CpG基元的免疫学进展及基因治疗策略

CpG诱发免疫反应的能力对免疫预防是一大优点 ,但在基因治疗中 ,质粒中所含的CpG基元能够阻止基因转移或导致巨大副作用 (炎症和毒性 )。本文简单综述了CpG基元的免疫学活性、主要作用和信号转导通路 ,并且针对它在基因治疗中存在的问题及可能的解决办法进行探讨。     

增加CpG基元的汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫作用

以往的研究表明非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为基元构成的特定结构是一种很有希望的候选疫苗佐剂。为了研究增加CpG基元的汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫作用,在本实验中,将重组真核表达质粒 pcDNA3.1 S(ISS)直接肌注免疫BALB/c 小鼠,分别用ELISA法检测血清特异性抗体的变化,MTT法检测 T细胞增殖反应,以及用ELISA kit检测免疫鼠脾细胞上清液中细胞因子IL 4和IFN γ的动态变化,从而了解免疫鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应。结果显示 pcDNA3.1 S(ISS)接种组的小鼠血清抗体水平、T细胞增殖反应以及细胞因子IFN γ的产生水平较对照组 pcDNA3.1 S和空载体 pcDNA3.1 接种组的要高。而细胞因子 IL 4 较对照组却无明显变化。由此可见,增加CpG基元的质粒能够增强其所诱导的免疫反应,可用于那些需要借助强有力细胞免疫来清除病原体的疫苗研制中。     

增加CpG基元的汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫作用

以往的研究表明非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为基元构成的特定结构是一种很有希望的候选疫苗佐剂.为了研究增加CpG基元的汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫作用,在本实验中,将重组真核表达质粒pcDNA3.1+S(ISS)直接肌注免疫BALB/c小鼠,分别用ELISA法检测血清特异性抗体的变化,MTT法检测T细胞增殖反应,以及用ELISA kt检测免疫鼠脾细胞上清液中细胞因子IL-4和IFN-γ的动态变化,从而了解免疫鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应.结果显示pcDNA3.1+S(ISS)接种组的小鼠血清抗体水平、T细胞增殖反应以及细胞因子IFN-γ的产生水平较对照组pcDNA3.1+S和空载体pcDNA3.1+接种组的要高.而细胞因子IL-4较对照组却无明显变化.由此可见,增加CpG基元的质粒能够增强其所诱导的免疫反应,可用于那些需要借助强有力细胞免疫来清除病原体的疫苗研制中.     

CpG甲基化与基因调控

CpG双核苷酸中的胞嘧啶甲基化和去甲基化在哺乳动物的基因表达中有重要的调控作用.哺乳动物基因组中有两类启动子:CpG岛启动子和CpG缺乏启动子.两种蛋白质因子通过与甲基化CpG的相互作用影响基因表达,CpG岛在基因组分析中也有广泛的用途.     

微环DNA研究进展

质粒载体在基因治疗中占据重要地位.传统质粒DNA在真核生物中可能会引起严重的炎症反应,未甲基化的CpG序列可能抑制基因的表达,最好的解决办法是在生产质粒载体过程中将细菌调控序列整体消除.微环DNA是一种新颖的小环超螺旋表达框,它是传统质粒在大肠杆菌体内通过位点特异性重组得到的.微环DNA缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌...     

人类基因组上CpG岛的定位和系统分析

为了研究CpG岛产生和消失机制以及位于基因启动子区域外的CpG岛保守性等问题,我们通过序列比对和进化保守性分析等方法,分析在人类和小鼠中保守的基因上的CpG岛。结果显示已有保守序列的突变以及序列插入删除是CpG岛产生和消失的主要原因,进一步分析发现52%的在小鼠基因组上保守序列完全缺失的CpG岛位于两个转座子之间,提示转座子所介导的序列插入是CpG岛形成和消失的重要原因。人类基因组上在启动子区域外的CpG岛中约有79%为新产生的CpG岛,显著高于启动子区域内新产生的CpG岛比例(41%)。GO分析表明与这些CpG岛相关的部分基因与神经系统发育显著相关,提示新产生的CpG岛参与神经发育过程。     

