梨小食心虫几丁质合成酶1基因的克隆与表达分析

【目的】克隆梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)几丁质合成酶1基因,分析该基因的分子特征及时空表达模式,为探析其生理功能奠定基础。【方法】利用简并引物和RACE技术从梨小食心虫5龄幼虫和蛹中克隆几丁质合成酶1基因的全长c DNA序列,同时获得其两个可变剪切外显子序列,并用邻接法(neighbor-joining method)与其他昆虫同源序列构建系统进化树。利用RTq PCR技术研究该基因及两个可变剪切外显子在1日龄预蛹不同组织(头、体壁、脂肪体、中肠、气管和马氏管)中以及不同发育阶段(2-5龄幼虫、预蛹、蛹和成虫)的表达特性。【结果】克隆获得梨小食心虫几丁质合成酶1基因,将其命名为Gm CHS1,该基因编码1 565个氨基酸,包含了16个跨膜螺旋,两个可变剪切外显子包含177个碱基,编码59个氨基酸序列,分别命名为Gm CHS1a(Gen Bank登录号:MF000781)和Gm CHS1b(Gen Bank登录号:MF000782)。系统发育树同源分析结果表明,Gm CHS1属于几丁质合成酶1,Gm CHS1a和Gm CHS1b分别归属于可变剪切外显子CHS1a和CHS1b。组织表达模式表明,Gm CHS1基因在体壁中表达量最高,其次是在头和气管中,其余组织中表达量较低或不表达;发育表达模式表明,该基因在各个发育阶段均有表达,幼虫蜕皮期、预蛹-蛹和蛹-成虫转变过程中表达量上调。Gm CHS1a在体壁和头部的表达量高于Gm CHS1b,而在气管和脂肪体中的表达量略低于Gm CHS1b,两者在中肠和马氏管中表达量都很低。在梨小食心虫不同发育阶段,Gm CHS1a的表达趋势表现为在幼虫蜕皮和预蛹-蛹转变过程中高表达;Gm CHS1b在幼虫各个阶段表达量都较低,在预蛹-蛹和蛹-成虫转变过程中高表达。【结论】Gm CHS1a和Gm CHS1b属于昆虫几丁质合成酶1家族,其基因在梨小食心虫不同组织及发育阶段的表达量显著不同,推测其在梨小食心虫发育过程中发挥着不同的作用。本研究为进一步探索该基因在梨小食心虫体内的功能奠定了基础。     

甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A和B启动子的克隆

几丁质不仅是昆虫的表皮和围食膜的主要成分,也是一个非常关键的害虫控制靶标,主要通过几丁质合成酶（chitin synthase,CHS）基因合成。本文在克隆甜菜夜蛾Spodoptera exigua的两个几丁质合成酶基因（SeCHSA和SeCHSB）cDNA和基因组序列的基础上,从基因的5′末端设计特异性引物和构建特定的基因组文库, 采用PCR的方法获得了5′端侧翼序列。通过5′RACE的方法确定SeCHSA和SeCHSB基因的转录起始位点后,获到了启动子序列。这为研究昆虫几丁质合成和转录调控奠定了基础。     

褐飞虱表皮蛋白基因NlICP的克隆及功能研究

表皮蛋白与几丁质结合构成抵御外界不良环境的昆虫角质层, 在昆虫的生长发育及蜕皮硬化中具有重要的作用。为了探讨表皮蛋白基因在褐飞虱Nilaparvata lugens生长发育中的功能, 本研究根据褐飞虱转录组测序信息, 对其中1个预测为编码表皮蛋白的Unigene36450序列进行了克隆, 并应用荧光定量PCR和RNA干扰（RNAi）技术分别对该基因的表达规律和功能进行了研究。结果表明： 克隆的 Unigene36450全长cDNA开放阅读框长585 bp, 编码的蛋白含194个氨基酸, 具有典型的表皮蛋白R&R保守结构域, 命名为NlICP。转录水平的时序表达分析发现, NlICP仅在褐飞虱若虫期表达, 且在3龄若虫体内表达量最高, 提示该基因编码的蛋白属于幼虫表皮蛋白。RNA干扰结果显示, 取食dsNlICP的1龄末2龄初（孵化后第3 天）若虫在干扰6 d和8 d时, NlICP基因的表达量分别较取食dsGFP的对照组下降58.8%和45.6%, 差异极显著(P<0.01); 干扰后部分褐飞虱若虫因蜕皮不完全死亡, 干扰5 d的存活率较对照下降26.7%。本研究结果提示, NlICP与褐飞虱若虫的生长发育及蜕皮相关, 可以作为褐飞虱防治的潜在靶标基因。     

