普通野生稻绿色组织特异表达启动子的克隆与鉴定

绿色组织特异表达启动子可调控外源基因只在受体作物的绿色组织中定点、高效地表达。以普通野生稻为实验材料,克隆了绿色组织特异表达启动子Or GSP,构建Or GSP和GUS基因融合的表达载体,转入拟南芥中鉴定功能。启动子Or GSP长度为825 bp,含有基本的转录起始元件TATA-box和CAAT-box,以及光响应元件TCCC-motif、Sp1、G-box、I-box、GA-motif和as-2-box等。转基因拟南芥GUS组织化学染色结果表明,启动子Or GSP调控GUS基因只在绿色组织中特异表达。GUS活性测定结果显示,叶和茎中的GUS活性比根中明显提高。普通野生稻中克隆的启动子Or GSP为绿色组织特异表达启动子,可为作物分子育种提供新的调控元件。     

白叶枯病菌胁迫下云南普通野生稻SSH文库的构建及抗病相关基因分析

以云南普通野生稻为材料,利用抑制差减杂交技术（SSH）,构建了白叶枯病菌胁迫的云南普通野生稻特异表达基因的差减文库.通过对文库所有阳性单克隆进行测序,聚类分析后共获得494条高质量的表达序列标签（EST）.经过BlastN分析,有417条与已知功能的序列有较高同源性;经BlastX分析,有104条EST与未知功能蛋白或假定蛋白有较高相似性,49条EST未能找到同源匹配,341条EST与已知功能蛋白有较高同源性.初步分析发现,这些基因主要涉及能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、防御与抗逆应答反应、信号转导、光合作用及膜运输等代谢过程.使用半定量RT-PCR研究了7个可能与白叶枯病抗性相关的EST序列在云南普通野生稻对照和白叶枯病菌处理的叶片中的表达情况,并获得这些基因的表达谱.结果发现,克隆编号为OR7,OR68和OR826的EST受白叶枯病菌胁迫诱导上调表达,其中OR826 EST在蛋白数据库中无同源序列,可能是一类新的白叶枯病抗性基因,而组成型表达的OR143 EST在对照和接菌处理的叶片中均能检测到其mRNA的表达,但其表达量在白叶枯病菌胁迫48 h后逐渐增强,推测这些基因直接参与了云南普通野生稻抗病防御反应.本研究为从云南普通野生稻中发掘和克隆新的白叶枯病抗性基因提供了理论依据,为进一步研究云南普通野生稻抗白叶枯病的分子机制奠定了基础.     

黑芥子酶基因pyk10根特异启动子在番茄中的验证

黑芥子酶是一类催化芥子油苷水解的同工酶,pyk10是一个在拟南芥根和下胚轴中特异表达的黑芥子酶基因.从拟南芥Columbia生态型基因组中克隆的长度为1 450 bp的pykl0基因启动子片段,以gus基因为报告基因构建了植物表达载体pPykG.通过农杆菌介导法,将pykl0的根特异表达启动子以及gus基因转入了番茄中蔬6号,经PCR检测,转化植株中扩增出pyk10启动子特异性条带.组织化学法检测及定量分析,显示pyk10启动子驱动gus基因在番茄的根部特定表达.     

疣粒野生稻胚性细胞与叶片抗白叶枯病信号物质和相关抗病基因的表达差异

为了研究白叶枯病菌对疣粒野生稻的抗病信号物质和抗病基因的影响,将疣粒野生稻的胚性细胞(即愈伤组织,非特异化)和叶片细胞(已特异化)进行白叶枯病原菌胁迫处理,然后分别检测其抗病信号物质及抗白叶枯病相关基因的表达情况。结果发现,愈伤组织的SA和JA含量无论是未处理还是处理后均高于叶片细胞,这可能与愈伤组织没有特异化、细胞壁较薄致使病原菌易侵入有关,为了防止病原菌的侵害而产生高的表达量,同时说明疣粒野生稻抗白叶枯病能力是在原胚细胞就已具备;ME207基因在疣粒野生稻细胞特异化前后均有表达,而ME281基因则在细胞特异化前是诱导型表达基因、特异化后是组成型表达基因。     