小鼠骨髓细胞中p16和Ralb基因启动区CpG岛的甲基化位点分析

抑癌基因p16和白血病致癌因子Ralb与白血病的发生密切相关,其启动子区CpG岛的甲基化对基因表达具有重要作用.本文旨在分析p16、Ralb基因启动子区CpG岛甲基化位点信息,并比较这两个基因在小鼠骨髓细胞和原代培养的骨髓细胞中甲基化状态的差异.运用"MethPrimer"软件预测p16、Ralb基因启动子区的CpG岛,设计甲基化特异性引物.利用重亚硫酸盐测序法(BSP)检测甲基化位点信息.结果显示,p16有1个CpG岛,岛上21个CpG位点全部未发生甲基化;Ralb有2个CpG岛,CpG岛1上的5个CpG位点全部呈甲基化状态,而CpG岛2上的17个CpG位点全部呈非甲基化状态,且小鼠骨髓细胞和体外原代培养的骨髓细胞中两基因的甲基化状态一致.表明p16、Ralb基因甲基化状态未受外界培养条件的影响而改变,提示在与两基因甲基化相关的研究中体外试验可替代体内试验.     

预测DNA序列中短CpG岛新方法

在基因表达调控中,长度在200~500bp之间的短CpG岛具有非常重要的作用,然而目前并没有一种非常好的方法寻找短CpG岛。基于给定长度DNA片段上碱基随机分布的排列组合算法,我们定义了一种计算CpG观察预期比的新方法。结合DNA片段长度和GC含量这两个参数,该方法给出了人类21号和22号染色体上CpG岛分布的预测结果。根据CpG岛与基因功能区、Alu重复序列和UCSC的CpG岛对比分析,本研究给出了新的CpG岛判断准则:(1)CpG岛不小于200bp;(2)GC占比不小于50%;(3)CpG观察预期比不小于1.4。通过与Takai方法的对比分析显示,新方法能够显著地排除Alu重复序列对CpG岛预测的影响,并且能够准确预测具有更短长度的CpG岛在DNA片段上的分布。多基因转录起始位点基因分析结果表明,短CpG岛是UCSC的CpG岛的核心组成部分,短CpG岛是参与基因表达调控的核心元件。本研究为预测和分析短CpG岛在人类基因调控中的作用提供了必要的手段。     

果蝇启动子区域CpG岛和TATA框预测与分析

CpG岛和TATA框在基因表达调控方面具有重要的作用,本研究从EBI核酸数据库中下载经试验证实的果蝇启动子序列共计1 917条,对其中的CpG岛、GC碱基分布和TATA框进行了分析。预测果蝇启动子序列中CpG岛的最佳参数组合为:GC最低含量为0.44,CpG最低出现率为0.6,CpG岛最小长度为200 bp,在此条件下,发现有84.82%的果蝇启动子中含有1~2个独立的CpG岛。果蝇启动子序列的平均GC含量为39.83%,GC碱基在启动子中的分布表现出规律性变化。果蝇启动子中TATA框的分布比较广泛,有32.86%的启动子中含有1个TATA框;有18.73%的启动子中含有2个TATA框;另有13.88%的启动子中含有2个以上的TATA框;此外,有34.53%的启动子没有TATA框。表明果蝇启动子中有比较丰富的CpG岛和TATA框。     

