利用TALEN技术在牛胎儿成纤维细胞中敲除Myostatin基因

肌肉生长抑制素(Myostatin, MSTN)基因能够负向调节骨骼肌的生长和发育, 牛MSTN基因突变会出现“双肌”特征。文章利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向敲除牛胎儿成纤维细胞的MSTN基因, 获得敲除MSTN基因的细胞系, 为制备MSTN基因敲除牛提供材料。构建一对MSTN基因的TALENs真核表达载体, 分别采用PEI转染试剂和电穿孔法进行牛胎儿成纤维细胞的转染, 测序结果表明TALEN技术可用于敲除牛MSTN基因, 利用T7核酸内切酶1(T7E1)检测其突变效率, 结果显示电穿孔转染的敲除效率为20.4%。通过有限稀释法, 共获得10个MSTN基因敲除的细胞克隆(包括MSTN^-/-和MSTN^+/-), 其靶位点敲除的碱基数分别是1~20不等, 部分会出现移码突变。出现移码突变的细胞系可用于MSTN基因敲除的转基因肉牛的制备。     

基于CRISPR/Cas9系统对斑马鱼hoxb4基因的编辑及其突变体基因型的初筛

采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9构建hoxb4基因敲除斑马鱼模型,进行hoxb4基因功能的研究。根据hoxb4基因的一号外显子的正义链及反义链设计3个长20 bp的sg RNA,分别靶向ExonⅠ的192#位点,244#位点及313#位点。化学合成sg RNA的寡核苷酸序列,经过酶切克隆进p T7-g RNA质粒中,构建g RNA的体外转录载体并通过体外转录得到靶位点的g RNA。将质粒p SP6-2s NLS-sp Cas9线性化然后在体外转录得到Cas9的m RNA并进行加A尾,将以上靶位点的g RNA与Cas9的m RNA共注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,提取基因组DNA,PCR扩增出目的基因片段并使用T7EI酶切测效,最后将PCR产物连入p MD19-T simple载体中,挑取阳性克隆进行菌落PC R鉴定,然后经Sanger测序检测突变类型。结果显示,靶位点的sg RN A寡核苷酸双链成功连入p T7-g RNA质粒中且序列正确;其中靶向ExonⅠ的313#位点的sg RNA可成功编辑斑马鱼hoxb4基因,T7 EⅠ检测其敲除效率高达26.5%,并测序得到4种阳性突变型。通过CRISPR/Cas9系统成功编辑斑马鱼hoxb4基因并测序鉴定其突变类型,为HOXb4基因功能的研究提供了可靠的基因敲除方法。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Tiki1基因修饰猪模型

Tiki1基因是哈佛大学儿童医学院贺熹教授实验室发现的一个对蛙头部的诱导起到决定性作用的新基因,但Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失,因此无法利用小鼠等小动物来研究其在哺乳动物中的作用.本文利用CRISPR/Cas9系统结合体细胞克隆技术构建Tiki1基因修饰猪模型,研究Tiki1基因在猪发育中的作用.我们利用贺熹教授团队提供的人Tiki1基因序列,在猪的基因组数据库中比对出与其同源性最高的一段序列设计2个靶位点(g1和g2).以设计的靶位点构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了52个单细胞克隆株.最终选择靶位点g1为纯合双敲的5个单细胞克隆株和靶位点g2为纯合双敲的3个单细胞克隆株作为构建Tiki1基因敲除猪的核供体.我们共计构建了720个重组胚胎,分别植入3头代孕母猪,其中有1头经B超检测成功怀孕并妊娠到期产下13头发育正常的克隆猪,经测序鉴定其中12头为Tiki1基因双敲除猪模型,Tiki1基因敲除克隆猪健康存活至今.结果表明Tiki1基因对于猪早期发育的作用机理不同于蛙,其在猪早期发育的过程中的具体作用机理有待后续进一步的深入研究.     

