细胞的增殖率和对靶细胞的杀伤作用;同时检测NK·92MI细胞凋亡率及凋亡相关基因Bcl-2、Ba】【的表达。结果表明,紫杉醇可以抑制NK-92MI细胞增殖并且降低其杀伤活性,机制可能是通过诱导NK.92MI细胞的凋亡,而后者与Bcll2/Ba】【基因表达增高有关。     

Ser^125突变型重组人白介素2的纯化研究

对E．Coli表达的Ser125突变型白细胞介素2的纯化方式进行了研究。依次经包含体提取、SephacrylS200凝胶柱层析、复性、RP－HPLC、SephacrylS100凝胶柱层析,实验最终获得电泳纯度为一条带的、比活约为2.0×107IU／mg的rIL－2。结果表明采用建立的提地方法可稳定地获得较高纯度及比活性的突变型rIL－2。     

Ca~(2+)参与调节cortisol对人类天然杀伤细胞活性的抑制作用

天然杀伤细胞(NK细胞)是一个Fc受体阳性、无吸附性及吞噬性的亚群,存在于人外周血单核细胞(PBM细胞)群的大颗粒淋巴细胞部分。它们能缓慢溶解某些肿瘤细胞及被病毒感染的靶细胞,在控制肿瘤的发展和转移以及对抗病毒入侵等方面都有作用。     

CD1d/NKT在抗HBV和HCV中的作用

CD1d是人类白细胞表面的抗原分子,它可以将脂质抗原递呈给天然杀伤T细胞（NKT）,使其激活.而NKT是近年来发现的一类特殊的T细胞,它既可以表达T细胞表面标志,又可以表达天然杀伤细胞（NK）表面标志,能识别由CD1d递呈的抗原,广泛参与自身免疫调节.近年来,许多研究发现,CD1d/NKT可以有效抑制肝炎病毒的复制.     

活化自然杀伤细胞对间充质干细胞杀伤作用研究

研究NK(natural killer)细胞对人脐血来源的MSCs(mesenehymal stem cells)是否有杀伤作用.重组IL-2激活的NK细胞与脐血来源的MSCs按一定比例共孵育,流式细胞仪收集靶细胞并测定被杀伤细胞的百分率.结果显示NK细胞对脐血来源的MSCs有杀伤作用.     

乙酰胆碱对自然杀伤细胞活性的影响

目的:观察乙酰胆碱(ACh)对自然杀伤(NK)细胞活性的影响,并初步探讨其作用的受体机制.方法:根据不同的实验目的,选择ACh、胆碱能受体激动剂和拮抗剂分别作用于NK细胞,以乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)自然释放法检测不同实验条件下NK细胞杀伤肿瘤靶细胞(Yac)的活性.结果:ACh、M受体激动剂毛果芸香碱和N受体激动剂烟碱在10-10～10-6mol/L浓度范围内都能显著抑制NK细胞杀伤肿瘤细胞的活性.M受体拮抗剂阿托品(10-8和10-7mol/L)能完全阻断同浓度ACh抑制NK细胞活性的作用;但N受体拮抗剂筒箭毒碱(10-8和10-7mol/L)不能阻断同浓度ACh抑制NK细胞活性的作用.结论:ACh可抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,此作用主要由淋巴细胞上的M受体和N1受体介导.     

IL—6诱导肝癌细胞BEL—7402细胞凋亡及其Ca^2＋转导机制

白细胞介素－6（interleukin-6,IL-6）具有直接或间接的抗肿瘤活性,本组在以前的体内外实验中证明其具有明显的抑制肝癌作用。本文主要报告应用流式细胞仪和共聚焦显微镜检测IL－6对肝癌细胞（BEL－7402）凋亡的作用和该过程中Ca^2 转导机制。生长曲线描绘以及MTT分析结果表明,IL－6（6000u/ml）作用于BEL－7402细胞24小时后,生长抑制率达12％左右,而流式细胞仪结果显示IL－60（6000u/ml）作用于BEL－7402细胞24小时后,BEL－7402细胞凋亡率达8.2％。流式细胞仪分析还表明,IL－60（6000u/ml）作用于BEL－7402细胞24小时后,对照组平均FTTC荧光值为1.03而IL－60（6000u/ml）组为0.759,也就是说,IL－6引起了bcl－2基因表达下降。激光共聚焦显微镜测定表明,IL－60（6000u/ml）作用于BEL－7402细胞后,胞浆[Ca^2 ]c升高达2倍。若事先加入TC（thapsigargin),15min后再加入IL－6,则抑制了胞浆内[Ca^2 ]c升高;事先10min或5min分别加入EGTA和普鲁卡因（procaine）也有同样的抑制作用。上述结果表明,IL－6在一定剂量下可以诱导肝癌细胞BEL－7402发生细胞凋亡,该凋亡过程可能与Ca^2 转导及bcl-2基因表达下调有关。