蓄势待发的印度生物技术产业

构建的重组表达质粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b经限制性内切酶SalI酶切线性化后电转化巴斯德毕赤酵母菌（P.Pastoris）SMD1168,将阳性转化子用甲醇诱导表达并进行PCR鉴定和Mut表型鉴定,再用Western-Blot法及Wish细胞-VSV病毒系统来鉴定表达蛋白的免疫原性及生物活性,同时,在摇瓶培养条件下,初步研究了甲醇诱导浓度及菌体诱导的起始OD值两因素对目的蛋白表达量的影响,本研究成功表达出具有高生物学活性的白蛋白融合干扰素蛋白（HSA-IFNα-2b）,对摇瓶发酵表达条件的初步摸索也为进一步在大规模发酵中提高目的蛋白在P.Pastoris的表达水平提供一个参考依据。     

不同接头的白蛋白干扰素在毕赤酵母中表达的研究

毕赤酵母作为比较成熟的真核表达系统[1],它具有许多优点,表达产物直接分泌到胞外,这有利于产物的分离纯化.白蛋白干扰素在毕赤酵母中表达的研究也具有很重要的意义.研究白蛋白与干扰素之间的接头蛋白不同对表达量的影响.通过重叠PCR构建不同接头的白蛋白干扰素重组子,然后分别用salⅠ酶切线性化,通过电转仪转入毕赤酵母SMD1168,在MD板上进行培养,分别挑取10个克隆进行甲醇诱导表达,筛选出表达量最高的一个.最后在相同的条件下,分别将表达量高的进行诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE鉴定,由于表达产物中有杂蛋白,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定融合白蛋白干扰素的表达量,由已知浓度的白蛋白干扰素标准曲线,可以计算出不同接头的白蛋白干扰素的表达量,这对工业化生产具有指导意义.     

干扰素α-2bHis89/His159的分子获得及性能分析

目的：通过结构分析和定点突变,构建干扰素α-2bHis89/His159(IFNα-2bHis89/His159),以期获得高性能干扰素突变体。方法：采用PCR体外定点突变技术,使干扰素α-2b基因的第89位密码子由编码酪氨酸的TAC突变为编码组氨酸的CAC,第159位密码子由编码谷氨酸的GAA突变为编码组氨酸的CAC。将扩增片段克隆入pET23b表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。表达的IFNα-2bHis89/His159经包涵体变性、复性、DEAE层析和CM层析纯化后,用WISH-VSV系统进行生物活性测定。以SD大鼠进行初步药代动力学研究。结果：IFNα-2bHis89/His159主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上。纯化后,IFNα-2bHis89/His159的纯度大于95%,比活性大于2.8×108IU/mg。相对于IFNα-2b较短的消除半衰期,IFNα-2bHis89/His159的消除半衰期得到延长,为2.34±0.27h。结论：构建了IFNα-2bHis89/His159的重组表达载体,并成功地在大肠杆菌中实现了高效表达,建立了IFNα-2bHis89/His159的纯化工艺,获得了体外活性增高并且体内稳定性得到改善的新型干扰素α-2b突变体。     

人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在CHO细胞中的表达

干扰素α2b(interferonα2b,IFNα2b)是一种用于病毒性疾病和肿瘤性疾病治疗的多功能细胞因子,因其在体内的半衰期短限制了其在临床上的应用。将IFNα2b连接到人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,构建融合蛋白HSA-IFNα2b。构建含融合蛋白的真核表达质粒p MH3/HSA-IFNa2b,经电转的方法转入中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中。经G418抗性压力筛选和目的蛋白的表达量筛选,最终获得一株高表达的稳定细胞株(CHO/p MH3/HSA-IFNa2b)。表达的目的蛋白经Western blot验证显示,产物具有IFNα2b和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高克隆表达株,产量约为65mg/L,进一步选取高表达克隆株在悬浮驯化中不同代数进行批次培养,不同代数之间蛋白质的表达量和生长情况没有明显的差异,获得一株稳定遗传表达的单克隆细胞株,3L摇瓶的流加培养结果显示,最佳发酵时间为15天,蛋白质表达量为121mg/L。经离心获得的发酵液,经两步纯化后获得蛋白质纯度高达96.8%的目的蛋白,总回收率为22.3%。参照《中国药典》2015版对IFNα2b的检测方法,结果显示,CHO表达的HSA-IFNα2b比活性为4.16×106IU/mg。首次将HSA-IFNα2b在哺乳动物细胞CHO中构建表达,表达获得高活性的HSA-IFNα2b融合蛋白。     