衰老或肿瘤: 端粒酶和p53的相互作用

端粒酶和p53两者在肿瘤和衰老的发生发展过程中都起着关键的作用。在人类大多数的肿瘤中都发现了这一现象: p53基因发生突变和端粒酶的重新激活。端粒酶和p53基因的治疗逐渐成为肿瘤治疗的重要手段之一。文章论述了端粒酶或p53基因敲除的不同组合的小鼠模型(mTR-/-p53+/+; mTR-/-P53-/-)的衰老与肿瘤表型, 对端粒功能异常可抑制或促进肿瘤发生的辩证作用作一综述, 以期理解p53与端粒酶在衰老与肿瘤发生中的辩证相互作用, 寻求一种治疗肿瘤的新思路。     

利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系

蛋白激酶D1 (protein kinase D1, PKD1;也称作PRKD1)是蛋白激酶家族成员之一,该家族由3种结构相关的应激激活酶组成,可调节机体多种生物学功能,主要涉及细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节、心脏收缩、血管生成和癌症等,其中PRKD1与心脏肥大、收缩和缺血再灌注损伤的底物磷酸化有关。相关研究报道,先天性心脏病患者存在PRKD1基因突变,但其在心脏中的特异性功能和分子机制并未阐明。为了便于后期研究PRKD1基因在人类早期心脏发育的作用机制,本文拟利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系。首先,通过生物信息学网站筛选出两个最佳的基因敲除靶位点,合成相应靶位点的单链向导RNA (single guide RNA,sg RNA)和引物;然后,将两个靶位点的sg RNA进行体外转录,并将其与Cas9蛋白混合后共同注射到斑马鱼的1-细胞期;最后,对基因敲除后的F0、F1、F2及F3代斑马鱼的胚胎和成鱼进行有效性鉴定及表型观察。结果显示,靶位点附近出现了不同程度的碱基缺失;成功构建了F1代能够稳定遗传的prkd1基因敲除的3个亚系;与野生型相比, F3代纯合子...     

基于新的CRISPR/Cas9技术实现斑马鱼LHX9基因的快速编辑及对F0突变体性腺发育的初筛

目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。LHX9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且LHX9基因敲除的小鼠存在性腺发育不良。本研究拟通过一种新的CRISPR/Cas9基因编辑技术,采用四条sgRNA对LHX9基因进行VASA转基因斑马鱼的基因敲除,以观察该基因缺陷对斑马鱼性腺发育的影响。方法:利用新的CRISPR/Cas9技术,设计四条针对斑马鱼LHX9基因3号外显子的20bp的sgRNA,通过非克隆体外转录得到靶位点的四条sgRNA。将以上靶位点的四条sgRNA与Cas9核酸酶蛋白同时注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,利用PCR鉴定突变型类型和突变比例。通过对LHX9基因突变体的VASA转基因斑马鱼进行荧光观察,发现LHX9基因缺陷的斑马鱼性腺发育的情况。结果:靶向Exon 3的四条sgRNA可成功编辑斑马鱼LHX9基因,敲除效率高达82%,Sanger测序发现产生10种不同的移码突变类型。通过该方法对VASA转基因斑马鱼的LHX9基因进行编辑,发现LHX9基因突变导致dph6的的斑马鱼原始生殖细胞增殖和迁移受到影响。结论:基于4条sgRNA注射的CRISPR/Cas9技术,可以快速地产生具有突变表型的G0斑马鱼,具有应用潜力。LHX9基因敲除导致原始生殖细胞的发育和迁移受到影响,提示该基因参与了斑马鱼早期性腺的发育。     