昆虫几丁质合成及其调控研究前沿

几丁质合成与降解是昆虫最重要的生理过程之一。本文根据国外和作者自己的研究,综述了昆虫几丁质合成及其调控研究进展。昆虫几丁质的生物合成通路始于海藻糖,终止于几丁质,其中共有8个酶参与。目前研究最多的为海藻糖酶和几丁质合成酶。昆虫存在2个海藻糖酶基因和2个几丁质合成酶基因。可溶性海藻糖酶基因对昆虫表皮的几丁质合成影响更大,而膜结合海藻糖酶基因则主要影响中肠的几丁质合成。几丁质合成酶A主要负责表皮和气管几丁质的合成,而几丁质合成酶B则负责中肠围食膜的几丁质合成。目前,昆虫几丁质合成的调控途径主要有两种:利用RNAi技术和几丁质合成抑制剂。     

白背飞虱海藻糖合成酶基因的表达特性及其在糖代谢调控中的作用

【目的】昆虫中海藻糖主要通过海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase, TPS)在脂肪体中合成,当昆虫受极端环境胁迫时TPS能够诱导海藻糖累积从而起到保护作用。本研究旨在分析白背飞虱Sogatella furcifera两个TPS基因的发育和组织表达模式及其对糖类物质代谢调控功能,探究TPS基因在白背飞虱生长发育中的具体作用。【方法】基于实验室前期获得的两个海藻糖合成酶基因SfTPS1和SfTPS2片段序列,在本实验中也进行了基因克隆和测序筛选,比对两者确定了白背飞虱两个TPS基因序列。并通过MEGA 7.0软件构建基于氨基酸序列的白背飞虱与其他昆虫TPS的系统发育树。利用qRT-PCR技术检测这两个基因在白背飞虱不同发育阶段(4龄第1天若虫至3日龄成虫)和成虫不同组织(头、足、翅、中肠、脂肪体、表皮和马氏管)中的表达情况。合成这两个基因的dsRNA,并注射到白背飞虱5龄第1天若虫中进行RNAi。在RNAi 48和72 h后检测白背飞虱海藻糖酶基因TRE1-1,TRE1-2和TRE2的表达变化,海藻糖、葡萄糖和总糖原含量以及海藻糖酶活性。【结果】克隆获得白背飞虱SfTPS1和SfTPS2,ORF分别为2 424和2 115 bp,编码氨基酸数目分别为807个和704个,预测蛋白质分子量分别为90.37和80.56 kD,等电点分别为6.08和6.10。而且白背飞虱2个TPS氨基酸序列与褐飞虱Nilaparvata lugens TPS1和TPS2的一致性最高。发育阶段表达模式表明,白背飞虱TPS基因SfTPS1和SfTPS2在4龄若虫到成虫阶段都有表达;组织表达模式表明,SfTPS1和SfTPS2在成虫马氏管、中肠和表皮中的表达较为显著。当SfTPS1被RNAi后,TRE1-1和TRE2的表达水平与对照组(dsGFP注射组)相比分别为略有上升和显著升高,TRE1-2的相对表达水平在SfTPS1被RNAi 48 h后显著上升而在72 h后显著下降;可溶性海藻糖酶活性无显著变化,膜结合型海藻糖酶活性显著增加;白背飞虱5龄若虫体内海藻糖、葡萄糖和总糖原含量显著上升。TRE1-2和TRE2基因的表达水平在SfTPS2被RNAi 48 h后显著升高,而在72 h后两基因的表达水平却显著下降;TRE1-1基因的表达水平在注射dsSfTPS2 48和72 h后均显著上升。可溶性海藻糖酶活性在SfTPS2被RNAi 48 h后显著下降,72 h后显著上升;膜结合型海藻糖酶活性在SfTPS2被RNAi 72 h后显著增加。白背飞虱5龄若虫体内葡萄糖含量在SfTPS2基因RNAi 48 h后显著减少,但在72 h后海藻糖、葡萄糖和总糖原含量显著上升。【结论】通过调节白背飞虱体内TPS基因的表达影响TRE1-1,TRE1-2及TRE2基因的表达水平,进而调控体内海藻糖的含量,该结果为后期采用TPS为靶标基因用于害虫防治提供理论依据。     