酵母菌表达倍菲隆发酵工艺研究

目的 :为了探索用酵母菌表达乙型干扰素 (倍菲隆 )的大批生产的发酵工艺流程及优化的重要参数。选用 1 5L不锈钢发酵罐作为乙型干扰素发酵工艺研究系统。方法 :探索了种细胞密度对初始发酵期 (甘油利用期 )的影响 ,启动甘油补充期的溶解氧浓度 ,诱导目的蛋白表达时添加甲醇的速率条件控制 ,pH对酵母菌生长与蛋白表达的影响以及发酵时间对乙型干扰素表达量影响等重要发酵工艺参数。结果 :接种高密度的种菌 (OD60 0为 9)时酵母菌增殖快 ,湿细胞重量于1 8h即达到 1 5 7g L。当DO恢复至 67%时即开始补充甘油可使酵母菌在 5h内增殖达到 2 1 9g L。添加甲醇速率从 2 %(甲醇终浓度为 0 0 3%)开始 ,逐步增加 ,在 2 4h内达到 33%的添加速率 (甲醇终浓度为 0 5 %)。甲醇诱导前pH为 6时最有利于酵母菌生长 ,在蛋白表达时期 ,控制发酵罐内pH值在 3 0 ,可得最高蛋白表达量。发酵 70h乙型干扰素表达量达到高峰。结论 :接种高密度种菌可促进工程菌生长 ,当DO恢复至 67%时开始补充甘油可加快酵母菌生长 ,在诱导期中缓慢添加甲醇并维持发酵罐pH为 3 0 ,发酵 70h可获得最佳蛋白生产量。     

奶牛α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

提取经新城疫病毒诱导培养的奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛α干扰素成熟蛋白基因,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,测序结果表明,扩增片段为牛α干扰素成熟蛋白序列,与Genebank上发表的α1干扰素序列同源性为98%。然后将特异性片段连接到含分泌信号肽序列的Pichiapastoris表达载体pPICZαA上,将重组质粒经SacI酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了BoIFN-α在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为23kDa,比其推导结果(20kDa)略大,推测可能是因为表达产物发生了一定程度的糖基化。细胞病变抑制法结果表明,重组牛IFN-α具有较高的干扰素活性,约为4.1×10⁵U/ml,经微量蛋白测量仪测得,其表达量约为80μg/ml,比活为5.1×10⁶U/mg。     

人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人血清白蛋白(HSA)-C肽(CP)融合蛋白的毕赤酵母表达菌株.方法根据表达系统的密码子偏好性优化CP基因,酶切连接pBlue-HSA质粒(HSA1 800bp)和CP(100bp)基因,将HSA-CP融合基因双酶切后插入分泌表达栽体pPIC9K中,重组质粒pPIC9K-HSA-CP经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut 转化子.PCR鉴定后,用甲醇诱导摇瓶分泌表达.结果融合基因约为1 900bp,序列测定正确.SDS-PAGE分析表明表达融合蛋白的相对分子量约为70kD,摇瓶培养表达量为140mg/L,Western blot鉴定显示表达的融合蛋白为HSA和CP的杂合分子.结论实现了HSA-CP融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,细胞活性研究显示HSA-CP融合蛋白对人胚肾293细胞的生长具有一定的促进作用.     

重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在PichiaPink系统中的表达

目的:比较PichiaPink表达系统和巴斯德毕赤酵母GS115在表达外源蛋白方面的差异,对PichiaPink表达系统的潜在优点进行评价。方法:以重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(HSA-IFN-α2b)为报告蛋白,构建相关载体,分别转化PichiaPink系统菌株和巴斯德毕赤酵母GS115菌株,诱导HSA-IFN-α2b表达并测定表达水平;通过SDS-PAGE检测HSA-IFN-α2b在PichiaPink系统中的降解程度。结果:PichiaPink系统几乎所有的转化子都可以表达HSA-IFN-α2b,而GS115菌株只有60%的转化子能表达HSA-IFN-α2b;同一种Pink菌株中,整合有高拷贝数表达载体pPink-HC的菌株表达量高于整合有低拷贝数表达载体pPink-LC的菌株;Pink蛋白酶缺陷菌株在复杂培养基(YPD,BMMY)中HSA-IFN-α2b基本没有降解,而在合成培养基(BSM)中降解现象明显。结论:PichiaPink表达系统产生的转化子较GS115菌株产生的转化子易于筛选;PichiaPink系统蛋白酶缺陷菌株可明显减少外源蛋白降解。这些结果为利用PichiaPink表达系统高水平和大规模制备外源蛋白提供了实验依据。     