含CpG基元核酸疫苗免疫慢性MPTP帕金森病小鼠的治疗作用

目的探讨含有CpG基元的α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）核酸疫苗免疫慢性帕金森病小鼠的治疗效果。方法将本实验室成功构建的含有CpG基元的α-syn核酸疫苗-pVAX1-hα-Syn140用Qiagen试剂盒大量制备α-syn质粒;24只慢性MPTP帕金森病小鼠随机分为3组：实验组、空质粒对照组和PBS对照组,各组小鼠分别肌注pVAX1-hα-Syn140重组质粒、pVAX1空质粒和PBS各100μL,共免疫3次,每次间隔3周,末次免疫后2周,观察小鼠行为学变化及中脑黑质α-syn表达和多巴胺能神经元数目变化。结果pVAX1-hα-Syn140核酸疫苗免疫组小鼠的类帕金森病样症状与pVAX1空质粒和PBS对照组相比减轻,有显著差异（P〈0．01）;小鼠中脑黑质α-syn表达较对照组减少约39％（P〈0．01）,且多巴胺能神经元数目较空质粒和PBS对照组增多了46％～55％（P〈0．01）。结论pVAX1-hα-Syn140核酸疫苗具有较强的免疫原性,能对帕金森病小鼠产生较好的免疫治疗作用。     

人类全基因组范围的CpG岛的预测与分析

CpG岛的甲基化是表观遗传中基因表达调控的重要机制。虽然目前已存在几个从DNA序列判别CpG岛的标准,但如何在标准中选择合适的参数仍是研究的焦点。文章通过分析比较两种经典CpG岛判定标准与三种预测方法,提出了改进的CpG岛预测方法——CpGISeeker。应用该预测方法,结合判定标准中的三个基本参数组合出的13组组合参数,在人类全基因组范围内进行了CpG岛预测,并统计分析了CpG岛的重复序列组成以及相对于基因转录起始位点的位置分布情况。分析结果表明CpGISeeker具有更精确判定CpG岛的特性;同时还提示,随着判定标准严格性的增加,CpG岛的重复序列含量降低,与基因转录起始位点的相关性提高。将CpG岛最小尺寸为500bp、GC含量为60%、CpG出现率达到0.65的组合参数作为标准,是目前预测CpG岛的最佳方式。     

质粒骨架的CpG修饰对DNA疫苗免疫原性的影响

目的：探讨不同类型的CpG对DNA疫苗免疫应答的影响。方法：将3种不同类型的CpG通过骨架改造的方式引入核酸疫苗的质粒载体骨架中作为内源性佐剂,以LacZ为模式抗原,对其免疫小鼠后特异性抗体水平、细胞免疫水平和细胞因子水平进行比较和分析。结果：3种不同类型的CpG序列在体内能够不同程度地增强免疫小鼠的特异性抗体水平和细胞免疫水平,并且不同类型的CpG序列可能具有不同的免疫调节作用。结论：作为内源性佐剂,CpG免疫刺激DNA序列可不同程度地提高模式抗原特异性的免疫反应,可根据不同抗原的特点加以利用。     

CpG对乙型肝炎基因重组(CHO细胞)疫苗免疫效果的影响

为了研究CpG-寡脱氧核苷酸(CpG-OPN)作为佐剂对乙型肝炎基因重组(CHO细胞)疫苗(简称乙肝疫苗)免疫效果的影响,以乙肝疫苗加Al(OH)3、疫苗加CpG和疫苗加Al(OH)3与CpG3三种配伍方式,通过腹腔、皮下或肌内3种不同途径免疫Balb/c小鼠,观察不同免疫途径和不同配伍的免疫效果.同时又将疫苗与CpG混合后在4℃存放6个月再免疫小鼠,观察CpG的稳定性.结果表明:①3种免疫途径中以肌内注射效果最好,这在使用CpG的实验组尤为明显,在该组肌内免疫的ED50比腹腔的低了10倍,而诱发的抗体滴度提高了3倍;②疫苗与CpG、Al(OH)3联合使用的免疫效果最好,在肌内免疫时联合使用的免疫效果比疫苗+Al(OH)3提高4倍,比疫苗+CpG提高7倍;③疫苗+Al(OH)3免疫时,表现为IgG1抗体亚型占优势,而再加入CpG后则IgG1和IgG2a均升高,以IgG2a最显著;④疫苗与CpG混合后4℃保存半年,不影响其活性.     