朱砂叶螨几丁质合成酶基因1全长cDNA的克隆与表达分析

【目的】克隆朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus几丁质合成过程中的关键酶几丁质合成酶基因,并检测该基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的相对表达量。【方法】本研究采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及c DNA末端快速扩增(RACE)技术首次克隆获得朱砂叶螨几丁质合成酶基因1的全长c DNA序列(命名为Tc CHS1,Gen Bank登录号为KM242062),并使用实时荧光定量PCR技术首次检测了Tc CHS1基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的相对表达量。【结果】朱砂叶螨Tc CHS1基因的c DNA全长为4 881 bp,包括198 bp的5'非翻译区(5'-UTR),4 425 bp的开放阅读框(ORF),258 bp的3'非翻译区(3'-UTR),开放阅读框编码1 474个氨基酸,预测其蛋白质分子质量约为168.35 ku,理论等电点为6.26。其包含EDR和QRRRW这2个几丁质合成酶基因的标签序列。氨基酸序列同源性分析结果表明:Tc CHS1与其他昆虫该基因编码蛋白的氨基酸序列相似度在50%左右,与二斑叶螨Tetranychus urticae的氨基酸相似度最高(98%),与西方盲走螨Metaseiulus occidentalis的相似度为55%。分子系统进化的结果也表明Tc CHS1与其他昆虫的CHS1聚在一起,并且和二斑叶螨具有最近的亲缘关系。荧光定量分析表明Tc CHS1基因在朱砂叶螨生长发育的不同阶段(卵、幼螨、第1若螨、第2若螨、雌成螨和雄成螨)均有表达,在卵和雌成螨中的表达量较高,在第2若螨的表达量最低。【结论】Tc CHS1基因可能在朱砂叶螨生长发育过程中具有重要作用。     

药用野生稻应答稻飞虱取食过程中基因表达的研究

褐飞虱和白背飞虱是水稻的刺吸式害虫。为了探讨水稻对虫害反应的分子机理,采用cDNA—AFLP(互补DNA扩增片段长度多态性)技术,研究了药用野生稻受这两种飞虱取食后基因表达的变化。通过调查约7％的虫．崮答后的药用野生稻转录本组,共分离了258个差异片段,测序112个;44个片段对应于已知或假定功能基因,其中35个基因的表达水平在白背飞虱为害后发生改变,24个基因在褐飞虱为害后改变。下调的基因比上调的基因多。有14个基因受这两种飞虱共同调节(2个上调,12个下调)。结果表明,药用野生稻对两种飞虱为害作出的反应有所不同。     