水稻淀粉分支酶基因5′上游区缺失对基因表达的影响

为研究水稻淀粉分支酶基因 (sbe1) 5′上游调控区中存在的顺式作用元件 ,我们将水稻sbe1基因翻译起始点 (ATG) 5′上游区 1.2kb(- 10 96～ 74bp)片段经过不同限制性内切酶消化及外切核酸酶ExoIII部分消化 ,得到 4个 5′端缺失的片段。将这些缺失片段分别与 gus基因编码区连接 ,构建成融合质粒 ,经土壤农杆菌 (Agrobacterium)介导引入水稻 ,定量测定转基因水稻植株未成熟种子中的 gus酶活力。结果表明 ,- 5 16～ 6 4bp的sbe1启动子片段可以驱动gus基因的高表达 ,其它 3个启动子片段 (- 10 96～ 74bp ,- 2 95～ 74bp ,- 146～ 6 4bp)驱动 gus基因表达的能力较低。推测在sbe1基因 5′上游区 - 5 16～ - 2 95bp片段中可能存在能使 gus基因高表达的增强元件     

基于染色体置换系的野生稻抽穗期及紫色性状QTL的鉴定

利用一套以9311为背景的普通野生稻染色体片段置换系群体为研究材料,进行野生稻相关QTL的定位与基因的鉴定。在多年多点的抽穗期调查数据基础上,结合200多个分子标记引物的基因型鉴定结果,定位到11个与抽穗期相关的QTL;选取携带相关QTL导入片段的两个置换系进一步研究,发现2个抽穗期主效QTL均为已克隆基因的等位基因。利用叶鞘、稃尖、柱头颜色与9311差异显著的一个单片段置换系定位到来自野生稻的紫色性状基因Or C,初步鉴定与栽培稻的等位基因功能不同。这些结果再次表明染色体片段置换系是行之有效的QTL定位以及基因发掘的遗传群体。通过对抽穗期、紫色性状相关QTL的定位与基因的鉴定,为进一步的功能研究提供了基因资源。     

水稻胚乳特异表达基因的挖掘及顺式元件分析

本研究旨在利用计算机方法对水稻胚乳特异性表达基因进行挖掘和功能分析,及特异性顺式调控元件的预测。我们将基因在不同组织中的表达信号谱看作多维空间内的向量,利用向量夹角余弦法计算其与理想状态下该基因在某一组织特异表达向量的相似度,以此来判断组织特异性表达基因。本文通过对水稻芯片数据的大规模分析,共挖掘出了127个在水稻胚乳中特异表达基因。并对其启动子进行顺式元件预测,发现两个与胚乳特异表达相关的顺式调控元件,其保守序列分别为CATGCATSCM和GATCGATCGR。与已知功能的顺式元件比较显示,前者为种子特异基因表达相关的RY repeat元件,而后者则与元件RNFG1相似,但其具体功能尚不明确。     

海南黎族聚居区山栏稻的起源演化研究

以14份海南黎族聚居区的山栏稻为研究材料、以原产于中国的69份亚洲栽培稻和110份普通野生稻为对照组,分别对核中SSⅡ基因、ITS基因和Ehd1基因、叶绿体中ndhC-trnV基因以及线粒体中cox3基因等5段序列进行测序,分析基因序列多样性和单倍型,并揭示海南黎族聚居区山栏稻的起源地和驯化过程。结果表明,黎族聚居区山栏稻的基因多样性低于亚洲栽培稻,而亚洲栽培稻的基因多样性低于普通野生稻;85%左右的山栏稻为偏粳型;山栏稻与广东和湖南的普通野生稻亲缘关系较近,而与海南的普通野生稻的亲缘关系较远,推测黎族的山栏稻可能起源于广东和湖南的普通野生稻。     

西瓜果实AGPL1基因启动子的序列分析

利用PCR技术从西瓜嫩叶中扩增出1.2 kb AGPL1基因启动子,通过PlantCARE和PLACE数据库对启动子序列进行生物信息学分析。结果表明,AGPL1启动子具有多个典型的TATA-Box和CAAT-Box等基本元件,以及高水平转录顺式作用元件5UTR Py-rich stretch,光响应元件ACE、ATCC-motif、Box 4、I-Box、Sp1、TCCC-motif、GAG-motif、MNF1,2个赤霉素响应元件GARE-motif、P-box,参与蛋白代谢调节的顺式作用元件O2-site,参与水杨酸反应的顺式作用元件TCA-element,厌氧诱导所需的顺式作用元件ARE、逆境胁迫响应元件TC-rich repeats、生理昼夜节律控制元件circadian等,为研究外源基因在果实中的特异表达提供参考。     