中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定

构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复制的RNA聚合酶原核表达载体pET30aNS5b,并在大肠杆菌中获得NS5B聚合酶蛋白的高效表达,为建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型的方法创造条件.使用高保真Pfu DNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性血清中扩增出HCV NS5b RNA多聚酶全基因序列,经BamHI 和SalI酶切,将其克隆至同样酶切的 pET-30a载体中;转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达.用抗 HCV NS5b单克隆抗体做Western-Blot进行鉴定.结果表明构建了原核表达载体,pET30aNS5bpET30aNS5b明显表达出12-His-NS5b聚合酶蛋白.测序结果表明,与已发表的相关HCV NS5b RNA聚合酶序列比较,其核苷酸和氨基酸的同源性分别在69%～92.7%及88.8%～96.8%之间.在最佳表达条件下,可高效诱导表达融合蛋白(65kDa),最高表达量占菌体蛋白18.9%.Western-Blot结果显示表达蛋白为HCV NS5b酶.HCV聚合酶蛋白全长基因可以成功地克隆在pET-30a载体上并有效表达出目的蛋白,为研究建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型奠定了基础.     

胸腺素a1与复合a干扰素融合蛋白的表达及其生物学活性

实验旨在获得具有双重生物学活性的重组胸腺素a1(Thymosin alpha1, TM-a1)与复合a干扰素(IFNa-con)融合蛋白。选择大肠杆菌偏爱的密码子, 将合成的TM-a1与IFNa-con编码序列构成的融和基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-22b(+)、在宿主菌BL21(DE3)-Codon plus-RP-X中成功表达了可溶性融合蛋白(TM-a1-IFN-con)。表达量占总蛋白的20%以上。通过硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子筛层析后, 产品纯度达到96%以上。采用细胞病变抑制法测定融合蛋白的抗病毒活性, 采用细胞增殖实验检测融合蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果表明, 融合蛋白的抗病毒活性优于市售的IFNa1b和IFNa2a。对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响与市售的合成胸腺素a1相同。已有研究证实, 该融合蛋白具有良好的体外抗HBV作用, 其体外抗HBV活性比联合应用TM-a1和干扰素a强, 且细胞毒性明显低于联合应用TM-a1和干扰素a。以上结果表明, 通过大肠杆菌表达的可溶性融合蛋白(TM-a1- IFN-con), 既具有良好的干扰素a抗病毒作用, 也具有胸腺素a1促淋巴细胞增殖作用。     

融合干扰素-BLA（IFN-BLA）的构建、表达、纯化及抗病毒活性测定

干扰素-BLA(IFN-BLA)由干扰素-beta-1b(IFN-beta-1b)和干扰素-alpha-2b（IFN-alpha-2b）通过连接肽-GGGS-融合而成。优化了其在大肠感菌BL21 CodonPlus (DE3)-RIL中的实验室表达条件,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的35％以上并且主要以包涵体的形式存在。对包涵体的复性条件进行了摸索,建立了IFN-BLA的复性及纯化方法,纯化后的蛋白产量约为45 mg/L, 纯度在90％以上。抗病毒活性分析表明这一新的融合蛋白可能具有协同或加成活性。     

胸腺素α1与复合α干扰素融合蛋白的表达及其生物学活性

实验旨在获得具有双重生物学活性的重组胸腺素α1(Thymosin alphal,TM-α1)与复合α干扰素(IFNα-con)融合蛋白.选择大肠杆菌偏爱的密码子.将合成的TM-α1与IFNα-con编码序列构成的融和基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-22b( )、在宿主茵BL21(DE3)-Codon plus-RP-X中成功表达了可溶性融合蛋白(TM-α1.IFN-con).表达量占总蛋白的20%以上.通过硫酸铵沉淀、疏水层析,阴离子交换层析、阳离子交换层析,分子筛层析后,产品纯度达到96%以上.采用细胞病变抑制法测定融合蛋白的抗病毒活性,采用细胞增殖实验检测融合蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响.结果表明.融合蛋白的抗病毒活性优于市售的IFNα1b和IFNα2a.对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响与市售的合成胸腺素α1相同.已有研究证实.该融合蛋白具有良好的体外抗HBV作用.其体外抗HBV活性比联合应用TM-α1和干扰素α强,且细胞毒性明显低于联合应用TM-α1和干扰素α,以上结果表明,通过大肠杆菌表达的可溶性融合蛋白(TM-α1.IFN-con).既具有良好的干扰素α抗病毒作用.也具有胸腺素α1促淋巴细胞增殖作用.     