苗期水稻响应褐飞虱取食的基因差异表达分析

【目的】褐飞虱Nilaparvata lugens (St?l)是水稻的重要害虫之一,主要刺吸水稻韧皮部汁液为害,对水稻生产造成严重的产量和经济损失。为研究水稻响应褐飞虱取食的分子机制,对褐飞虱取食6 h后的苗期水稻进行转录组测序及基因差异表达分析。【方法】采用illumina二代测序技术获得褐飞虱取食前后水稻组织的转录组数据,利用RSEM软件进行基因表达定量和DEseq2进行差异表达分析;从差异表达基因中随机选取20个基因采用荧光定量PCR技术进行验证;采用GeneMerge软件对差异表达基因进行KEGG和GO富集分析。【结果】褐飞虱取食后,水稻转录组中的1 104个基因出现了差异表达,其中435个基因表达上调,669个基因表达下调。荧光定量PCR结果显示,20个差异表达基因中18个基因的表达变化趋势和测序结果一致,证明了转录组分析结果可靠。GO和KEGG富集分析表明,表达上调基因主要与水稻氧化应激、海藻糖合成及次生化合物代谢有关,显著富集在14个KEGG通路和30个GO功能分类中;而表达下调基因主要参与水稻纤维素、蛋白质及脂肪酸合成过程,显著富集在29个KEGG通路和26个GO功能分类。在差异表达基因中,分别有61个转录因子和13个水杨酸和茉莉酸信号通路相关基因。【结论】褐飞虱取食激发了水稻的应激反应和保护机制,同时还降低了营养合成的过程,是飞虱为害造成水稻减产的原因之一。本研究初步揭示了苗期水稻响应褐飞虱取食的差异表达基因,为研究水稻-褐飞虱互作机制以及褐飞虱抗性水稻品种培育提供了参考和依据。     

RNAi和取食不同品种水稻后白背飞虱多铜氧化酶4基因的表达差异及生物学效应

【目的】分析RNAi及取食不同品种水稻后白背飞虱Sogatella furcifera多铜氧化酶4(multicopper oxidase 4, MCO4)基因的表达差异和生物学效应,以期为该基因的功能研究提供理论依据。【方法】通过生物信息学技术方法分析白背飞虱MCO4基因的核苷酸和氨基酸序列;利用RNAi技术沉默白背飞虱3龄若虫的MCO4基因,检测显微注射法和饲喂法的沉默效率,研究该基因被干扰后对白背飞虱3龄若虫存活率的影响;白背飞虱成虫取食不同抗性水稻品种24 h后,采用RT-qPCR检测其体内MCO4基因表达量的变化,并统计其体重。【结果】白背飞虱MCO4基因的核苷酸序列全长为2 166 bp,编码721个氨基酸。显微注射法进行MCO4基因的RNAi可成功沉默白背飞虱的MCO4基因,且沉默效率远高于饲喂法。MCO4基因被RNAi沉默后白背飞虱3龄若虫存活率显著低于正常若虫的。与取食水稻感虫品种TN1相比,取食水稻抗虫品种IR26的成虫MCO4基因表达量显著增加,且成虫体重显著降低。【结论】显微注射法可以更好地干扰白背飞虱MC04基因的表达。沉默MCO4基因对白背飞虱3龄若虫的存活率有显著影响,我们推测MCO4基因在白背飞虱取食水稻中具有重要的作用。     

甜菜夜蛾几丁质合成酶基因的克隆与表达模式

几丁质合成酶(CHS)是昆虫几丁质生物合成过程中至关重要的酶。但是,迄今有关昆虫CHS的研究工作仍不多见。中山大学昆虫学研究所张文庆教授和他的研究生从鳞翅目昆虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua中克隆得到了A类CHS基因(SeCHSA),这是我国克隆获得的第1个昆虫CHS基因(DQ062153)。此     