杜氏盐藻DCA1启动子内GT重复序列在盐诱导调控中的作用

为了研究杜氏盐藻双拷贝碳酸酐酶（DCA1）启动子中高度重复的GT序列在盐诱导表达时的调控作用,设计不同的引物,通过PCR法获得6条不同长度的DCA1启动子片段,分别与gus报告基因融合后构建6个表达载体;电击法转化杜氏盐藻细胞。组织化学染色和荧光定量法检测GUS在不同盐浓度下的瞬时表达。结果显示,DCA1启动子内高度重复的GT序列无论与其上游、下游或上下游片段同时结合均能驱动gus基因的表达,并且其表达受氯化钠浓度调控,其中和上下游均结合时活性最强;无GT重复序列的融合片段及GT 重复的下游片段也能驱动gus基因的表达,但其表达不受氯化钠浓度调控;而GT重复的上游片段不能驱动gus基因的表达。结果提示:盐藻DCA1启动子中高度重复的GT序列在盐诱导调控中起重要作用,可能为一种新型的盐诱导元件。     

甘蔗茎杆特异表达基因启动子的克隆及初步分析

甘蔗茎秆是利用转基因方法生产重组药用蛋白或有价值的化合物的理想器官,构建能在甘蔗茎秆中高水平表达异源蛋白质的表达载体是非常有意义的。而一个高效表达的载体,启动子则是其最重要元件之一,因此,茎秆特异性启动子的获得是甘蔗作为生物反应器的前提。利用染色体步移法克隆到甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a 5′端上游的一段长1968bp的序列（ Ppst2a ）,经序列测定及软件分析表明,该序列具有典型的启动子结构。此序列置换植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV 35S启动子,构建植物表达载体,命名为pCAMBIA1900,该启动子下游为gus基因。利用基因枪法转化甘蔗的茎和叶,对gus基因的瞬时表达进行测定,结果表明所获得的己糖转运蛋白基因启动子只在甘蔗茎中驱动gus基因瞬时表达,该启动子具有茎秆特异性。     

水稻种子特异表达OsEm基因5'上游调控区的克隆与序列分析

植物分子农场能以低成本大规模生产重组医药蛋白,种子是重组蛋白最理想的积累场所。为了获得分子医药种子特异表达启动子,以取材方便的地方栽培水稻为材料克隆了种子特异Os Em基因767 bp的5'端调控序列。顺式作用元件分析的结果发现5'端调控序列含有50 bp的核心启动子区域和保守的调控元件TATA box及CAAT box,还含有脱落酸和茉莉酸甲酯等激素响应元件、光反应元件、缺氧特异诱导元件以及种子特异性元件。进一步分析发现本研究克隆的序列内部有15 bp的核苷酸缺失,它与Gen Bank收录的野生型水稻Os Em基因5'端调控序列之间的序列相似性为98.08%。上述结果揭示不同来源的Os Em基因5'端调控序列具有序列多样性,它们能够参与激素、光和逆境胁迫防御等反应,可作为植物分子农场种子特异性启动子。     

金针菇高表达基因的密码子偏好性及特征分析

为探究金针菇的密码子偏好性,挖掘高表达基因的特征信息,以金针菇基因组及转录组数据为材料,分析金针菇的密码子偏好性及其影响因素,并对发育阶段高表达基因进行功能注释和顺式元件分析。分析表明,金针菇高表达基因表现出较强的密码子偏好性,且其偏好密码子多以胞嘧啶(C)结尾,此外在高表达基因中存在6种氨基酸的最优密码子较为保守。在进化过程中,金针菇高表达基因密码子偏好性受到自然选择压力的影响较大。功能注释分类表明,高表达基因多为核糖体通路相关的基因,与蛋白质翻译和生物合成相关。顺式元件分析表明,高表达基因启动子区域大多存在MeJA响应元件、ABA响应元件、光响应元件及MYB转录因子结合元件。研究结果可为提高金针菇异源表达效率和挖掘强启动子提供理论基础和思路。     