PHD2基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的构建PHD2基因原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,实现Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达。方法用SacⅠ酶切pET-43.1b（＋）制备线性化载体,设计与线性化载体两端具有至少15个同源序列的特异性引物,以真核重组质粒pCMV6-Entry-EGLN1为模板,PCR法扩增PHD2目的基因。采用In-Fusion技术构建原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,并将其导入大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达。用SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达出的融合蛋白。用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。结果成功构建了PHD2原核表达载体;SDS-PAGE结果显示融合蛋白以可溶性形式表达;Western blot鉴定表明融合蛋白可以与PHD2单克隆抗体特异性结合。结论实现了Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达,为PHD2生物学功能的研究奠定了基础。     

枯草杆菌谷氨酰胺转胺酶的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

利用PCR技术 ,从枯草杆菌DB40 3染色体上扩增出谷氨酰胺转胺酶基因 ,将其克隆到大肠杆菌载体pET32a( + )中 ,成功构建谷氨酰胺转胺酶表达载体pET32-BTGase ,并转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)。重组克隆在IPTG诱导下 ,表达出硫氧还蛋白 谷氨酰胺转胺酶 (Trx-BTGase)融合蛋白 ,表达量占细菌总蛋白量的 2 6%。利用金属螯合层析纯化菌体裂解上清中表达的融合蛋白 ,纯度超过 80 %,再通过分子筛层析进一步纯化得到融合蛋白纯品。酶活性分析表明表达的Trx-BTGase融合蛋白具有交联蛋白的活性 ,并发现Trx-BTGase融合蛋白和经凝血酶酶切后得到的BTGase单体都能催化牛血清白蛋白的聚合反应     

组织基质金属蛋白酶抑制剂-2的表达纯化及活性鉴定

组织基质金属蛋白酶抑制剂-2 (TIMP-2) 抑制肿瘤迁移及侵袭。文中以人TIMP-2为研究对象,探索人TIMP-2蛋白的原核表达特征,并进行纯化及活性鉴定。以人肺癌A549细胞的总RNA反转录得到的cDNA为模板,克隆人TIMP-2基因,构建pET28a重组表达载体;经酶切检测和测序分析的重组表达载体pET28a-TIMP-2转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导表达,并对表达条件进行优化。经镍亲和柱纯化后,用Western blotting法鉴定融合蛋白His-TIMP-2,并用明胶酶谱法检测融合蛋白的活性。研究发现融合蛋白His-TIMP-2在E. coli BL21(DE3) 中以包涵体的形式存在;在一定范围内,IPTG浓度对His-TIMP-2的表达量没有显著影响;而在该表达系统中,诱导温度和时间是关键参数,His-TIMP-2的表达量随诱导温度升高而增加;纯化并复性后的融合蛋白His-TIMP-2能有效抑制人肺癌A549细胞表达的基质金属蛋白酶的活性。具有活性的融合蛋白的获得为后续深入研究人TIMP-2的功能及机制奠定基础,并对肿瘤治疗具有重要意义。     

融合蛋白M-IL-2(~(88)Arg,~(125)Ala)在毕赤酵母中的表达及抗肿瘤活性研究

构建融合基因蜂毒肽(melittin)与人变构白介素2(M-IL-2(88Arg,125Ala))毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA/M-IL-2(88Arg,125Ala),转化毕赤酵母菌株KM71H,甲醇诱导筛选出的多拷贝阳性菌株表达融合蛋白,纯化融合蛋白,并进行初步的抗肿瘤活性研究。经测序及PCR鉴定,M-IL-2(88Arg,125Ala)正确插入pPICZαA中,电转化后,重组载体通过同源重组整合到酵母基因组中,SDS-PAGE检测在26 ku左右有明显目的条带,与理论相符。经Western blot鉴定具有较高抗原性及特异性。BCA法测定甲醇诱导96 h融合蛋白表达量达315.2 mg/L。CCK-8法检测融合蛋白对人卵巢癌细胞SKOV3细胞及Hela细胞生长抑制作用,表明纯化的融合蛋白在体外能抑制人卵巢癌细胞SKOV3细胞及Hela细胞的生长增殖。该研究为融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)大规模制备和动物实验以及临床前期研究奠定了基础。     