褐飞虱蜕皮激素合成相关Halloween基因的克隆及功能分析

【目的】蜕皮激素(ecdysone)是调控昆虫生长发育和繁殖的重要激素,其合成主要由5个称为Halloween基因编码的细胞色素P450(spook/CYP307A1,Phantom/CYP306A1,disembodied/CYP302A1,shadow/CYP315A1和shade/CYP314A1)参与。褐飞虱Nilaparvata lugens系东南亚和东亚地区危害最为严重的水稻害虫之一,以蜕皮激素调控基因为靶标,应用RNAi技术防控褐飞虱正逐步成为研究热点。本研究旨在揭示褐飞虱体内Halloween基因的功能,为褐飞虱的防控和新农药的开发提供理论依据。【方法】本研究基于褐飞虱基因组和转录组数据,利用RT-PCR技术克隆了参与蜕皮激素合成的5个Halloween基因;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的结构特性;利用MEGA5.0邻接法构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR技术研究其时空表达特征;利用注射法RNAi技术分析Cyp314a1基因表达下调对褐飞虱生长发育和繁殖的影响。【结果】克隆获得褐飞虱的5个Halloween基因,即NlCyp307a1(Gen Bank登录号:KM217014.1),NlCyp306a1(Gen Bank登录号:KM217013.1),NlCyp302a1(Gen Bank登录号:KM216995.1),NlCyp315a1(Gen Bank登录号:KM216998.1)和NlCyp314a1(Gen Bank登录号:KU928172)。进化分析表明,这5个基因分属于CYP2和线粒体两大类群,并与各自的同源基因聚类在一起,说明Halloween基因和蜕皮激素合成途径在昆虫进化过程中十分保守。Nl CYP314A1具有5个P450的保守结构域和两个跨膜结构域,是典型的线粒体酶。qRT-PCR检测结果显示,5个Halloween基因的表达量在整个褐飞虱5龄若虫期内呈现波动状,且均在5龄若虫蜕皮后的24 h和60 h出现表达量峰值。NlCyp314a1在褐飞虱发育各个龄期均表达,且在成虫中表达量最高;NlCyp314a1在胸部表达量较头部和腹部高,其在脂肪体中的表达量最高,其次是在足、表皮、翅芽中,中肠中表达量最低。利用注射法RNAi对NlCyp314a1基因进行沉默后,NlCyp314a1的表达量在注射后第4天较对照极显著降低84.6%(P0.01),同时蜕皮激素通路下游的响应关键基因Nl FTZ-F1的表达量较对照极显著降低64.1%(P0.01)。表型观察发现,NlCyp314a1表达量的下调导致了褐飞虱蜕皮困难,出现畸形虫体,第7天死亡率大于95%,且NlCyp314a1表达量的下调导致了褐飞虱卵巢发育畸形。【结论】褐飞虱蜕皮激素合成相关的Halloween基因在进化上非常保守,Halloween基因功能的研究揭示了褐飞虱体内Halloween基因对于褐飞虱蜕皮和繁殖的重要性。其表达水平的降低导致了褐飞虱生长发育和繁殖受阻,提示褐飞虱Halloween基因可用于褐飞虱蜕皮和繁殖进程的调控,同样也为Halloween基因在褐飞虱防治方面的潜在应用提供了依据。     

褐飞虱Nl15基因的克隆及功能分析

【目的】植食性刺吸式口器昆虫的唾液蛋白参与调控植物抗虫防御反应,影响其对寄主植物的适应性。本研究旨在通过克隆褐飞虱Nilaparvata lugens重要唾液蛋白基因Nl15,调查其时空表达模式,明确其在褐飞虱致害性中的作用。【方法】基于褐飞虱IR56种群转录组数据,用RT-PCR克隆褐飞虱基因Nl15 cDNA序列,并进行生物信息学分析。利用qPCR检测其在褐飞虱TN1和IR56种群不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和雌雄成虫)和雌成虫不同组织(头、胸、腹和足)中的表达模式。通过显微注射dsRNA对褐飞虱TN1和IR56种群的4龄若虫进行Nl15的RNAi,利用qPCR检测Nl15 RNAi后褐飞虱若虫中Nl15的相对表达量以及Nl15 RNAi后褐飞虱若虫取食3 d时水稻植株中防御相关基因(OsLecRK4, OsMPK10, OsWRKY24, OsLox, OsNPR1和OsGns5)的相对表达量,并生物测定Nl15 RNAi后褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量。【结果】克隆了褐飞虱Nl15 cDNA序列(GenBank登录号：OK181113),其开放阅读框长1 008 bp;预测编码335个氨基酸,理论等电点为7.54,分子量为38.7 kD,含有23个氨基酸的信号肽序列和一个糖基化修饰位点,不存在跨膜结构域和其他已知的功能域;Nl15与灰飞虱Laodelphax striatellus同源蛋白氨基酸序列一致性为45%。发育表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱各个发育阶段均表达,在3-4龄若虫中的表达量最高;组织表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱雌成虫头部中的表达量最高,且在IR56种群头部中的表达量高于在TN1种群头部中的。RNAi实验结果表明,与注射dsGFP的对照组相比,注射dsNl15的处理组中Nl15的表达量显著降低了89.5%,褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量均显著降低,上述6个水稻防御相关基因的表达量显著上调。【结论】褐飞虱IR56种群中的Nl15参与褐飞虱与水稻的防御与反防御分子互作。本研究为进一步阐述褐飞虱克服抗虫基因的机制及揭示昆虫与植物互作的分子网络提供了思路。     