斑马鱼gpr98基因敲除试验模型的构建

gpr98基因突变与多种疾病相关,该基因在人类和斑马鱼中高度保守。建立斑马鱼gpr98基因突变体稳定系,可为阐释gpr98基因功能提供良好的动物模型和研究基础。本文利用CRISPR/Cas9基因敲除技术在斑马鱼gpr98基因2号外显子上选取两个相距42bp的靶位点,分别体外合成sgRNA,并与Cas9 mRNA一起共注射至斑马鱼胚胎单细胞期的胚胎内。随机挑选发育72h胚胎提取基因组DNA进行PCR分析,结果表明:除了有野生型DNA带外,部分胚胎有一条比野生型DNA小的带;进一步将F0代阳性个体与野生型的斑马鱼杂交,对杂交后代进行基因型分析,并成功筛选到缺失48bp(Δ48bp)的稳定遗传突变的gpr98基因敲除斑马鱼模型。该试验模型的构建为研究gpr98基因在心血管以及骨骼等组织器官的发育及相关疾病发生中的作用奠定了重要基础。     

利用TALEN技术建立恒河猴TRIM5α基因突变细胞株

利用TALEN技术建立恒河猴TRIM5α基因突变细胞株,为进一步研究TRIM5α基因的功能奠定基础。构建针对TRIM5α打靶基因的TALEN,通过点突变的方法获得包含TRIM5α第7个外显子中打靶位点1 211-1 224的基因序列并构建点突变donor载体。将打靶TRIM5α基因的TALEN质粒和donor质粒电转入恒河猴肾细胞(LLC-MK2)中,无限稀释法获得单克隆细胞系,通过抽提基因组DNA,再利用PCR技术扩增目标序列并测序筛选出TRIM5α碱基缺失(1 215-1 216)和点突变(1 213-1 215,1 217)的细胞系。通过共转TALEN质粒和点突变的donor质粒筛选获得了TRIM5α基因敲除和TRIM5α基因点突变的LLC-MK2细胞系。     

Rett综合征相关基因MeCP2敲除大鼠模型的构建及分析

MeCP2(Methyl CpG binding protein 2)基因突变可导致Rett综合征(Rett syndrome, RTT)。目前已报道的MeCP2敲除小鼠表型与RTT病人症状存在显著差异。为探索MeCP2在脑发育中的作用及其导致RTT的机制,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了MeCP2基因敲除大鼠模型。通过构建靶向敲除MeCP2基因的载体,体外将Cas9 mRNA和sgRNA显微注射到SD大鼠受精卵中,在MeCP2基因exon2中造成移码突变,从而获得MeCP2基因敲除大鼠。利用测序和Western blotting方法鉴定MeCP2敲除大鼠,并对其表型和行为学特征进行分析,发现MeCP2敲除大鼠体重降低,存在焦虑倾向和认知缺陷。本研究成功构建了MeCP2基因敲除大鼠模型,其表型类似人类RTT患者的症状,为后续MeCP2功能研究提供了更好的动物模型。     

基于CRISPR/Cas9系统的人成神经瘤SK-N-SH细胞CAPNS1基因的靶向敲除

利用CRISPR/Cas9技术靶向构建CAPNS1基因敲除人成神经瘤细胞SK-N-SH细胞系。在NCBI数据库查找人CAPNS1基因,获得该基因CDS区,根据CRISPR/Cas9敲除靶位点设计原则即g RNA设计原则,设计3条sg RNAs,以p GK1.1为载体,构建人CAPNS1基因敲除载体,并运用共转染的方法转染到SK-N-SH细胞,构建CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系。结果发现,菌落PCR筛选均能扩增出100 bp大小的片段,单克隆为阳性,DNA测序显示sg RNA序列正确插入质粒,序列比对结果正确;质粒转染SK-N-SH细胞后,制备单克隆,CruiserTMEnzyme酶切后疑似为阳性克隆,进一步的单克隆测序结果显示CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功;此外,在CAPNS1-/-组,CAPNS1蛋白及calpain1和calpain2蛋白水平明显降低。以上结果表明CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功。     