人干扰素α1b突变体IFNα1b/31K的构建及其生物学评价

目的:构建干扰素α1b突变体IFNα1b/31K,以期获得高效低毒的新型药物分子。方法:根据合理药物设计,采用定点突变技术,将干扰素α1b第31位氨基酸残基突变为K,并构建表达IFNα1b/31K重组蛋白。纯化后,对其抗病毒活性、抗肿瘤细胞增殖活性和动物体内急性毒性进行考察。结果:IFNα1b/31K表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后的IFNα1b/31K纯度大于95%,比活性约为IFNα1b的1.7倍,抗肿瘤增殖活性比IFNα1b降低,未见对实验动物的急性毒性作用。结论:成功设计构建并表达了高效低毒的IFNα1b突变蛋白分子。     

人血清白蛋白和人干扰素α2b的融合蛋白在毕赤酵母中的表达

为了延长IFNα2b在血浆中的半衰期,构建了编码HSA和hIFNα2b的融合基因并在毕赤酵母中获得高效表达,工程菌经5L发酵罐培养后获得的含融合蛋白的培养液经超滤浓缩、蓝色葡聚糖凝胶层析、疏水柱层析以及阴离子柱层析,融合蛋白的纯度达到95%以上。该融合蛋白能与干扰素抗体和人血清白蛋白抗体结合,并表现出与重组干扰素α2b相似的抗病毒活性。以猕猴为动物模型,分别从静脉和皮下单剂量给药,给药浓度为90μg/kg时,在336h后血浆中仍可检测到融合蛋白。其静脉注射的血浆半衰期为101h,皮下注射的半衰期为68.2h。皮下注射的生物利用度为67.9%。IFNα2b与HSA融合后,明显的延长了血浆半衰期,显现了其良好的临床应用前景。     

重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达rHSA

对基因工程菌Pichiapastoris的摇瓶发酵条件进行了试验 ,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在摇瓶发酵时 ,甲醇诱导基因工程菌P .pastoris表达重组人血清白蛋白的发酵周期为 96h ;甲醇的最佳诱导浓度为 1 0g L ;发酵pH范围为 5 72～ 6 5 9;在摇瓶培养时 ,随着接种量的增加 ,虽然目的蛋白表达量缓慢增加 ,但单位细胞光密度的蛋白产率却明显下降 ,符合y =1 2 941x- 0 50 59方程 (线性相关系数r=0 9789) ,其限制性因子很可能为溶氧。在分批发酵 ,接种量为 1 0 %且种子细胞光密度 (OD60 0 )为 2 0左右时 ,细胞生长的延迟期为 2 1 1h左右 ,细胞生长光密度与培养时间的关系模型为 :y =0 7841e0 .2 3 19t(线性相关系数r=0 .993 6 ) ;在补料发酵时细胞干重浓度可达到 1 1 5g L— 1 6 0g L ,在 1 2 0h重组人血清白蛋白表达量最大达到 3 6g L。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在毕赤酵母中的融合表达及其活性研究

为了获得结核分枝杆菌ESAT 6蛋白在毕赤氏酵母中的高效表达 ,将人α-2a干扰素基因、结核分枝杆菌esat-6基因经PCR扩增并加上相应的酶切位点 ,两基因之间的DNA接头编码肠激酶识别的多肽 ,DNA经酶切连接插入分泌型载体pPIC9K ,将重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6用SalⅠ单酶切之后 ,电击转入PichiapastorisSMD1168中 ,采用G418梯度筛选获得高抗性转化子。以甲醇作为诱导物 ,发酵4d后取上清 ,进行SDS PAGE和Westernblot鉴定并分析表达产物的干扰素活性。结果表明 ,重组菌株成功地分泌表达了分子量大小约为 30kD的融合蛋白 ,表达产物不仅具有较高的干扰素活性 ,而且可以和结核病人血清发生特异性结合 ,为结核病的特异性诊断和结核病新型疫苗的研制打下了基础.