西方蜜蜂几丁质合成酶基因的生物信息学分析及功能研究

【目的】本研究旨在明确西方蜜蜂Apis mellifera几丁质合成酶(chitin synthase, CHS)基因的分子特性，并揭示CHS在西方蜜蜂工蜂幼虫响应蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis胁迫的免疫应答中的功能。【方法】利用相关生物信息学软件预测和分析西方蜜蜂CHS蛋白的分子特性、保守基序和结构域。使用MEGA X软件对西方蜜蜂和其他昆虫CHSs的氨基酸序列进行系统进化分析。采用体外转录法合成CHS和egfp的dsRNA,饲喂蜜蜂球囊菌胁迫的西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫以进行RNAi,并利用RT-qPCR检测西方蜜蜂工蜂5日龄幼虫肠道中CHS及宿主响应蜜蜂球囊菌侵染的免疫相关基因abaecin,apidaecin,birc5,defensin-1和PGRP-S2的表达量。【结果】西方蜜蜂CHS蛋白含有1 572个氨基酸，属于20种氨基酸，其中正电荷氨基酸与负电荷氨基酸分别为177和169个，分子量约为178.77 kD,等电点为6.65;含纤维素合酶CESA3催化结构域。在西方蜜蜂和东方蜜蜂A.cerana等共13种昆虫的CHSs中均鉴定到3个Motif (Motif 1,...     

昆虫几丁质酶基因家族功能研究进展

昆虫几丁质酶的研究历史很长,研究内容也非常广泛;但仅局限于传统的方法研究某个昆虫单个基因的功能及应用。近年来,随着生物信息学和RNAi技术在生命科学研究工作中的广泛应用,在昆虫几丁质酶的研究方面也取得了较大进展。本文主要以生物信息学在几丁质酶家族基因鉴定和分类研究过程中的应用,以及利用RNAi技术分析几丁质酶不同家族成员在赤拟谷盗和褐飞虱两种昆虫生长发育中的功能比较分析,对全面认识昆虫几丁质酶基因家族功能和作用机理,并利用几丁质酶基因防治害虫奠定良好的基础。     

人参查尔酮合成酶基因PgCHS1的克隆与表达分析

该文探究了人参查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)基因的表达模式与人参黄酮含量及抗胁迫之间的关系。作者从新鲜4年生人参根中提取总RNA,反转录合成cDNA,根据转录组测序结果,利用PCR扩增克隆人参CHS基因的cDNA全长,对其进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析人参根、茎、叶和胁迫条件下发根中CHS基因的表达水平,并测定其黄酮含量。克隆得到人参CHS,命名为PgCHS1,序列完整开放读码框(ORF)长度为1 182 bp,编码393个氨基酸。分析表明,该序列属于CHS家族基因,其具有查尔酮合成酶催化中心4个高度保守的残基Cys164、Phe215、His303、Asn336和形成活性中心构象所必需的13个关键残基Pro138、Gly163、Gly167、Leu214、Asp217、Gly262、Pro304、Gly305、Gly306、Gly335、Gly374、Pro375、Gly376。基因表达分析表明,Pg CHS1基因在叶片中的表达量最高,其次是茎、根和发根,并且受SA和MeJA的诱导。人参黄酮含量与基因表达水平高度一致。结果提示, PgCHS1基因参与人参黄酮的生物合成,从而保护人参免受外界的胁迫。     