CpG寡核苷酸联合热固化瘤苗对肝癌细胞Hca-F荷瘤小鼠的免疫治疗研究

目的探讨CpG寡核苷酸(ODN)联合热固化瘤苗的抗肿瘤作用。方法剥取肿瘤．称重并计算抑瘤率;MTT法测免疫小鼠CTL、Mψ和CTL细胞的体外杀伤活性;ELISA法测免疫小鼠血清中IL-10、IL-12水平。结果联合使用CpG ODN和热固化瘤苗可以诱导荷瘤小鼠的抑瘤作用,其抑瘤率与单独使用瘤苗或CpG ODN比较差异有显著性;联合使用CpG ODN和热固化瘤苗可以提高荷瘤小鼠NK、Mψ和CTL细胞的体外杀伤活性,与单独使用瘤苗组相比较,差异具有显著性,但与单独使用CpG ODN组相比较,NK、Mψ细胞的体外杀伤活性差异无显著性;联合使用CpG ODN和热固化瘤苗可以提高荷瘤小鼠血清中IL-12水平并降低血清中IL-10水平,与二者单独使用组比较差异都具有显著性。结论联合使用CpG ODN和热固化瘤苗能显著提高机体的免疫功能,尤其是特异性细胞免疫功能。     

CpG DNA 对鸡免疫增强作用的研究进展

新型免疫刺激剂CpG DNA在多数哺乳动物中展示了良好的免疫刺激效果。相应的研究在非哺乳类的家禽中也有广泛开展,并且表现出了与在哺乳类中有所不同的结果。该文将着重练述CpG DNA在家禽中的研究进展。为了更好地了解CpG DNA研究中需要进一步深入的问题,作者也将引用其它动物中的某些研究数据。     

重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN对转基因小鼠的免疫治疗效果

目的利用免疫耐受的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)转基因(Transgenic mice,Tg)小鼠模型,研究重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN的免疫治疗效果,为HBV的临床免疫治疗提供思路和依据.方法重组HBsAg疫苗单独或辅以CpG ODN,同时设干扰素(IFN)药物组和生理盐水(NS)照组,多次免疫治疗HBV转基因小鼠,于免疫前和末次免疫后2周、4周眼球后静脉丛取血,动态观察各组小鼠血清中HBsAg量、HBsAg阴转率、Anti-HBs阳性率和HBVDNA拷贝数的变化.在治疗后应用HE染色观察各组小鼠肝组织病变活动度以及SP组化法观察活肝组织中HBsAg表达量的改变.结果在免疫治疗后2周,HBsAg疫苗组和HBsAg CpG组血清中的HBsAg量较免疫前和同期的IFN组、NS组均有明显降低(P＜0.05),并且到4周时降低作用依然很明显;免疫治疗后2周时两组100%出现Anti-HBs抗体;HBsAg CpG组治疗后2周血清HBsAg有1只转阴,4周时阴转数增加到3只.其他三组中均无阴转;免疫治疗后2周至4周HBsAg CpG组的小鼠HBV DNA的拷贝数可降低1～2个数量级,IFN组2周部分出现轻微降低但到4周时出现回升;HBsAg CpG组肝组织中HBsAg量的表达均出现不同程度的降低;病理学检测显示HBsAg CpG组肝组织中浸润大量淋巴细胞,可见恢复期的肝小叶.肝组织病变活动度情况为HBsAg CpG组＞HBsAg组＞IFN组、NS组.结论CpG ODN增强重组HBsAg疫苗对HBV转基因小鼠的免疫治疗效果.重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN可作为临床上免疫治疗慢性HBV感染的可行性途经.     