骨形态发生蛋白9基因敲除小鼠的构建

目的运用CRISR/Cas9技术敲除小鼠基因组中Bmp9基因片段,构建Bmp9基因敲除小鼠。方法根据Bmp9基因的外显子序列,设计一段sgRNA并合成。sgRNA体外转录后和Cas9mRNA混合后显微注射受精卵细胞,注射后的受精卵细胞移植至受体动物获得子代小鼠。提取子代小鼠基因组DNA测序鉴定其基因型。基因型鉴定正确的小鼠与野生型交配后筛选纯合子小鼠。同时取纯合子小鼠心脏、肝、脾、肺、肾,匀浆后提取总RNA和总蛋白,通过qPCR、WB和免疫组化检测BMP9在各组织中的表达。结果设计并合成20bp的sgRNA并进行体外转录,显微注射并回植后得到基因突变小鼠,连续交配后得F2代纯合子。测序结果显示,突变小鼠存在两种基因型,一种为5bp缺失突变,另一种为13bp缺失并伴有1bp插入突变。与野生型C57BL/6相比,qPCR、WB和免疫组化结果均表明基因敲除小鼠肝中BMP9表达显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建出了BMP9基因敲除小鼠。     

乳腺特异性表达172^HIS突变型p53转基因鼠的建立

p53基因突变几乎存在于所有人类肿瘤中,尤其与严重危害妇女健康的恶性肿瘤－乳腺癌关系密切。研究表明：野生型p53基因是抑癌基因,而突变型p53基因则是癌基因－呈显性负调控突变型。本研究首次构建了这种类型的172^HIS突变型p53基因的转基因鼠,用以研究p53基因突变与乳腺癌发生的关系。用重组PCR法把小鼠p53基因的第172个密码子CGC突变成CAC（由编码精氨酸突变为编码组码组氨酸）信号序列之间。 获得置于pBL119（Fig.1)上的表达结构WAP－172^HISmtp53－SV40。经过BssHII酶切,纯化该表达结构部分,通过显微注射,将其分别导入FVB和C57BL品系小鼠受精卵中,获得32只F0代鼠。经PCR鉴定,其中9只为转基因阳性鼠（Fig.2)。对其进行的Southern分析（Fig.3)证实了PCR的鉴定,并得出了每只鼠中整合的转基因拷贝数（Table1)。当这9只鼠哺乳第二天时,取乳腺制备RNA,进行Northern杂交分析,其中5只的乳腺中有转基因表达,其中3只呈高水平表达（Fig.4),似乎转基因的拷贝数与其在乳腺中的表达水平并无直接关系,对表达水平最高的第8512号转基因鼠的免疫组化分析表明：172^HIS突变型p53基因的表达定位于乳腺上皮细胞的胞核及胞浆中（Fig.5AB)。该鼠地培养至11月龄第4次哺乳时右侧第3乳腺了典型的乳头腺癌。一周后增至体重的三分之一,其组织学检查见图5C,其它组织、除肺上皮细胞有原发性增生（Fig.5D）以外,均未见异常。上述转基因及其表达特性已稳定遗传至第八代,为乳腺癌发生的研究提供了一个稳定手乳腺特异性表达的显性负调控p53转基因鼠模型。基因表达研究中常用基因敲除实验来观察该基因正常表达时的作用。然而、p53基因敲除得的转基因鼠未见乳腺肿瘤发生,而无法利用。我们设想：高水平表达的突变型p53与代水平表达的野生型p53基因敲除的小环境。本实验敲除的小环境。本实验中仅一例p53基因突变的事实暗示：还可能存在有其它致癌因子共同参与乳腺癌的发生。可用其它（如：TGFα）乳腺特异性表达的转基因鼠与之交配来研究其它因素的协同作用。     

斑马鱼心脏发育候选基因Titin-Cap的CRISPR/Cas9打靶有效性分析

CRISPR/Cas9基因打靶技术是近几年发展起来的一种高效率的定向打靶技术,被认为是遗传领域的革命性技术。Titin-Cap基因是本实验室已初步鉴定的斑马鱼心脏发育候选基因,且国内外目前尚无斑马鱼Titin-Cap基因的敲除品系。为了研究Titin-Cap基因在心脏发育过程中的作用机制,我们利用CRISPR/Cas9基因打靶技术建立斑马鱼Titin-Cap基因的敲除品系。测序结果显示,注射了CRISPR/Cas9 gRNA的胚胎出现双峰,说明在打靶位点附近出现了碱基缺失或插入,证明我们设计的gRNA是有效的。对F0代突变体成鱼的筛选中,测序结果同样显示有阳性结果。这些结果说明用CRISPR/Cas9基因打靶技术成功敲除了斑马鱼Titin-Cap基因,获得了Titin-Cap基因敲除的嵌合体斑马鱼。     