显微注射构建烟粉虱的RNAi技术体系

RNAi已经成为揭示基因功能的一个常用的有力工具。在昆虫RNAi技术体系中,通过显微注射方法向昆虫体内注入dsRNA,实现系统性干扰,是最为广泛采用的方法。但对于体型较小的昆虫,注射法操作存在较大的难度,特别是非常微小的昆虫烟粉虱Bemisia tabaci。为了进行烟粉虱大规模基因功能验证,需要开发一套成熟的RNAi技术体系。本研究以烟粉虱的CYP6CM1基因为目标基因,通过显微注射法注射不同浓度的dsRNA到烟粉虱4龄若虫,荧光定量PCR检测其沉默效果。结果表明:在对单头烟粉虱注射50 n L时,注射不同浓度的dsRNA,对CYP6CM1基因的沉默效果不同,最大沉默效率可达到80%以上。因此,本实验成功构建了烟粉虱的RNAi技术体系,也可用于其它粉虱类害虫的RNAi技术。     

褐飞虱过氧化物酶基因NlPOD1的克隆、鉴定及功能分析

【目的】探明褐飞虱Nilaparvata lugens过氧化物酶基因NlPOD1的分子特性、表达模式和生物学功能。【方法】基于褐飞虱转录组数据,利用PCR技术克隆获得NlPOD1基因全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其序列特征;通过qRT-PCR技术检测NlPOD1在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(头部、脂肪体、血淋巴和肠道)中的表达水平,以及不同微生物(大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae)（1×10⁷/mL）注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式;利用RNAi技术沉默褐飞虱 5 龄若虫NlPOD1基因,并通过生物测定分析NlPOD1基因沉默和接种金龟子绿僵菌(1×108/mL)后褐飞虱的存活率及致死中时(LT₅₀)。【结果】获得褐飞虱NlPOD1全长 cDNA 序列(GenBank登录号: MZ682107),其开放阅读框长2 049 bp,编码682个氨基酸,含有一个典型的动物亚铁血红素过氧化物酶结构域(An_peroxidasedomain),且N端包含一段由29个氨基酸残基组成的信号肽。系统发育分析表明,NlPOD1与半翅目其他昆虫的POD亲缘关系较近,其中与茶翅蝽Halyomorpha halys POD亲缘关系最近。发育表达谱结果表明,NlPOD1在褐飞虱不同发育阶段均有表达,其中卵期表达量最低,5龄若虫中表达量最高;组织表达谱结果表明,NlPOD1在褐飞虱5龄若虫不同组织中均有表达,且肠道和血淋巴中的表达量显著高于头部和脂肪体中的;微生物诱导表达模式表明,与注射PBS的对照组相比,大肠杆菌诱导48 h内各时间点NlPOD1在褐飞虱5龄若虫中的表达量显著上调,而在金黄色葡萄球菌和金龟子绿僵菌诱导下,NlPOD1表达量均呈现先上调后回稳的态势。RNAi分析结果显示,显微注射dsNlPOD1可显著抑制NlPOD1的表达水平。通过RNAi抑制NlPOD1表达后褐飞虱5龄若虫存活率不变,但注射dsNlPOD1联合金龟子绿僵菌感染对褐飞虱5龄若虫的LT₅₀(4.5 d)显著低于注射dsGFP联合金龟子绿僵菌感染的对照组的LT₅₀(5.4 d),说明沉默NlPOD1后褐飞虱对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力显著降低。【结论】NlPOD1在褐飞虱病原防御过程中发挥重要作用,可作为开发RNAi和病原真菌联合介导的褐飞虱防治技术中的一个潜在靶标。     

