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RNA依赖的RNA聚合酶是EV-A71病毒进行药物设计的药物靶点蛋白之一,本研究通过已知小核糖核酸病毒科聚合酶同源结构的序列比对,设计了三个针对EV-A71 3D聚合酶,有助于提高核苷酸类似物药物结合效率的突变体,以实验室原有野生型EV-A71 3D聚合酶质粒为模板,通过PCR扩增、野生型质粒的消化分解及转化的方式,构建突变体质粒的阳性克隆,并转化入大肠杆菌3016感受态细胞,通过低温过夜诱导,超声破碎富集的菌泥,将上清经过Ni柱亲和纯化、High trap Q离子交换层析纯化及Superdex 200 10/300凝胶过滤层析三个步骤的梯度纯化,获得了高纯度高产量的EV-A71 3D聚合酶突变体重组蛋白,并通过荧光定量的方法,采用荧光定量PCR仪对最终获得的稳定表达突变体重组蛋白,进行不同溶液条件的荧光热稳定性分析,得到了该重组蛋白最佳的蛋白溶解条件。为深入研究设计以EV-A71 3D作为药物靶点进行核苷酸类似物药物设计提供了技术基础。 相似文献
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研究SP对NK92-MI细胞杀伤活性以及活化性受体NCRs(NKp46、NKp44和NKp30分子)的表达的影响,揭示SP对NK细胞杀伤功能的调节作用及其内在作用机制.MTT法测定NK92-MI细胞对K562细胞的杀伤活性;Real-Time PCR检测NCRs的mRNA表达;流式细胞术检测NCRs的膜表达.在10-14~10-8 mol/L浓度范围的SP作用24h,对NK92-MI细胞的杀伤活性有明显增强作用;10-14~10-8 mol/L的SP,均可增加NK92-MI细胞活化性受体NKp44、NKp46及NKp30的mRNA表达;该浓度范围的SP均可增加NKp46的膜表达水平,仅较低浓度( 10-14moL/L)的SP对NKp44的膜表达水平有增加作用,各浓度的SP对NKp30的膜表达水平均无明显影响.SP可通过上调活化性受体NCRs的表达水平来调节NK细胞的活性. 相似文献
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