欧美杨水分利用效率相关基因 PdEPF1的克隆及表达

提高植物水分利用效率(WUE)是未来解决我国甚至世界干旱缺水的最重要手段之一。在对植物WUE的众多研究方法中,大多集中在生理手段,但通过分子生物学手段研究其表达调控机制的较少。欧美杨(Populus deltoides×Populus nigra)是中纬度地区最适合种植的短轮伐期工业用材集约经营树种之一。近年来我国引进了许多优良的欧美杨无性系用于营造大面积的速生丰产林并取得很好的经济和社会效益。但高耗水量的缺点限制了其进一步的推广。通过基因芯片技术从欧美杨中找到一个可能调控WUE的基因-PdEPF1.荧光定量表达进一步验证了这一结果。荧光定量表达分析表明该基因受ABA、盐、冷、干旱等胁迫诱导表达。组织特异表达分析说明PdEPF1基因在顶端叶和根中有表达,成熟叶衰老叶中则无表达。克隆到启动子分析表明该启动子含有多种干旱响应元件(drought response elememt),赤霉素响应元件(GA response elememt),低温响应元件(coldresponse elememt),ABA响应元件(ABA response elememt)等逆境相关的作用元件。     

甜瓜黄瓜素基因启动子表达载体的构建及分析

该研究构建了由黄瓜素基因5′端310bp启动子序列驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因的植物表达载体pPZP-CGN,通过花粉管通道法将植物表达载体pPZP-CGN导入甜瓜,并采用荧光法定量测定转基因植株中GUS活性。结果显示,gus基因在果实中高表达,而在根、茎、叶等组织中表达活性很低,表明黄瓜素基因上游310bp启动子具有指导外源基因在果实中高效特异表达的特性。     

Pib启动子中茉莉酸和乙烯响应元件的转基因分析

水稻Pib基因的表达受茉莉酸、乙烯等激素诱导, 为了确定该基因启动子响应茉莉酸和乙烯诱导的必需区域, 进一步阐明茉莉酸和乙烯响应分子元件, 文章用PCR制备了Pib全长启动子-3 572~2 bp及3个5′端有不同长度缺失的Pib启动子片段-2 692~2 bp、-1 335~2 bp、-761~2 bp。4个不同长度Pib启动子分别置换掉双元质粒中gus基因上游的35S构建为重组质粒, 经农杆菌介导转入水稻获得转基因植株。转基因水稻中gus活性的蛋白质水平和mRNA水平的定性和定量分析结果表明, 全长Pib启动子(-3 572~2 bp, pNAR901)启动活性最强, 茉莉酸或乙烯诱导6 h后, 其驱动gus基因在转基因植株各部组织中的表达量明显上升。而-3 572~-2 692 bp区段序列缺失后不但Pib启动子启动活性显著降低而且也丧失了对茉莉酸和乙烯的诱导活性。pNAR902(-2 692~2 bp),pNAR903(-1 335~2 bp)和pNAR904(-761~2 bp)中的Pib启动子序列的缺失长度相差达2倍和3倍以上, 但其对茉莉酸和乙烯的诱导响应没有区别。这些结果显示3个Pib启动子缺失体构建中, 其共同缺失序列即-3 572~-2 692 bp区域是Pib启动子茉莉酸和乙烯诱导响应的必需区域。软件检索证实, Pib启动子序列中只在上述共同缺失区段之内的-2 722 bp处有一个GCCGCC基序。文章报道的转基因实验表明GCCGCC基序可能是Pib基因中有关茉莉酸和乙烯诱导响应的顺式分子元件。     

栽培稻与其野生近缘种的可交配性研究

通过人工授粉方法研究栽培稻与二倍体和四倍体野生稻之间的可交配性.以栽培稻为对照,用光学显微镜观察不同野生稻花粉在同一栽培种柱头上的萌发生长情况.结果表明,在栽培稻柱头上普通野生稻(AA)花粉萌发最好,与对照萌发情况相近.药用野生稻(CC)萌发差,表现为柱头上花粉附着量少,开始萌发时间迟,萌发量少,花粉管扭曲、缠绕、伸长慢等.四倍体野生稻未观察到有萌发现象.说明普通野生稻与栽培稻亲缘关系近,可交配性好;药用野生稻与栽培稻可交配性差;四倍体野生稻与栽培稻可交配性极差.由此推断,转基因水稻与普通野生稻通过花粉途径发生基因漂移的可能性很大,而与药用野生稻和其他基因组野生稻发生基因漂移的可能性很小.     