褐飞虱基因BphMIF1克隆及表达分析

【目的】克隆水稻重要害虫褐飞虱Nilaparvatalugens唾液蛋白基因BphMIF1,探析BphMIF1在响应褐飞虱取食过程中的表达谱。【方法】采用RT-PCR法克隆了褐飞虱唾液蛋白基因BphMIF1,测序后对序列进行生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR(qPCR)对褐飞虱1-5龄若虫及成虫以及不同成虫虫体部位BphMIF1的表达量进行分析,同时对BphMIF1进行了原核表达分析。【结果】克隆得到BphMIF1基因,编码119个氨基酸。qPCR结果表明BphMIF1基因在若虫4龄期表达会迅速上调,在成虫的头、胸、腹均有表达,以腹部表达量最高。原核表达结果显示褐飞虱BphMIF1基因以0.5mmol?L-1的IPTG作为诱导浓度,诱导时间为4h表达效果较好。【结论】BphMIF1基因在褐飞虱成虫头、胸、腹部均有表达,在若虫不同发育历期其表达量有所差异且在4龄若虫时期表达量有显著上调。该结果可为BphMIF1在褐飞虱取食过程中的功能研究奠定基础。     

水稻虫害诱导相关基因实时定量PCR中内参基因的选择

实时定量PCR技术广泛应用于植物功能基因转录水平变化的研究, 选择合适的内参基因进行相对定量分析是实验结果准确的关键因素。通过分析5个常用的内参基因(eEF-1α、18S rRNA、25S rRNA、Actin和UBQ5)在水稻(Oryza sativa)经过各种处理后表达的稳定性, 结果表明, 水稻经过机械损伤处理后eEF-1α基因的表达最稳定; 二化螟处理后25S rRNA基因的表达最为稳定; 稻纵卷叶螟处理后Actin基因的表达最稳定; 两种刺吸式口器昆虫褐飞虱和白背飞虱危害后, UBQ5基因的表达最稳定。同时, 利用OsHI-LOX基因在不同处理后的表达来评价这些内参基因。研究结果为水稻虫害诱导实时定量PCR分析中内参基因的选择提供了理论依据。     

褐飞虱磷脂酰肌醇3激酶p85α亚基基因NlPIK3R1的克隆与功能分析

【目的】PI3K信号通路在生物体中发挥重要功能,涉及糖和脂质的代谢、细胞和组织生长以及生物个体寿命等。本研究旨在探明该通路中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在褐飞虱Nilaparvata lugens中的功能。【方法】根据转录组提供的PI3K p85α核心序列信息,应用c DNA末端快速克隆的技术(RACE)获得了编码PI3K p85α的基因Nl PIK3R1的全长c DNA(Gen Bank登录号为KP635379),并应用荧光定量PCR和通过给成虫喂食ds Nl PIK3R1对Nl PIK3R1进行RNA干扰(RNAi)分别对该基因的表达规律和功能进行了研究。【结果】荧光定量PCR测定结果表明,Nl PIK3R1在褐飞虱若虫和雄成虫中表达量均较低,但在怀卵雌成虫中大量表达。RNAi结果表明,给褐飞虱成虫喂食0.1和0.5μg/μL ds Nl PIK3R1均导致Nl PIK3R1的表达明显受到抑制,高浓度组的抑制效果尤为明显。喂食ds Nl PIK3R1对褐飞虱成虫具有极显著致死效果,高浓度组的褐飞虱成虫在饲喂第7天时存活率仅为37.5%,相比于空白对照组(87.00%)和ds GFP对照组(76.67%)均达到了极显著差异(P0.01)。对Nl PIK3R1的RNAi导致褐飞虱成虫羽化率下降和体重变轻。【结论】本研究结果显示,Nl PIK3R1基因对褐飞虱的生存、生长和发育具有重要作用,可以作为防治褐飞虱的潜在靶标。