《免疫学杂志》：科学家建立基因敲除免疫缺陷小猪模型

近期,中科院广州生物医药与健康研究院的科学家成功建立了基因敲除免疫缺陷小型猪模型。该成果日前在线发表在《免疫学杂志》上。 广州生物院赖良学团队利用TALEN技术在小型猪中敲除了RAG基因,获得了重症联合免疫缺陷小型猪模型,研究人员对猪的胎儿成纤维细胞进行转染后获得杂合和纯合的RAG1／2敲除的细胞克隆。细胞克隆用于体细胞核移植后获得27头克隆猪,其中有10头为RAG2单等位碱基缺失,9头为RAG1双等位碱基缺失,3头为RAG2双等住碱基缺失,这些碱基缺失都导致了外显予读码框移码。敲除猪表现出典型的重症联合免疫缺陷疾病特征,包括胸腺萎缩,脾脏发育不良,淋巴细胞减少等。     

应用CRISPR/Cas9技术制备Ace2基因敲除小鼠模型及基因型的鉴定

本研究旨在应用CRISPR/Cas9技术高效构建Ace2 (angiotensin-converting enzyme 2)基因敲除小鼠模型,并繁殖、鉴定及验证Ace2基因敲除小鼠。通过构建靶向敲除Ace2基因的载体,体外将Cas9 mRNA和向导RNA (guide RNA, gRNA)显微注射到小鼠受精卵中,通过PCR和TA克隆测序对小鼠Ace2基因的第3至18号外显子删除情况进行检测和鉴定,繁育Ace2基因敲除小鼠并利用qRT-PCR和Western blot方法验证获得的Ace2~(-/Y)小鼠主要脏器中Ace2 mRNA和蛋白表达情况。结果显示,顺利构建表达gRNA载体并体外转录,成功将有活性的gRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵,获得6只阳性F0代初建鼠,PCR和基因测序鉴定表明成功删除了小鼠Ace2基因的第3至18号外显子;F0代鼠与野生型鼠回交,得到3只阳性F1代鼠,再与野生型鼠相交配得到的后代为F2代,在F2代中选择Ace2~(-/+)雌性杂合子鼠与野生型鼠交配,获得F3代Ace2~(-/Y)雄性纯合子小鼠。qRTPCR和Western blot结果表明,F3代Ace2~(-/Y)小鼠肾脏和肺中未检测到Ace2 mRNA和蛋白表达。本方法通过CRISPR/Cas9技术成功制备了Ace2基因敲除小鼠模型,为进一步研究Ace2基因功能奠定了基础。     

敲除L-periaxin基因的大鼠RSC96细胞系的建立

轴周蛋白(Periaxin)是外周神经系统非致密性髓鞘中特异表达的蛋白,编码Periaxin的基因经由选择性剪接产生两种蛋白异构体L-periaxin和S-periaxin,对髓鞘形成的初始化有重要作用。至今在Periaxin基因上已发现有18种不同的位点突变导致外周脱髓鞘神经疾病腓骨肌萎缩症4F亚型(CMT4F)的发生。利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向基因敲除技术对大鼠RSC96细胞的periaxin基因进行敲除,根据TALENs设计原则,确定L-periaxin基因的敲除靶点在其编码NLS结构域部分,设计相应的TALEN左臂与右臂的识别序列,构建含上述识别序列的L-periaxin基因敲除载体TALEN-L和TALEN-R,并将其转入RSC96细胞,经嘌呤霉素药物筛选,获得L-periaxin基因敲除细胞株,经测序确认大鼠RSC96细胞中的基因组中L-periaxin基因区段已被敲除,成功构建了L-periaxin基因敲除细胞模型。计算L-periaxin基因敲除载体的突变率为21.6%。Western blotting实验证明,在RSC96细胞中只能检测到S-periaxin蛋白的表达。通过流式细胞术及MTT实验检测基因敲除细胞的细胞周期和生长速度,发现敲除L-periaxin基因的细胞生长速度缓慢,G1期细胞增多,S期细胞减少。     