CpG ODN增强rHBsAg疫苗对小鼠免疫应答影响的研究

通过CpG寡核苷酸(CpG ODN)与重组HBsAg蛋白疫苗(rHBsAg)联合免疫C57BL/6BL/6小鼠,观察CpG ODN对小鼠免疫状况的影响。试验分对照、乙肝疫苗以及用乙肝疫苗加CpG三组,MTT法分别进行HBsAg特异性刺激淋巴细胞转化试验、HBsAg特异性刺激细胞毒性T细胞杀伤试验、自然杀伤细胞非特异性杀伤试验,以及ConA刺激淋巴细胞转化试验;ELISA测定HBsAb、INF-γ、IL-12和IL-4结果中,疫苗加CpG组抗原特异性转化试验指数为4.05±0.31;疫苗加CpG组抗原特异性CTL率为82.27±22.64,在统计学上差异显著(P<0.05);而HBsAb、INF-γ、IL-12的结果分别为51.85±14.41、802.25±104.25和373.62±66.58,与对照组及疫苗组比较,差异显著(P<0.05)。CpG ODN能作为一种新的免疫佐剂更好地增强重组乙肝表面抗原蛋白疫苗诱导小鼠产生高效的体液和细胞免疫应答。     

基于高通量测序的怒江红山茶微卫星位点特征分析

以怒江红山茶叶片为材料,采用Illumina Hiseq 2000平台测序,共获得140 996条无冗余的序列,进行SSR位点搜索后,得到32 696个SSR位点,出现频率为23.2%。所搜索的SSR以二核苷酸重复类型最多,三核苷酸和单核苷酸次之,四、五、六核苷酸重复类型较少（<1%）。单核苷酸重复类型中以A/T基元较丰富（10.92%）;二核苷酸中AG/CT基元出现频率最大,达到49.72%,AT/AT基元和AC/GT基元所占比例相差不多,而CG/CG基元所占比例最少,为0.07%;三核苷酸重复类型中AAG/CTT最多,ACC/GGT、ATC/ATG和AGG/CCT基元次之,CCG/GGC、ACT/AGT和ACG/CGT基元较低,都小于1%;四、五、六核苷酸类型中各重复基元均较少。在怒江红山茶转录组中,微卫星的数量随着对应的重复类型、重复次数的增加而降低,也随重复区段碱基长度的增加而降低。     

奶牛产奶性状与乳房炎相关基因CpG含量及分布特征的比较分析

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,基因启动子区及第一外显子区的CpG甲基化通常抑制该基因的表达,而去甲基化则促进基因表达。已有的研究发现荷斯坦牛的乳房炎指标SCC(Somatic cell count)与产奶量呈较强负相关。文章分析并比较了这两类性状的相关基因的启动子区、第一外显子、下游2 000 bp序列中CpG含量及分布特征。结果表明,乳房炎相关基因的启动子、第一外显子中CpG含量显著低于产奶性状相关基因,而两类性状基因下游2 000 bp序列中CpG含量无显著性差异。另外,文中提出了两个量化基因序列中CpG特征的指标,一个是CpG平均距离,用来衡量序列中的CpG分布;另一个是条件概率p(G|C),用以量化序列中二核苷酸CpG随碱基C出现的可能性,并对两类基因的启动子和第一外显子区域的这两个指标做了统计检验。研究结果对产奶性状与乳房炎相关基因的DNA甲基化调控研究奠定了基础。     

hMLH1基因启动子CpG岛甲基化致MSI与肿瘤的关系

通过人类错配修复基因( hMLHl)启动子CpG岛甲基化与微卫星不稳定性(MSI)的分析,探讨癌症发病的机制.错配修复基因hMLH1启动子CpG岛甲基化是hMLH1基因失活的重要机制,而hMLH1的表达失活则可导致MSI的产生,促进癌症的发生.根据一系列研究得出结论,在肿瘤组织中hMLH1基因启动子CpG岛甲基化和微卫星不稳定(MSI)有显著相关性,并在癌症早期发生、发展过程中起重要作用.因此临床检测hMLH1基因启动子CpG岛甲基化及微卫星不稳定可能成为癌症鉴别诊断、评价预后、指导化疗的分子标志物之一.