利用SRAP标记研究海南野生稻的遗传多样性与遗传分化

利用8对多态性较好的SRAP引物对海南120份普通野生稻、55份疣粒野生稻和26份药用野生稻进行扩增,在检测到的219个位点中,普通野生稻的多态性位点率为74.89％,疣粒野生稻为42.47％,药用野生稻25.11%。香农指数以普通野生稻最高0.3277,疣粒野生稻为0.2044,药用野生稻最低0.1113。UPGMA聚类分析结果显示供试材料与地理来源相一致,相关性强,各居群个体间没有出现任何交叉。根据居群间的遗传分化系数,普通野生稻群体的基因多样性为0.2135,群体内的平均基因多样性大于居群间的基因漂变,说明普通野生稻居群遗传分化不显著,遗传多样性主要来自于居群内,基于群体杂合度和居群遗传多样性指数特点,认为实施保护策略时,优先保护遗传多样性最丰富的WDL和WDA居群。疣粒野生稻居群存在中等程度的遗传分化,建议原生境保护;药用野生稻居群数量较少,建议原生境保护。     

来自中国云南野生稻的抗稻瘟病遗传资源

与Pi-ta^＋等位基因相比,含有Pi-ta^＋等位基因的栽培稻具有抗稻瘟病特性。本研究用基因序列分析的方法检测了来自云南的不同栽培稻品种以及不同类型和来源的普通野生稻种和非洲长雄蕊野生稻种中的Pi-ta^＋基因,发现Pi-ta地基因在稻属植物中高度保守,但Pi-ta^＋等位基因的存在极其稀有。在所检测的栽培稻和野生稻中仅有来源于云南景洪的直立型普通野生稻中含有Pi-ta^＋等位基因。而与Pi-ta基因相比,另一个水稻抗稻瘟病基因Pib,经部分同源序列克隆及测序发现该基因在不同野生稻中的变异较大。在所克隆的不同野生稻Pib基因同源序列中,也只有来源于直立型普通野生稻的序列能按该基因的开放阅读框进行正常翻译。对不同类型普通野生稻的抗稻瘟病能力的初步鉴定结果表明,直立型普通野生稻对供试的本地稻瘟病生理小种具有较强抗性,其抗性可能源于所含的Pi=ta^＋等位基因及可能有功能的Pib基因。由于普通野生稻与栽培稻同属AA基因组型,因此,云南直立型普通野生稻可通过杂交育种或基因工程途径用于栽培稻的抗稻瘟病性能改良。     

橡胶树转录因子HbWRKY9的克隆与特性分析

通过RACE技术克隆得到一个新的橡胶树WRKY,命名为Hb WRKY9,Gen Bank登录号为JQ914653,基因全长为1 646 bp,ORF为954 bp,编码317个氨基酸。Hb WRKY9蛋白含有1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构,与蓖麻(Ricinus communis)、麻疯树(Jatropha carcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)和酿酒葡萄(Vitis vinifera)的WRKY成员一致性分别为80%、79%、70%和63%。对其启动子序列的分析表明,启动子核心区域位于翻译起始密码子上游74~123 bp处,启动子序列中包含TATA-box、CAAT-box、5'UTR Py-rich stretch、WRKY转录因子结合位点W-box、MYB结合位点MBS,以及与光响应相关的调控元件G-box和Box4,分生组织特异表达调控元件CCGTCC-box,与缺氧诱导相关的ARE元件,与高温胁迫相关的调控元件HSE,与Me JA和ABA等激素响应相关的CGTCA-motif和ABRE等顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,Hb WRKY9基因能响应低温胁迫,呈上调表达。