Abhd2基因与肺气肿发病机制研究

目的:利用基因敲除技术构建的小鼠肺气肿模型研究Abhd2基因与肺气肿发病机制的相关性。方法:生后6月龄,12月龄的Abhd2基因敲除纯合子和野生型鼠各5只。断髓法处死小鼠,取全肺,提取肺总RNA,紫外线分光光度计测定肺总RNA纯度并计算其浓度。PCR扩增产物行1.5%的琼脂糖凝胶电泳,在紫外线凝胶扫描仪观察拍照,存入IDKadak成像分析系统,分别读取肺气肿的相关因子和相应β-actin光密度值。电泳带密度运用ImageJ软件通过光密度测定法定量分析,比值用于统计学分析。结果:12个月龄Abhd2基因敲除纯合子小鼠与野生型对照比肺组织中基质金属蛋白酶9、12、13、14、组织蛋白酶B、K、S的mRNA表达水平明显增高,金属蛋白酶组织抑制剂3mRNA表达水平明显下降,氧化剂与抗氧化剂的mRNA表达水平未见异常,Abhd2基因敲除纯合子小鼠与野生型对照小鼠比肺组织中白细胞介素-lβ、白细胞介素-6、白细胞介素-13和肿瘤坏死因子-α的mRNA表达明显增高。结论:Abhd2基因敲除小鼠通过肺组织中巨噬细胞浸润增多、致炎细胞因子表达过多、蛋白酶基因表达过强与抗蛋白酶抑制剂表达降低以及异常增多的细胞凋亡,自发形成了肺气肿,且渐进性进展,而且肺气肿发生、发展过程与人类是相似的;因此它们对于人类肺气肿遗传易感性及环境因子的研究具有重要价值。     

Abhd2基因与肺气肿发病机制研究

目的：利用基因敲除技术构建的小鼠肺气肿模型研究Abhd2基因与肺气肿发病机制的相关性。方法：生后6月龄,12月龄的Abhd2基因敲除纯合子和野生型鼠各5只。断髓法处死小鼠,取全肺,提取肺总RNA,紫外线分光光度计测定肺总RNA纯度并计算其浓度。PCR扩增产物行1．5％的琼脂糖凝胶电泳,在紫外线凝胶扫描仪观察拍照,存入IDKadak成像分析系统,分别读取肺气肿的相关因子和相应β-actin光密度值。电泳带密度运用ImageJ软件通过光密度测定法定量分析,比值用于统计学分析。结果：12个月龄Abhd2基因敲除纯合子小鼠与野生型对照比肺组织中基质金属蛋白酶9、12、13、14、组织蛋白酶B、K、S的mRNA表达水平明显增高,金属蛋白酶组织抑制剂3mRNA表达水平明显下降,氧化剂与抗氧化剂的mRNA表达水平未见异常,Abhd2基因敲除纯合子小鼠与野生型对照小鼠比肺组织中白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-13和肿瘤坏死因子-α的mRNA表达明显增高。结论：Ablad2基因敲除小鼠通过肺组织中巨噬细胞浸润增多、致炎细胞因子表达过多、蛋白酶基因表达过强与抗蛋白酶抑制剂表达降低以及异常增多的细胞凋亡,自发形成了肺气肿,且渐进性进展,而且肺气肿发生、发展过程与人类是相似的;因此它们对于人类肺气肿遗传易感性及环境因子的研究具有重要价值。